GENETIC ENGINEERING (TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN/

KLONING GEN) SERTA PENERAPAN PADA BIDANG ILMU

MAKALAH
Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Bioteknologi
Yang dibina oleh Dr. Umie Lestari, M.Si dan Fauzi Akhbar Anugrah, M.Si

Disajikan pada Rabu, 10 Oktober 2018

Disusun oleh:

Kelompok 4 Offering B Tahun 2016

1. Aini Fathiyyatur Rohmah 160341606035

2. Firda Widianti 160341606030
3. Merinda Oktaviana 160341606002
4. Rosi Cahyaning Wulan 160341606081

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
Oktober 2018
 KATA PENGANTAR
Puji Syukur kehadirat Tuhan YME yang telah melimpahkan rahmat,
karunia, taufik dan hidayah-Nya sehingga kami dapat menyelesaikan makalah
yang berjudul “Genetic Engineering (Teknologi DNA Rekombinan/Kloning Gen)
serta Penerapan pada Bidang Ilmu”. Ucapan terima kasih juga kami sampaikan
kepada Dr. Umie Lestari, M.Si dan Fauzi Akhbar Anugrah, M.Si selaku dosen
pembina mata kuliah.
Kami sangat berharap semoga makalah ini bisa menambah wawasan
terutama tentang rekayasa genetika dan penerapannya. Kami juga menyadari
sepenuhnya bahwa di dalam makalah ini terdapat kekurangan dan jauh dari kata
sempurna. Oleh sebab itu, kami berharap adanya kritik, saran dan usulan demi
perbaikan makalah yang telah kami buat di masa yang akan datang, mengingat
tidak ada sesuatu yang sempurna tanpa saran yang membangun.
Semoga makalah ini bermanfaat dan bisa menjadi wawasan. Sebelumnya
kami mohon maaf apabila terdapat kesalahan kata yang kurang berkenan dan kami
memohon kritik dan saran yang membangun demi perbaikan di masa depan.

Malang, Oktober 2018

Penyusun

i
 DAFTAR ISI

halaman

KATA PENGANTAR .................................................................................... i

DAFTAR ISI ................................................................................................... ii

BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang .......................................................................................... 1
B. Rumusan Masalah ..................................................................................... 2
C. Tujuan Penulisan ....................................................................................... 2

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

A. Pengertian Rekayasa Genetika .................................................................. 3
B. Pengertian Teknologi DNA Rekombinan/Kloning Gen ........................... 4

BAB III PEMBAHASAN

A. Perangkat Teknologi DNA Rekombinan/Kloning Gen ............................ 5
B. Prinsip Dasar Teknologi DNA Rekombinan/Kloning Gen ...................... 11
C. Tahapan Teknologi DNA Rekombinan/Kloning Gen .............................. 15
D. Hasil Penerapan Teknologi DNA Rekombinan/Kloning Gen .................. 21
E. Dampak Teknologi DNA Rekombinan/Kloning Gen............................... 28

BAB IV PENUTUP
A. Simpulan ................................................................................................... 30
B. Saran ......................................................................................................... 30

DAFTAR RUJUKAN .................................................................................... 31

ii
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Perkembangan penelitian genetika molekuler terjadi sedemikian pesat. Jika
ilmu pengetahuan pada umumnya mengalami perkembangan dua kali lipat
(doubling time) dalam satu dasa warsa, maka hal pada genetika molekuler hanyalah
dua tahun. Bahkan, perkembangan yang lebih revolusioner dapat dilihat semenjak
tahun 1970-an, yaitu pada saat dikenalnya teknologi manipulasi molekul DNA atau
teknologi DNA rekombinan atau dengan istilah yang lebih populer disebut
Rekayasa Genetika.
Rekayasa genetika adalah kelanjutan dari pemuliaan secara tradisional.
Dalam arti paling luas, rekayasa genetika merupakan penerapan genetika untuk
kepentingan manusia akan tetapi masyarakat ilmiah sekarang lebih bersepakat
dengan batasan yang lebih sempit, yaitu penerapan teknik-teknik genetika
molekuler untuk mengubah susunan genetik dalam kromosom atau mengubah
sistem ekspresi genetik yang diarahkan pada kemanfaatan tertentu. Obyek rekayasa
genetika mencakup hampir semua golongan organisme, mulai dari virus, bakteri,
fungi, hewan tingkat rendah, hewan tingkat tinggi, hingga tumbuh-tumbuhan.
Bidang kedokteran dan farmasi paling banyak berinvestasi di bidang yang relatif
baru ini. Sementara itu bidang lain, seperti ilmu pangan, kedokteran hewan,
pertanian (termasuk peternakan dan perikanan), serta teknik lingkungan juga telah
melibatkan ilmu ini untuk mengembangkan bidang masing-masing.
Ada dua pendekatan utama yang banyak membantu terhadap pengembangan
rekayasa genetika ini. Yang pertama adalah isolasi enzim-enzim seluler dan
meneliti sifat-sifat yang dapat mempengaruhi struktur dan fungsi gen. Teknologi
DNA rekombinan ini memungkinkan diperolehnya suatu produk dengan sifat
tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar dari pada produksi secara
konvensional serta memadukan sifat dari dua jenis organisme yang berbeda
(organisme transgenik) dan lain-lain. Dalam pembahasan makalah ini akan dibahas
lebih dalam mengenai teknologi DNA rekombinan serta penerapannya.

1
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, permasalahan dapat dirumuskan sebagai
berikut:
1. Apa saja perangkat teknologi DNA rekombinan/kloning gen?
2. Bagaimana prinsip dasar teknologi DNA rekombinan/kloning gen?
3. Bagaimana tahapan teknologi DNA rekombinan/kloning gen?
4. Bagaimana hasil penerapan teknologi DNA rekombinan/kloning gen?
5. Bagaimana dampak teknologi DNA rekombinan/kloning gen?

C. Tujuan Penulisan
Berdasarkan rumusan masalah di atas, tujuan penulisan makalah sebagai
berikut:
1. Untuk mengetahui perangkat teknologi DNA rekombinan/kloning gen.
2. Untuk mengetahui prinsip dasar teknologi DNA rekombinan/kloning gen.
3. Untuk mengetahui tahapan teknologi DNA rekombinan/kloning gen.
4. Untuk mengetahui hasil penerapan teknologi DNA rekombinan/kloning gen.
5. Untuk mengetahui dampak teknologi DNA rekombinan/kloning gen.

2
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Pengertian Rekayasa Genetika

Rekayasa genetika (genetic engineering) mencakup pembahasan mengenai
pencangkokan gen atau rekombinan DNA. Penelitian tentang rekayasa genetika
telah dimulai pada awal 1950-an. Sebelumnya, rekayasa genetika dianggap
sebagai suatu impian saja. akan tetapi, kini kemampuan untuk mencangkokkan
bahan genetik dan membongkar kembali informasi keturunan memberikan hasil
nyata dan telah terbukti manfaat.
Rekayasa genetika dapat diartikan sebagai kegiatan manipulasi gen untuk
mendapatkan produk baru dengan cara membuat DNA rekombinan melalui
penyisipan gen. DNA rekombinan adalah DNA yang urutannya telah
direkombinasikan agar memiliki sifat-sifat atau fungsi yang kita inginkan
sehingga organisme penerimanya mengekspresikan sifat atau melakukan fungsi
yang kita inginkan. Obyek rekayasa genetika mencakup hampir semua golongan
organisme, mulai dari bakteri, fungi, hewan tingkat rendah, hewan tingkat tinggi,
hingga tumbuh-tumbuhan. Bahan genetik DNA mengandung informasi keturunan
yang dimiliki oleh makhluk hidup. Bahan genetik DNA berupa pita ganda yang
berbentuk spiral (double helix). Jika diumpamakan, salah satu pita ini menyerupai
sebuah pita kaset rekaman. Pita dapat dihapus untuk kemudian di ganti dengan
rekaman yang lain (Karmana, Oman. 2005).
Prinsip dasar teknologi rekayasa genetika adalah memanipulasi atau
melakukan perubahan susunan asam nukleat dari DNA (gen) atau menyelipkan
gen baru ke dalam struktur DNA organisme penerima. Prosedur DNA rekombinan
(penjalinan gen, gene splicing) adalah contoh rekayasa genetika yang paling
dikenal. DNA dari organisme asing, biasanya merupakan spesies yang benar-
benar berbeda, diintroduksi dan diintegrasi dengan genom organisme tertentu.
Genom hibrid yang baru pun diperoleh dengan karakteristik-karakteristik
organisme penyumbang DNA diekspresikan pada organisme penerima (Fried,
George H., dkk., 2006).

3
B. Pengertian Teknologi DNA Rekombinan/Kloning Gen
Teknologi DNA rekombinan adalah suatu teknik yang digunakan untuk
membuat molekul DNA rekombinan yang mengandung DNA dari dua spesies
yang berbeda. Teknologi DNA rekombinan telah memungkinkan untuk
mengisolasi DNA dari berbagai organisme, menggabungkan DNA yang berasal
dari organisme yang berbeda sehingga terbentuk DNA rekombinan, memasukkan
DNA rekombinan ke dalam sel organisme prokariot maupun eukariot sehingga
DNA rekombinan dapat bereplikasi dan bahkan dapat diekpresikan. Jadi,
teknologi DNA rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metode yang
digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi. Secara
umum, teknik tersebut meliputi:
1. Teknik untuk mengisolasi DNA
2. Teknik untuk memotong DNA
3. Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA
4. Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup
Teknologi DNA rekombinan berdasarkan pada mekanisme yang terdapat
pada bakteri. Hasil percobaan Ledenberg dan Tatum (1946) menunjukkan bahwa
bakteri mempunyai mekanisme seksual. Mekanisme seksual pada bakteri ini
menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yang berasal dari dua sel yang
berbeda. Mekanisme seksual pada bakteri ini tidak bersifat reproduktif (tidak
menghasilkan anak). DNA yang masuk ke dalam sel bakteri dapat berintegrasi
dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk kromosom rekombinan.
Teknologi DNA rekombinan ini telah memberikan banyak manfaat bagi
perkembangan ilmu pengetahuan maupun bagi kehidupan manusia sehari-hari.
Beberapa jenis obat-obatan, vaksin, bahan pangan, bahan pakaian dan lainnya
telah diproduksi dengan memanfaatkan teknologi DNA rekombinan.

4
 BAB III
PEMBAHASAN

A. Perangkat Teknologi DNA Rekombinan/Kloning Gen

Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah
perangkat-perangkat yang ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain adalah:
enzim restriksi, enzim DNA ligase, plasmid, transposon, pustaka genom, enzim
transkripsi balik, pelacak DNA/RNA.
1. Enzim restriksi
Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA. Pada tahun 1960, Werner
Arber & Hamilton Smith menemukan enzim dari mikroba yang dapat memotong
DNA utas ganda. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan nama enzim restriksi
atau endonuklease restriksi. Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA pada
sekuens spesifik yang panjangnya 4 sampai dengan 6 pasang basa. Enzim tersebut
sekarang dikenal dengan nama enzim restriksi atau enzim endonuklease restriksi.
Secara alami, bakteri menghasilkan enzim restriksi untuk menghancurkan DNA
fage yang menginfeksinya (yang masuk ke dalam sel bakteri).
Sampai saat ini sudah banyak jenis enzim restriksi yang telah ditemukan dan
diisolasi dari berbagai spesies bakteri. Nama setiap enzim restriksi diawali dengan
tiga huruf yang menyatakan nama bakteri yang menghasilkan enzim tersebut.
Setiap enzim restriksi mengenal sekuens dan situs pemotongan yang khas. Enzim
restriksi memotong DNA bukan pada sembarang tempat, tetapi memotong DNA
pada bagian tertentu. Bagian pada DNA yang dikenai aksi pemotongan oleh
enzim restriksi ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens pengenal adalah
urutan nukleotida (urutan basa) tertentu yang dikenal oleh enzim restriksi sebagai
tempat atau bagian yang akan dipotongnya.
Salah satu contoh enzim restriksi ini adalah enzim EcoRI yang telah
diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri
Escherichia coli. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya
adalah GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC). Di dalam
sekuens pengenal tersebut, enzim EcoRI memotongnya tidak pada sembarang
situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A. Pada DNA

5
utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama
tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda
tersebut pada bagian antara G dan A.
2. Enzim DNA ligase
Enzim ini digunakan untuk menyambung DNA. Pada tahun 1972, David
Jackson, Robert Simon, dan Paul Berg melaporkan bahwa mereka berhasil
membuat molekul DNA rekombinan. Mereka berhasil menggabungkan fragmen-
fragmen DNA dengan cara memasangkan (anneal) ujung sticky ends dari satu
fragmen dengan ujung sticky ends fragmen lainnya, kemudian menyambungkan
kedua ujung fragmen-fragmen tersebut secara kovalen dengan menggunakan
enzim DNA ligase. Keberhasilan membuat DNA rekombinan ini terjadi tidak
lama setelah enzim restriksi ditemukan dan diisolasi pertama kali dari E.coli oleh
Herbert Boyer yaitu pada tahun 1969.
3. Plasmid
Plasmid digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen atau
mengklonkan fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri. Pada umumnya bakteri
mempunyai satu kromosom. Kromosom bakteri berupa DNA sirkular atau DNA
yang berbentuk lingkaran. Disamping memiliki satu kromosom, berbagai jenis
bakteri juga memiliki DNA sirkular lainnya yang ukurannya jauh lebih kecil dari
pada DNA kromosomnya. DNA sirkuler selain kromosom yang terdapat pada
bakteri dinamakan plasmid. Jadi, plasmid merupakan DNA bakteri yang terpisah
dari kromosom bakteri. Plasmid dapat bereplikasi sendiri. Plasmid juga
mengandung berbagai gen. Jenis, jumlah jenis, dan jumlah tiap jenis (copy)
plasmid bervariasi antar sel. Bahkan antar sel dalam satu spesies bakteri.
Plasmid mulai digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen tidak lama
setelah David Jackson, Robert Simon, dan Paul Berg berhasil membuat molekul
DNA rekombinan itu pada tahun 1972. Dalam hal ini, plasmid digunakan sebagai
pembawa fragmen DNA asing. Dengan kata lain, plasmid dikombinasikan dengan
DNA asing. Plasmid rekombinan yang pertama kali berhasil bereplikasi di dalam
sel bakteri adalah plasmid pSC101 yang telah dikonstruksi oleh Stanley Cohen
dan Herbert Boyer (SC=Stanley Cohen).

6
 Salah satu contoh plasmid yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk
mengklon gen adalah plasmid pBR322. Plasmid pBR322 ini mengandung gen
penyandi resistensi terhadap ampisilin dan tetrasiklin. Pada gambar disamping
ditujukkan adanya berbagai situs yang dapat dipotong oleh enzim restriksi.
Adanya gen resistensi terhadap antibiotik yang didalamnya mengandung situs
enzim restriksi akan memberikan kemudahan dalam menyeleksi plamid
rekombinan atau memudahkan dalam menyeleksi klon bakteri yang telah
membawa plasmid rekombinan. Akan lebih memudahkan lagi dengan adanya
enzim yang hanya memotong pada bagian gen resistensi terhadap antibiotik.
Misalnya, enzim PstI yang hanya akan memotong pBR322 pada bagian gen
resistensi terhadap ampisilin (gen ApR).
4. Transposon
Transposon digunakan sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan untuk
menyisipkan penanda. Keberhasilan para ahli dalam melakukan rekayasa genetika
terhadap berbagai organisme tidak lepas dari peranan transposon. Transposon atau
elemen loncat mula-mula ditemukan oleh Barbara McClintock. Untuk sampai
pada penemuan tentang adanya transposon, Barbara McClintock mempelajari
penyebab terjadinya variasi warna biji jagung. Seperti yang pernah anda pelajari
sebelumnya bahwa biji jagung terbentuk sebagai hasil dari pembuahan ganda (dua
pembuahan). Satu pembuahan menghasilkan zigot yang kemudian berkembang
menjadi embrio yang tersimpan dalam biji jagung. Satu pembuahan lainnya
menghasilkan endosperma. Endosperma inilah yang kita lihat penampilannya
(yang nampak sebagai biji jagung). Endosperma ini merupakan bagian terbesar
dari biji dan merupakan bagian penyimpan makanan. Endosperma inilah yang kita
gunakan kandungan karbohidratnya untuk makanan kita maupun makanan ternak.
Oleh karena endosperma ini awalnya berasal dari satu sel (sel triploid yang
merupakan hasil peleburan antara satu initi sel sperma dengan dua inti sel kutub)
yang kemudian membelah secara mitosis. Oleh karena itu seharusnya endosperma
tersebut merupakan kumpulan sel yang sama sifatnya. Bila kumpulan sel
endosperma warnanya sama maka setiap titik pada permukaan setiap biji jagung
itu warnanya sama atau seragam. Bila berwarna putih, maka seluruh permukaan
biji jagung (endospermanya) berwarna putih. Atau bila kuning, maka seluruh

7
permukaan biji jagung (endospermanya) berwarna kuning. Oleh karena itu, anda
apat menemukan di pasar atau di penjual sayur keliling, jagung yang setiap bijinya
berwarna kuning atau putih.
Barbara McClintock mempelajari mengapa ada biji jagung yang warnanya
tidak seragam sehingga nampak kuning dengan bercak-bercak coklat. Pola
bercaknya tidak teratur. Biji yang satu dengan biji lainnya juga berbeda pola
bercaknya. Dengan melakukan persilangan-persilangan antar tanaman jagung
yang berbeda warna bijinya, akhirnya Barbara McClintock menemukan bahwa
ketidak-seragaman atau variasi warna biji jagung disebabkan oleh adanya bagian
dari kromosom yang berpindah-pindah. Bagian dari kromosom tersebut pindah
dari satu tempat ke tempat lain pada kromosom yang sama atau pindah dari satu
kromosom ke kromosom lainnya. Bagian dari kromosom yang dapat berpindah
tempat tersebut dinamakan transposon.
Jadi, transposon adalah DNA yang dengan sendirinya dapat berpindah-
pindah tempat atau berpindah posisinya. Transposon dapat berpindah-pindah
tempatnya pada satu molekul DNA atau pada satu krosom. Transposon juga dapat
pindah dari satu molekul DNA ke molekul DNA lainnya atau pindah dari satu
kromosom ke kromosom lainnya. Karena memiliki kemampuan untuk berpindah
tempat dengan sendirinya maka sering kali transposon disebut juga dengan nama
elemen loncat.
Transposon dapat ditemukan pada berbagai jenis tanaman, cendawan, dan
bakteri. Jenis transposon bermacam-macam berdasarkan ukuran atau panjangnya,
gen-gen yang dikandungnya, dan cara berpindahnya. Transposon yang paling
sederhana hanya mengandung gen penyandi enzim tranposom (transposase).
Enzim transposon ini dibutuhkan untuk melepaskan diri dari tempat semula dan
menyisip ke tempat lain. Transposon yang lebih kompleks dapat mengandung satu
atau beberapa gen tertentu misalnya gen-gen penyandi resistensi terhadap
antibiotik. Bila transposon menyisip pada suatu gen tertentu maka gen tertentu
tersebut akan terganggu fungsinya. Oleh karena itu, transposon sering digunakan
oleh para peneliti untuk melakukan mutagenesis (melakukan proses mutasi)
sehingga dihasilkan mutan. Misalnya, untuk mempelajari gen yang menyebabkan
warna hijau, seorang peneliti dapat menggunakan transposon untuk mendapatkan

8
mutan yang tidak berwarna hijau. Mutan menjadi tidak hijau karena gen penentu
warna hijau disisipi oleh transposon. Dengan melacak posisi dimana transposon
berada maka peneliti tersebut dapat mempelajari gen yang menentukan warna
hijau karena gen tersebut telah disisipi transposon (gen warna hijau bersatu
bersama transposon).
Transposon juga dapat digunakan untuk menandai suatu sel. Transposon
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik sering digunakan oleh para
peneliti sebagai penanda. Kita dapat menandai suatu strain bakteri dengan
menyisipkan gen resistensi terhadap suatu antibiotik. Untuk menyisipkan gen
resistensi terhadap antibiotik, kita dapat menggunakan transposon. Misalnya, kita
dapat menandai strain bakteri-B dengan menggunakan transposon Tn5-kanR
(transposon Tn5 yang mengandung gen kanR. Gen kanR menyandikan resistensi
terhadap antibiotik kanamisin). Kita dapat menggunakan Tn5-kanR untuk
menandai agar bakteri-B menjadi resisten terhadap kanamisin. Bila Tn5 masuk ke
dalam sel bakteri-B maka Tn5 beserta gen kanR yang dikandungnya akan
menyisip ke dalam DNA (kromosom) bakteri-B.
Dengan demikian bakteri-B yang semula tidak tahan terhadap kanamisin,
setelah disisipi Tn5 menjadi tahan terhadap kanamisin. Selanjutnya bila sel
bakteri-B yang sudah ditandai tersebut tercampur dengan sel bakteri lainnya,
maka kita masih dapat memilihnya atau menyeleksinya yaitu menggunakan media
yang mengandung kanamisin. Dalam hal ini, bakteri lain tidak tumbuh, sedangkan
bakteri-B (yang sudah ditandai) dapat tumbuh pada media dengan antibiotik
kanamisin tersebut. Transposon dapat digunakan untuk menandai sel, menandai
suatu gen, melacak keberadaan suatu gen, menemukan letak suatu gen di dalam
kromosom. Jadi, transposon merupakan salah satu perangkat penting di dalam
teknologi DNA rekombinan.
5. Pustaka Genom
Pustakan genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah
diklonkan. Salah satu cara yang digunakan untuk mempelajari genom suatu
organisme adalah dengan menggunakan pendekatan Shot-Gun. Dengan
pendekatan ini, DNA total dipotong menggunakan enzim restriksi. Oleh karena
jumlah potongannya sangat banyak maka sangatlah sulit untuk mempelajari

9
setiap potongan tersebut dalam waktu yang bersamaan. Oleh karena itu,
potongan-potongan tersebut perlu untuk disimpan lebih dulu sebelu mendapatkan
gilirannya untuk dipelajari. Untuk menyimpan potongan atau fragmen DNA
genom digunakan Pustaka Genom. Pustaka genom merupakan koleksi berbagai
klon bakteri yang berisi plasmid rekombinan maupun koleksi klon fage yang
mengandung DNA rekombinan. Di dalam pustaka genom ini, setiap plasmid
rekombinan atau setiap DNA fage rekombinan membawa salah satu potongan
atau fragmen DNA genom yang dipelajari. Setiap klon bakteri membawa satu
plasmid rekombinan sedangkan setiap klon fage membawa satu DNA fage
rekombinan. Kumpulan klon-klon bakteri yang membawa plasmid rekombinan ini
dinamakan Pustaka Plasmid, sedangkan kumpulan fage rekombinan dinamakan
Pustaka Fage. Jadi Pustaka Genom dapat berupa Pustaka Plasmid dan/atau
Pustaka Fage.
6. Enzim Traskripsi Balik
Enzim ini digunakan untuk membuat DNA berdasarkan RNA. Tidak lama
setelah penemuan enzim restriksi, Howard Temin dan David Baltimore secara
terpisah pada tahun 1970 menemukan enzim transkripsi-balik (reverse-
transcriptase) yang digunakan oleh retrovirus untuk membuat copy DNA
berdasarkan RNA-nya. Enzim transkripsi-balik ini kemudian digunakan untuk
mengkonstruksi copy DNA yang disebut cDNA (complementary DNA) dengan
menggunakan RNA sebagai cetakannya. Dengan demikian gen atau bagian dari
gen dapat disintesis berdasarkan mRNA. Proses sintesis DNA dengan cara ini
merupakan kebalikan dari pada proses transkripsi. Oleh karena itu dinamakan
transkripsi balik.
Saat ini, enzim transkriptase-balik sudah diproduksi secara komersial.
Ketersediaan enzim transkriptase-balik ini telah memberikan kemudahan bagi
para peneliti untuk mempelajari gen yang bertanggung-jawab terhadap sifat-sifat
tertentu. Tanpa enzim transkriptase-balik, pekerjaan mencari gen umumnya
dimulai dari mengisolasi DNA total genom, kemudian memotong- motongnya
menjadi ratusan ribu potongan yang kemudian diteruskan dengan mempelajari
setiap potongan. Cara ini tentu saja membutuhkan lebih banyak tenaga dan
memakan waktu yang lebih lama. Dengan ketersediaan enzim transkritase-balik,

10
pekerjaan mencari gen tidak lagi harus dimulai dengan mengisolasi DNA genom
total tetapi dimulai dengan mengisolasi mRNA. Tahapan utama dalam pembuatan
DNA menggunakan transkriptase balik ini adalah sebagai berikut:
a) DNA gen eukariot terdiri atas intron dan exon, pada wakttu transkripsi
semua bagian tersebut diterjemahkan oleh enzim transkriptase menjadi
RNA.
b) Dalam proses pasca-transkripsi, intron dibuang sehingga mRNA tidak lagi
mengandung intron.
c) Bila kita berhasil mengisolasi mRNA dari sel, maka kita dapat membuat
DNA gen yaitu dengan menambahkan enzim transkriptase-balik.
d) Enzim transkriptase-balik mensisntesis DNA dengan menggunakan mRNA
tersebut sebagai cetakannya. Hasilnya berupa DNA utas tunggal.
e) Setelah dihasilkan DNA utas tunggal, DNA polimerase akan mensintesis
utas DNA pasangannya sehingga dihasilkan gen yang berupa DNA utas
ganda. DNA gen hasil dari transkripsi balik ini tidak mengandung intron.
7. Pelacak DNA / RNA
Pelacak DNA/RNA digunakan untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA
yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar. Edwin M Southern,
pada tahun 1975, telah mempublikasikan prosedur untuk mendeteksi fragmen
DNA yang spesifik. Prosedur ini dikenal dengan nama teknik Southern Blotting.
Pelacak atau probe yang digunakan untuk mengidentifikasi fragmen DNA yang
spesifik tersebut merupakan asam nukleat pendek, berutas tunggal (RNA atau
DNA berutas tunggal) dan diberi label radioaktif atau non radioaktif.

B. Prinsip Dasar Teknologi DNA Rekombinan/Kloning Gen

Pemahaman mendasar mengenai prinsip yang ada pada teknik-teknik
rekayasa genetik penting untuk dimiliki oleh mereka yang terkait dalam bidang
tersebut. Prinsip dasar teknik-teknik tersebut meliputi prinsip yang berhubungan
dengan ekspresi gen, mulai dari transkripsi dari DNA sampai dengan modifikasi
protein. Selain itu, DNA rekombinan juga merupakan hal penting yang perlu
dipahami karena terkait dengan perpindahan materi genetik dan teknik kloning.

11
 Untuk menganalisa DNA, seseorang perlu memahami ciri-ciri DNA seperti
untai ganda, bermuatan negatif karena gugus fosfat, sensitif terhadap perubahan
pH dan banyak memiliki domain untuk ikatan dengan molekul lain (DNA, RNA
atau protein). Gen, yang merupakan unit pewaris sifat bagi organism, biasanya
dipindahkan dari satu individu ke individu lain melalui DNA rekombinasi yang
biasanya terjadi pada saat pembelahan sel pada siklus meiosis. Perpindahan materi
genetik ini biasanya memanfaatkan daerah yang homolog antar kromosom atau
pada kromosom yang sama. Mekanisme ini adalah untuk memastikan bahwa sifat
dari induk betina dan jantan tertransfer secara genetik. Kloning adalah pengkopian
(proses perbanyakan) secara genetik sehingga dihasilkan molekul-molekul yang
identik.
Teknik kloning memanfaatkan prinsip dari DNA rekombinasi dengan
menggunakan enzim-enzim yang bekerja saat itu. Enzim-enzim tersebut meliputi
enzim restriksi yang dapat memotong DNA, ligase yang menggabungkan DNA,
serta plasmid yang merupakan materi genetik untuk memperbanyak (mengklon)
fragmen DNA yang diinginkan. Untuk memperoleh materi genetik (DNA atau
RNA), dilakukan ekstraksi. Ekstraksi DNA dan RNA sedikit berbeda satu sama
lain. RNA sebagai molekul yang lebih tidak stabil dibandingkan DNA
memerlukan penanganan yang lebih. Peralatan yang digunakan harus bebas dari
RNAse. Sedangkan ekstraksi DNA dapat dibagi menjadi dua: ekstraksi DNA total
(genom) dan ekstraksi DNA plasmid. Ekstraksi DNA plasmid biasanya
menggunakan alkalin lisis dengan memanfaatkan karakter plasmid yang kecil
dibandingkan dengan kromosom. Dengan bantuan NaOH, SDS dan potasium
asetat, plasmid dapat terdenaturasi (menjadi untai tunggal) dan kembali pada
struktur alaminya, sedangkan kromosom yang sudah terdenaturasi akan sulit
untuk kembali beruntai ganda. Pengendapan nukleotida dapat dibantu oleh etanol
atau 2-propanol. Hasil dari ekstraksi nukleotida diverifikasi dengan beberapa cara
seperti melihat panjang gelombangnya, atau dengan elektroforesis agarosa yang
kemudian divisiualisasi dengan bahan seperti etidium bromida atau SYBR green.
RNA yang mudah terdegradasi memerlukan penanganan dengan alat dan bahan
yang bebas dari RNAse dan/atau mengandung RNAse inhibitor.

12
 Materi genetik untuk yang dimanfaatkan untuk kloning adalah fragmen
DNA, yang bisa juga merupakan gen itu sendiri. Kalau sumber materi adalah
RNA, maka dilakukan reverse transkripsi atau transkripsi balik dari RNA ke
DNA. Pembuatan cDNA dari mRNA dapat dilakukan dengan RT-PCR dengan
primer oligo dT yang memanfaatkan poli A dari mRNA. Plasmid yang sudah
dimodifikasi dengan penambahan fragmen DNA disebut plasmid rekombinan,
yang dapat diketahui melalui teknik skrining dan seleksi dengan bantuan marker.
Analisis transkrip atau RNA merupakan pengkajian terhadap ekspresi gen, karena
ekspresi gen ditunjukkan oleh terbentuknya RNA. Ekstraksi RNA harus
memperhatikan waktu setelah sampel diambil, karena ekspresi gen mengalami
perubahan yang sangat cepat. Sampel biasanya dimasukkan ke dalam nitrogen cair
untuk menghentikan perubahan ekspresi gen.
Beberapa metode yang memanfaatkan RNA antara lain microarray (pada
genom secara keseluruhan, pada gen-gen tertentu atau pada Single Nucleotide
Polymorphism). Selain DNA dan RNA, protein yang merupakan produk dari
translasi RNA adalah komponen penting dalam memahami kerja sel. Analisis
protein merupakan analisis struktur/ konformasi yang melihat interaksinya dengan
molekul lain. Protein memiliki daerah yang berperan dalam memberikan fungsi
dari protein tersebut yang disebut domain dan juga memiliki subunit yang bisa
bergabung untuk melakukan aktivitasnya. Deteksi protein dilakukukan dengan
menggunakan Western blotting, ELISA maupun immunostrip yang semuanya
memanfaatkan antibody yang dapat berinteraksi dengan protein yang diuji.
Analisis fungsi protein biasanya dilakukan dengan melihat perubahan
struktur protein dan membandingkan dengan hipotesa fungsinya. Karena fungsi
protein terkait dengan strukturnya. Untuk mengubah struktur protein, DNA yang
mengkode protein dimutasi pada daerah yang diduga paling berperan dalam
struktur protein tersebut. Analisis kemudian dilakukan dengan menggunakan
substrat dari protein dan juga bahan-bahan untuk mendeteksi fungsi protein
terhadap substrat (seperti bahan yang bermuatan radioaktif).
Teknologi DNA rekombinan berdasarkan pada mekanisme yang terdapat
pada bakteri. Hasil Percobaan Lederberg dan Tatum (1946) menunjukkan bahwa
bakteri mempunyai mekanisme seksual. Mekanisme seksual pada bakteri ini

13
menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yang berasal dari dua sel yang
berbeda. Mekanisme seksual pada bakteri ini merupakan pertukaran DNA atau
gen dari satu sel ke sel lainnya. Jadi mekanisme seksual pada bakteri ini tidak
bersifat reproduktif (tidak menghasilkan anak atau zuriat).
Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga
cara yaitu konjugasi, transformasi, dan transduksi. DNA yang masuk ke dalam sel
bakteri selanjutnya dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri
sehingga terbentuk kromosom rekombinan.
1. Konjugasi
Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam
sel bakteri lainnya (sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel. Sel donor
(sel jantan) memasukkan sebagian DNA-nya ke dalam sel resipien (sel betina).
Transfer DNA ini melalui pili seks yang dimiliki oleh sel jantan. Sel betina tidak
memiliki pili seks. DNA dari sel jantan berpindah ke dalam sel betina secara
replikatif. Oleh karena itu, setelah proses konjugasi selesai, sel jantan tidak
kehilangan DNA. Setelah konjugasi selesai kedua sel berpisah kembali dan
jumlah sel tidak bertambah (setelah konjugasi tidak dihasilkan anak sel). Oleh
karena itu, proses konjugasi ini disebut juga sebagai proses atau mekanisme
seksual yang tidak reproduktif.
2. Transformasi
Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di
sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa
potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri lainnya atau dari
organisme lainnya. Masuknya DNA dari lingkungan ke dalam sel bakteri ini dapat
terjadi secara alami. Fenomena transformasi ini telah diamati oleh Griffith (1928)
dan kelompok Avery (1944). Griffith (1928) telah menemukan bahwa strain
bakteri yang tidak virulen (strain yang penampilan koloninya kasar) dapat berubah
sifatnya menjadi strain yang virulen (penampilan koloninya halus). Perubahan
sifat ini disebabkan karena strain yang tidak virulen (strain kasar) dicampur
dengan sel-sel bakteri strain virulen (strain halus) yang telah dimatikan.
Avery, McCleod, dan McCarty (1944) menemukan bahwa perubahan sifat
atau transformasi dari bakteri kasar menjadi menjadi bakteri halus atau perubahan

14
dari tidak virulen menjadi virulen tersebut disebabkan oleh adanya DNA dari sel
bakteri halus yang masuk ke dalam sel bakteri kasar. Berdasarkan pada
mekanisme transformasi alami ini, kita dapat melakukan transformasi bakteri
secara buatan. Dengan perlakuan tertentu, kita dapat memasukkan potongan DNA
ke dalam sel bakteri. Prinsipnya sederhana yaitu mencampurkan sel-sel bakteri
hidup dengan potongan DNA tertentu di dalam tabung reaksi. Beberapa waktu
kemudian kita dapat menyeleksi sel- sel bakteri yang sudah mengandung
potongan DNA tertentu tersebut.
3. Transduksi
Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya
melalui perantaraan fage. Beberapa jenis virus berkembang biak di dalam sel
bakteri. Virus-virus yang inangnya adalah bakteri seringkali disebut bakteriofage
atau fage. Pada waktu fage menginfeksi bakteri, fage memasukkan DNA-nya ke
dalam bakteri. DNA fage ini kemudian bereplikasi di dalam sel bakteri atau
berintegrasi dengan kromosom bakteri (ingat siklus hidup fage: siklus litik dan
siklus lisogenik).
Pada waktu DNA fage dikemas di dalam pembungkusnya untuk membentuk
partikel fage-fage baru, DNA fage tersebut dapat membawa sebagian dari DNA
bakteri yang telah menjadi inangnya. Selanjutnya bila fage menginfeksi bakteri
lainnya, maka fage akan memasukkan DNA-nya yang mengandung sebagian dari
DNA bakteri inangnya yang sebelumnya. Dengan demikian, fage tidak hanya
memasukkan DNA-nya sendiri kedalam sel bakteri yang diserangnya tetapi juga
memasukkan DNA dari sel bakteri lainnya yang ikut terbawa pada DNA fage.
Jadi, secara alami fage memindahkan DNA dari satu sel bakteri ke sel bakteri
lainnya.

C. Tahapan Teknologi DNA Rekombinan/Kloning Gen

Teknologi DNA rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metoda yang
digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi. Teknik-
teknik tersebut meliputi:

15
1. Isolasi dan Purifikasi DNA
Molekul DNA yang sering digunakan dalam teknologi DNA rekombinan
adalah DNA plasmid dan DNA genom yang berasal dari sel bakteri. Pada dasarnya
isolasi DNA genom total dari sel bakteri terdiri dari beberapa tahap yaitu:
1) Kultivasi sel dalam media yang sesuai
2) Pemecahan dinding sel
3) Ekstraksi DNA
4) Purifikasi DNA
Pemecahan dinding sel bakteri dilakukan secara fisik misalnya dengan cara
sonikasi, maupun dengan cara kimia yaitu dengan menggunakan enzim lisozim,
etilen diamin tetra asetat (EDTA), atau kombinasi dari keduanya. Pada kondisi
tertentu pemecahan dinding sel cukup dilakukan dengan lisozim dan EDTA, akan
tetapi sering ditambahkan bahan lain yang dapat melisiskan dinding sel antara lain
deterjen triton X-100 atau sodium dedosil sulfat (SDS). Setelah sel mengalami
lisis, tahap selanjutnya adalah memisahkan debris sel dengan cara sentrifugasi.
Komponen sel yang tidak larut diendapkan dengan sentrifugasi sehingga
meninggalkan ekstrak sel dalam supernatan yang jernih. (Radji, M., 2011). Isolasi
dan purifikasi DNA plasmid dari sel bakteri pada dasarnya sama dengan cara
isolasi DNA genom. Cara pemisahan DNA plasmid dengan DNA genom pada
prinsipnya berdasarkan ukuran dan konformasinya.
Salah satu cara yang lazim digunakan untuk memisahkan DNA plasmid
dengan DNA genom adalah dengan menggunakan cara sentrifugasi gradient
densitas. Dengan teknik tersebut DNA plasmid akan membentuk pita pada titik
tertentu yang terpisah dengan pita genom, dimana protein akan mengapung pada
permukaan gradient, dan RNA akan berada pada dasar tabung. Posisi pita-pita
DNA dalam tabung bisa terlihat melalui pendaran etidium bromida yang disinari
dengan ultra violet. DNA plasmid dapat diambil dengan menusukkan jarum suntik
pada dinding tabung dimana pita DNA plasmid terlihat dan menyedotnya.
Sedangkan etidium bromida yang terikat pada DNA plasmid dapat diekstraksi
dengan n-butanol, dan CsCl dihilangkan dengan cara dialisis. Teknik pemisahan
ini dapat memperoleh DNA plasmid murni yang dapat digunakan sebagai vektor
cloning (Radji, M., 2011).

16
 Tahap akhir dari isolasi DNA adalah proses pemurnian DNA. Disamping
DNA, ekstrak sel mengandung protein dan RNA dalam jumlah yang cukup besar.
Umumnya cara pemurnian DNA dilakukan dengan penambahan larutan fenol atau
campuran fenol dan kloroform dengan perbandingan 1:1, untuk mengendapkan
protein dengan cara di sentrifugasikan dan dihancurkan secara enzimatis dengan
proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein masih tercampur dengan
RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA.
Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan cara
“presipitasi etanol”. Dengan adanya larutan garam (kation monovalen seperti
Na+), pada suhu -20oC etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik
sehingga mudah dipisahkan dengan cara sentrifugasi (Radji, M., 2011).
Pada isolasi dan purifikasi DNA sel total yang berasal dari sel eukariot,
misalnya sel tanaman atau sel hewan, walaupun pada dasarnya tahapan isolasi dan
purifikasinya sama, namun memerlukan suatu modifikasi cara isolasi sehubungan
dengan sifat-sifat khusus dari sel yang digunakan. Modifikasi yang sering
dilakukan adalah pada proses pemecahan sel eukariot. Senyawa kimia yang
digunakan untuk memecah sel bakteri tidak selalu dapat digunakan untuk
memecah sel tanaman maupun sel hewan. Untuk memecah sel tanaman
dibutuhkan ezim-enzim degeneratif yang spesifik dan sering dikombinasi dengan
cara pemecahan dinding sel secara fisik antara lain menggunakan butiran-butiran
gelas. Sedangkan untuk mengisolasi DNA total dari sel hewan yang tidak
memiliki dinding sel umumnya hanya digunakan deterjen untuk memecah
membran sel dan membran nukleusnya (Radji, M., 2011).
2. Teknik untuk Memotong DNA
Enzim endonuklease restriksi yang sangat selektif dalam memotong untai
DNA sangat bermanfaat bila diaplikasikan pada teknologi DNA rekombinan.
Setiap enzim mengalami rangkaian 4-8 pasang basa tertentu yang terdapat dalam
untai DNA. Bagian atas situs pada molekul DNA yang dikenali oleh enzim
endonuklease restriksi dikenal sebagai situs pemotongan enzim. Rangkaian-
rangkaian situs pemotongan DNA oleh enzim ini apabila terdapat dalam genom
bakteri itu sendiri, biasanya dilindungi dengan adanya gugus metil pada residu
basa adenine (A) dan sitosin (C), sehingga tidak dapat dipotong oleh enzim

17
endonuklease yang dihasilkan oleh bakteri sendiri. Setiap enzim endonuklease
restriksi memiliki situs pengenalan pemotongan yang berbeda dan sangat spesifik
(Radji, M., 2011).
Pada gambar dibawah dapat dilihat misalnya enzim restriksi EcoRI,
memotong molekul DNA pada urutan heksa-nukleotida 5’—GAATTC—3’ pada
posisi antara basa G dan A. demikian pula pada urutan polindromiknya 3’—
CTTAAG—5’ enzim EcoRI, juga memotong pada posisi antara basa A dan G.

Gambar 2.1
Situs pemutusan DNA oleh enzim restriksi endonuklease EcoRI

Enzim restriksi yang mempunyai sekuen pengenalan yang pendek akan

menghasilkan banyak potongan DNA; sedangkan jika mempunyai sekuen
pengenalan yang panjang, akan dihasilkan potongan DNA yang lebih sedikit. Baik
enzim yang mempunyai sekuen pemotongan pendek maupun panjang, mempunyai
fungsi masing-masing dalam rekayasa genetika (Old et al, 2003).
Enzim restriksi pada umumnya bekerja pada pH 7,4; suhu 37°C; dan
memerlukan bermacam-macam kekuatan ionik, tergantung dari jenis enzimnya.
Akan tetapi, beberapa enzim memerlukan optimasi khusus agar proses restriksi
berjalan dengan baik. Dalam larutan stok, enzim restriksi biasanya dikemas
bersama dengan 10X larutan penyangga reaksi yang telah dioptimasi (Walsh, G.,
2007).
3. Teknik untuk Menggabungkan atau Menyambungkan DNA
Tahap penyambungan DNA terdapat beberapa cara, yaitu penyambungan
dengan menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri, penyambungan dengan
menggunakan DNA ligase dari sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag

18
T4 atau sering disebut dengan enzim T4 ligase. Serta dengan pemberian enzim
deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’.
Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang
selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase.
4. Teknik untuk Memasukkan DNA Rekombinan ke Dalam Sel Hidup
Beberapa spesies bakteri yang sering digunakan dalam industry
bioteknologi antara lain adalah Bacillus subtilis, Eschericia coli, dan
Saccharomyces cerevisiae. (Radji, M., 2011). Proses transfer DNA rekombinan
kedalam sel hospes tergantung pada jenis vector yang digunakan. Beberapa cara
transfer DNA adalah:
1) Transformasi
Teknik ini digunakan apabila vektor yang dipakai adalah plasmid DNA.
Dapat ditransformasikan kedalam sel inag dengan cara:
a. Induksi kimia menggunakan perlakuan kejut panas kejut panas (heat shock)
dengan CaCl2 pada suhu 42oC dalam waktu 90 detik. Adanya ion Ca2+
dapat menyebabkan perubahan permeabilitas dinding sel bakteri sehingga
plasmid DNA rekombinan yang berada dalam biakan sel bakteri akan masuk
kedalam sel bakteri yang dinding selnya lebih permeable (Radji, M., 2011).
b. Elektroporasi Permeabilitas dinding sel bakteri dapat ditingkatkan dengan
cara menempatkan sel bakteri kedalam medan listrik yang kuat. DNA dan
sel bakteri dimasukkan bersama-sama dalam kuvet khusus yang kemudian
ditempatkan dibawah medan listrik (1,8 kv), dalam waktu yang sangat
singkat sekitar 4-5 detik. Dibawah medan listrik ini dinding sel bakteri
dipaksa terbuka dengan sendirinya, sehingga DNA dapat masuk kedalam sel
bakteri kedalam lubang yang terbentuk tersebut. Teknik ini dapat
menyebabkan sebagian besar sel bakteri mati, namun sel yang bertahan
hidup akan menerima DNA. Dewasa ini elektroporasi sering digunakan
untuk transfer DNA karena prosesnya lebih cepat (Radji, M., 2011).
c. Konjugasi Proses ini umumnya terjadi secara alamiah diantras sel bakteri
melalui pili bakteri. Pada transfer DNA melalui konjugasi diperlukan jenis
plasmid khusus yang disebut dengan plasmid konjugatif. Apabila sel bakteri
memiliki plasmid tersebut (sel donor) bertemu dengan bakteri yang tidak

19
 memiliki plasmid (sel penerima), maka akan terjadi agregasi sel dari
keduanya. Pada saat itu akan terjadi transfer plasmid dari sel donor ke dalam
sel penerima. (Radji, M., 2011) Manipulasi terhadap plasmid konjugatif
dapat dilakukan untuk membuat plasmid konjugatif membawa molekul
DNA rekombinan yang dikehendaki sehingga dapat ditransfer kepada sel
bakteri lain melalui kontak antar sel bakteri. Salah satu cara teknik
konjugasi khusus yang berhasil dilakukan adalahh teknik konjugasi
menggunakan bakteri Agrobacterium tumefaciens yang mengandung
plasmid konjugatif yang disebut dengan plasmid Ti (Tumor inducing)
(Radji, M., 2011).
2) Transfeksi
Transfer DNA melalui proses ini apabila vektor yang digunakan adalh virus
bakteriofag. DNA rekombinan yang akan ditransfer dikemas terlebih dahulu
dalam kapsid bakteriofag, kemudian diinfeksikan kedalam sel penerima. Proses
transfer DNA melalui transfeksi ini menyerupai proses infeksi oleh virus yang
terjadi secara alamiah. Replikasi dan propagasi akan meningkatkan jumlah DNA
rekombinan (Radji, M., 2011).
3) Mikroinjeksi
Teknik ini digunakan untuk mentransfer DNA secara langsung kedalam sel
menggunakan jarum suntik yang merukuran sangat kecil atau mikro. Umumnya
teknik ini digunakan untuk mentransfer DNA kedalam sel hewan atau sel
tanaman, karena sel tersebut berukuran relative lebih besar daripada sel bakteri.
DNA rekombinan yang akan ditransfer diinjeksikan lengsung kedalam nucleus sel
penerima (Radji, M., 2011).
4) Mikroprojektil
Teknik ini umumnya digunakan untuk mentransfer DNA kedalam sel atau
jaringan tanaman. Partikel DNA ditembakkan langsung dengan suatu alat
penembak khusus langsung kedalam sel tanaman. Dewasa ini terdapat berbagai
jenis alat penembak gen, salah satu jenisnya antara lain adalah pistol penembak
gen (Radji, M., 2011).

20
D. Hasil Penerapan Teknologi DNA Rekombinan/Kloning Gen
1. Tanaman Transgenik
Transgenik terdiri dari kata trans yang berarti pindah dan gen yang berarti
pembawa sifat. Jadi transgenik adalah memindahkan gen dari satu makhluk hidup
kemakhluk hidup lainnya, baik dari satu tanaman ketanaman lainnya, atau dari
gen hewan ke tanaman. Transgenik secara definisi adalah the use of gene
manipulation to permanently modify the cell or germ cells of organism
(penggunaan manipulasi gen untuk mengadakan perubahan yang tetap pada sel
makhluk hidup).
Tanaman transgenik pertama kalinya dibuat tahun 1973 oleh Herbert Boyer
dan Stanley Cohen. Pada tahun 1988 telah ada sekitar 23 tanaman transgenik,
pada tahun 1989 terdapat 30 tanaman, pada tahun 1990 lebih dari 40 tanaman.
Secara sederhana tanaman transgenik dibuat dengan cara mengambil gen-gen
tertentu yang baik pada makhluk hidup lain untuk disisipkan pada tanaman,
penyisipaan gen ini melalui suatu vektor (perantara) yang biasanya menggukan
bakteri Agrobacterium tumefeciens untuk tanaman dikotil atau partikel gen untuk
tanaman monokotil, lalu diinokulasikan pada tanaman target untuk menghasilkan
tanaman yang dikehendaki. Tujuan dari pengembangan tanaman transgenik ini
diantaranya adalah:
 Menghambat pelunakan buah (pada tomat)
 Tahan terhadap serangan insektisida, herbisida, virus
 Meningkatkan nilai gizi tanaman, dan
 Meningkatkan kemampuan tanaman untuk hidup pada lahan yang ekstrem
seperti lahan kering, lahan keasaman tinggi dan lahan dengan kadar garam
yang tinggi.
Melihat potensi manfaat yang disumbangkan, pendekatan bioteknologi
dipandang mampu menyelesaikan problematika pangan dunia terutama di negara-
negara yang sedang berkembang seperti yang sudah dilakukan di negara-negara
maju (Winarno dan Agustina,2007). Antara tahun 1996-2001 telah terjadi
peningkatan yang sangat dramatis dalam adopsi atau penanaman tanaman GMO
(Genetically Modified Organism) di seluruh dunia. Daerah penanaman global
tanaman transgenik meningkat dari sekitar 1,7 juta ha pada tahun 1996 menjadi

21
52,6 juta ha pada tahun 2001. Peningkatan luas tanam GMO tersebut
mengindikasikan semakin banyaknya petani yang menanam tanaman ini baik di
negara maju maupun di negara berkembang. Sebagian besar tanaman transgenik
ditanam di negara-negara maju. Amerika Serikat sampai sekarang merupakan
negara produsen terbesar di dunia. Pada tahun 2001, sebanyak 68% atau 35,7 juta
hektar tanaman transgenik ditanam di Amerika Serikat.
Sampai saat ini, kedelai merupakan produk GMO terbesar yaitu 33,3 juta ha
atau sekitar 63% dari seluruh tanaman GMO. Kedelai tahan herbisida banyak
ditanam di AS, Argentina, Kanada, Meksiko, Rumania dan Uruguay. Jagung
merupakan tanaman GMO terbesar kedua yang ditanam yaitu seluas 9,8 juta ha
sedangkan luas tanaman kapas GMO yang ditanam adalah sekitar 6,8 juta ha .
Sifat yang terdapat dari tanaman GMO pada umumnya adalah resisten terhadap
herbisida, pestisida, hama serangga dan penyakit serta untuk meningkatkan nilai
gizi.
a. Tanaman Transgenik Tahan Kekeringan
Tanaman tahan kekeringan memiliki akar yang sanggup menembus tanah
kering, kutikula yang tebal sehingga mengurangi kehilangan air dan kesanggupan
menyesuaikan diri dengan garam di dalam sel. Tanaman toleran terhadap
kekeringan ditransfer dari gen kapang yang mengeluarkan enzim trehalose.
Tembakau adalah salah satu tanaman yang dapat toleran terhadap suasana
kekeringan.
b. Tanaman Transgenik Resisten Hama
Bacillus thuringiensis menghasilkan protein toksin sewaktu terjadi sporulasi
atau saat bakteri memberntuk spora. Dalam bentuk spora, berat toksin mencapai
20% dari berat spora. Apabila larva serangga memakan spora, maka di dalam alat
pencernaan larva serangga tersebut, spora bakteri pecah dan mengeluarkan toksin.
Toksin yang masuk ke dalam membran sel alat pencernaan larva mengakibatkan
sistem pencernaan tidak berfungsi dengan baik dan pakan tidak dapat diserap
sehingga larva mati. Dengan membiakkan Bacillus thuringiensis kemudian
diekstrak dan dimurnikan, makan akan diperoleh insektisida biologis
(biopestisida) dalam bentuk kristal. Pada tahun 1985 dimulai rekayasa gen dari
Bacillus thuringiensis dengan kode gen Bt toksin (Winarno dan Agustina ,2007).

22
 Tanaman tembakau untuk pertama kali merupakan tanaman transgenik
pertama yang menggunakan gen Bt toksin. Jagung juga telah direkayasa dengan
menggunakan gen Bt toksin, tetapi diintegrasikan dengan plasmid bakteri
Salmonella parathypi yang menghasilkan gen yang menonaktifkan ampisilin.
Pada jagung juga direkayasa adanya resistensi herbisida dan resistensi insektisida
sehingga tanaman transgenik jagung memiliki berbagai jenis resistensi hama
tanaman. Gen Bt toksin juga direkayasa ke tanaman kapas, bahkan multiplegene
dapat direkayasa genetika pada tanaman transgenik. Toksin yang diproduksi
dengan tanaman transgenik menjadi nonaktif apabila terkena sinar matahahari,
khususnya sinar ultraviolet.
c. Tanaman Transgenik Resisten Penyakit
Perkembangan yang signifikan juga terjadi pada usaha untuk memproduksi
tanaman transgenik yang bebas dari serangan virus. Dengan memasukkan gen
penyandi tanaman terselubung (coat protein) Johnson grass mosaic poty virus
(JGMV) ke dalam suatu tanaman, diharapkan tanaman tersebut menjadi resisten
apabila diserang oleh virus yang bersangkutan. Potongan DNA dari JGMV,
misalnya dari protein terselubung dan protein nuclear inclusion body (Nib)
mampu diintegrasikan pada tanaman jagung dan diharapkan akan menghasilkan
tanaman transgenik yang bebas dari serangan virus. Virus JGMV menyerang
beberapa tanaman yang tergolong dalam famili Graminae seperti jagung dan
sorgum yang menimbulkan kerugian ekonomi yang cukup besar. Gejala yang
ditimbulkan dapat diamati pada daun berupa mosaik, nekrosa atau kombinasi
keduanya. Akibat serangan virus ini, kerugian para petani menjadi sangat tinggi
atau bahkan tidak panen sama sekali.
2. Contoh Tanaman yang Menggunakan Teknologi Rekayasa Genetika
Berikut ini disajikan berbagai tanaman hasil rekayasa genetika dan
keunggulannya dibandingkan dengan tanaman biasa yang sejenis.
a. Kedelai Transgenik
Kedelai merupakan produk Genetically Modified Organism terbesar yaitu
sekitar 33,3 juta ha atau sekitar 63% dari total produk GMO yang ada. Dengan
rekayasa genetika, dihasilkan tanaman transgenik yang tahan terhadap hama,
tahan terhadap herbisida dan memiliki kualitas hasil yang tinggi. Saat ini secara

23
global telah dikomersialkan dua jenis kedelai transgenik yaitu kedelai toleran
herbisida dan kedelai dengan kandungan asam lemak tinggi.
b. Jagung Transgenik
Komoditi jagung telah mengalami rekayasa genetika melalui teknologi
rDNA di Amerika Serikat, yaitu dengan memanfaatkan gen dari bakteri Bacillus
thuringiensis (Bt) untuk menghindarkan diri dari serangan hama serangga yang
disebut corn borer sehingga dapat meningkatkan hasil panen. Gen Bacillus
thuringiensis yang dipindahkan mampu memproduksi senyawa pestisida yang
membunuh larva corn borer tersebut.
Berdasarkan kajian tim CARE-LPPM IPB menunjukkan bahwa
pengembangan usaha tani jagung transgenik secara nasional memberikan
keuntungan ekonomi sekitar Rp. 6,8 triliun. Keuntungan itu berasal dari mulai
peningkatan produksi jagung, penghematan usaha tani hingga penghematan
devisa negara dengan berkurangnya ketergantungan akan impor jagung.
Dalam jangka pendek pengembangan jagung transgenik akan meningkatkan
produksi jagung nasional untuk pakan sebesar 145.170 ton dan konsumsi
langsung 225.550 ton. Sementara dalam jangka panjang, penurunan harga jagung
akan merangsang kenaikan permintaan jagung baik oleh industri pakan maupun
konsumsi langsung. Bukan hanya itu, dengan meningkatkan produksi jagung
Indonesia juga menekan impor jagung yang kini jumlahnya masih cukup besar.
Pada tahun 2006, impor jagung masih mencapai 1,76 juta ton. Secara tidak
langsung, penggunaan tanaman transgenik juga meningkatkan kesejahteraan
masyarakat.
c. Kapas Transgenik
Kapas hasil rekayasa genetika diperkenalkan tahun 1996 di Amerika
Serikat. Kapas yang telah mengalami rekayasa genetika dapat menurunkan jumlah
penggunaan insektisida. Diantara gen yang paling banyak digunakan adalah gen
cry (gen toksin) dari Bacillus thuringiensis, gen-gen dari bakteri untuk sifat
toleransi terhadap herbisida, gen yang menunda pemasakan buah. Bagi para
petani, keuntungan dengan menggunakan kapas transgenik adalah menekan
penggunaan pestisida atau membersihkan gulma tanaman dengan herbisida secara
efektif tanpa mematikan tanaman kapas.

24
 Serangga merupakan kendala utama pada produksi tanaman kapas. Di
samping dapat menurunkan produksi, serangan serangga hama dapat menurunkan
kualitas kapas.Saat ini lebih dari 50 persen areal pertanaman kapas di Amerika
merupakan kapas transgenik dan beberapa tahun ke depan seluruhnya sudah
merupakan tanaman kapas transgenik. Demikian juga dengan Cina dan India yang
merupakan produsen kapas terbesar di dunia setelah Amerika Serikat juga secara
intensif telah mengembangkan kapas transgenik.
d. Tomat Transgenik
Pada pertanian konvensional, tomat harus dipanen ketika masih hijau tapi
belum matang. Hal ini disebabkan akrena tomat cepat lunak setelah matang.
Dengan demikian, tomat memiliki umur simpan yang pendek, cepat busuk dan
penanganan yang sulit. Tomat pada umumnya mengalami hal tersebut karena
memiliki gen yang menyebabkan buah tomat mudah lembek. Hal ini disebabkan
oleh enzim poligalakturonase yang berfungsi mempercepat degradasi pektin.
Tomat transgenik memiliki suatu gen khusus yang disebut antisenescens
yang memperlambat proses pematangan (ripening) dengan cara memperlambat
sintesa enzim poligalakturonase sehungga menunda pelunakan tomat. Dengan
mengurangi produksi enzim poligalakturonase akan dapat diperbaiki sifat-sifat
pemrosesan tomat. Varietas baru tersebut dibiarkan matang di bagian batang
tanamannya untuk waktu yang lebih lama sebelum dipanen. Bila dibandingkan
dengan generasi tomat sebelumnya, tomat jenis baru telah mengalami perubahan
genetika, tahan terhadap penanganan dan ditransportasi lebih baik, dan
kemungkinan pecah atau rusak selama pemrosesan lebih sedikit.
e. Kentang Transgenik
Mulai pada tanggal 15 Mei 1995, pemerintah Amerika nebyetujui untuk
mengomersialkan kentang hasil rekayasas genetika yang disebut Monsanto
sebagai perusahaan penunjang dengan sebutan kentang “New Leaf”. Jenis kentang
hibrid tersebut mengandung materi genetic yang memnungkinkan kentang mampu
melindungi dirinya terhadap serangan Colorado potato beetle. Dengan demikian
tanaman tersebut dapat menghindarkan diri dari penggunaan pestisida kimia yang
digunakan pada kentang tersebut. Selain resisten terhadap serangan hama, kentang
transgenik ini juga memiliki komposisi zat gizi yang lebih baik bila dibandingkan

25
dengan kentang pada umumnya. Hama beetle Colorado merupakan suatu jenis
serangga yang paling destruktif untuk komoditi kentang di Amerika dan mampu
menghancurkan sampai 85% produksi tahunan kentang bila tidak ditanggulangi
dengan baik.
Daya perlindungan kentang transgenik tersebut berasal dari bakteri Bacillus
thuringiensis sehingga kentang transgenik ini disebut juga dengan kentang Bt.
Sehingga diharapkan melalui kentang transgenik ini akan membantu suplai
kentang yang berkesinambungan, sehat dan dalam jangkauan daya beli
masyarakat.
3. Contoh Tanaman Transgenik yang dikembangkan di Dunia

Jenis
Sifat yang telah dimodifikasi Modifikasi Foto
tanaman

Gen dari tumbuhan

Mengandung provitamin A narsis, jagung, dan
Padi (beta-karotena) dalam bakteri Erwinia
jumlah tinggi. disisipkan pada
kromosom padi.

Gen toksin Bt dari

Jagung, bakteri Bacillus
Tahan (resisten) terhadap
kapas, thuringiensis
hama.
kentang ditransfer ke dalam
tanaman.
Gen untuk mengatur
pertahanan pada
cuaca dingin dari
tanaman
Arabidopsis
Tembakau Tahan terhadap cuaca dingin.
thaliana atau dari
sianobakteri
(Anacyctis nidulans)
dimasukkan ke
tembakau.
Gen khusus yang
disebut antisenescens
Proses pelunakan tomat
ditransfer ke dalam
diperlambat sehingga tomat
Tomat tomat untuk
dapat disimpan lebih lama
menghambat enzim
dan tidak cepat busuk.
poligalakturonase
(enzim yang

26
 mempercepat
kerusakan dinding
sel tomat). Selain
menggunakan gen
dari bakteri E. coli,
tomat transgenik
juga dibuat dengan
memodifikasi gen
yang telah dimiliki
nya secara alami.
Gen resisten
herbisida dari bakteri
Mengandung asam oleat Agrobacterium
tinggi dan tahan terhadap galur CP4
herbisida glifosat.Dengan dimasukkan ke
Kedelai demikian, ketika disemprot kedelai dan juga
dengan herbisida tersebut, digunakan teknologi
hanya gulma di sekitar molekular untuk
kedelai yang akan mati. meningkatkan
pembentukan asam
oleat.
Gen dari selubung
virus tertentu
Tahan terhadap penyakit ditransfer ke dalam
Ubi jalar tanaman yang disebabkan ubi jalar dan
virus. dibantu dengan
teknologi peredaman
gen.
Menghasilkan minyak
Gen FatB dari
kanola yang mengandung
Umbellularia
asam laurat tinggi sehingga
californica
lebih menguntungkan untuk
ditransfer ke dalam
Kanola kesehatan dan secara
tanaman kanola
ekonomi.Selain itu, kanola
untuk meningkatkan
transgenik yang disisipi gen
kandungan asam
penyandi vitamin E juga telah
laurat.
ditemukan.
Gen yang
menyandikan
Resisten terhadap virus
selubung virus
Pepaya tertentu,contohnya Papaya
PRSV ditransfer ke
ringspot virus (PRSV).
dalam tanaman
pepaya.

27
 Gen baru dari
bakteriofag T3
diambil untuk
mengurangi
pembentukan
Melon Buah tidak cepat busuk.
hormon etilen
(hormon yang
berperan dalam
pematangan buah) di
melon.
Gen dari bakteri
Agrobacterium
galur CP4 dan
Tahan terhadap herbisida cendawan
Bit gula
glifosat dan glufosinat. Streptomyces
viridochromogenes
ditransfer ke dalam
tanaman bit gula.
Gen selubung virus
Resisten terhadap infeksi
Prem cacar prem
virus cacar prem (plum pox
(plum) Ditransfer ke
virus).
tanaman prem.
Gen penyandi
enzim kitinase
(pemecah dinding
Resisten terhadap peyakit
sel cendawan) dari
Gandum hawar yang disebabkan
jelai (barley)
cendawan Fusarium.
ditransfer ke tanaman
gandum.

E. Dampak Teknologi DNA Rekombinan/Kloning Gen

1) Dampak Positif
a. Peningkatan produksi pangan
b. Peningkatan kesehatan
c. Peningkatan cara pengolahan limbah
d. Penyedia bahan alternatif.

28
2) Dampak Negatif
a. Dibidang Etika/Moral
Ada masyarakat yang menganggap bahwa menyisipkan gen dari makhluk
hidup satu ke makhluk hidup lain bertentangan dengan nilai budaya dan
melanggar hukum alam.
b. Dibidang Sosial Ekonomi
Menimbulkan kesenjangan antara negara/perusahaan yang memanfaatkan
bioteknologi dengan yang belum memanfaatkan bioteknologi (Negara dunia ke
tiga).
c. Dampak Dibidang Kesehatan
Ada produk hasil rekayasa genetic yang disinyalir menimbulkan masalah
serius, misalnya kematian akibat penggunaan insulin, sapi penghasil susu yang
disuntik dengan Hormon BGH mengandung bahan kimia yang berbahaya, tomat
Flavr Savr diketahui membawa gen resisten terhadap antibiotik.
d. Dampak Terhadap Lingkungan
Pelepasan organisme transgenik ke alam dapat merusak keseimbangan alam
dan kelestarian organisme.

29
 BAB IV
PENUTUP

A. Simpulan
Berdasarkan pembahasan di atas, dapat disimpulkan bahwa:
1. Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah
perangkat-perangkat yang ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain
adalah: enzim restriksi, enzim DNA ligase, plasmid, transposon, pustaka
genom, enzim transkripsi balik, pelacak DNA/RNA.
2. Prinsip dasar teknologi DNA rekombinan meliputi prinsip yang
berhubungan dengan ekspresi gen, mulai dari transkripsi dari DNA sampai
dengan modifikasi protein. Selain itu, DNA rekombinan juga merupakan hal
penting yang perlu dipahami karena terkait dengan perpindahan materi
genetik dan teknik kloning.
3. Teknologi DNA rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metoda yang
digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi.
Teknik-teknik tersebut meliputi isolasi dan purifikasi DNA, teknik
memotong DNA, teknik menggabungkan atau menyambungkan DNA dan
teknik memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel hidup.
4. Salah satu hasil penerapan teknologi DNA rekombinan adalah tanaman
transgenik yang memiliki sifat resisten terhadap herbisida, pestisida, hama
serangga dan penyakit serta untuk meningkatkan nilai gizi. Contoh tanaman
transgenik antara lain kedelai, jagung, kapas, tembakau, tomat, kentang, dll.
5. Dampak teknologi DNA rekombinan mencakup dampak positif dan negatif.
Dampak positif antara lain peningkatan kesehatan dan penyedia bahan
alternatif. Dampak negatif antara lain menimbulkan kesenjangan sosial.

B. Saran
Adapun saran yang dapat disampaikan antara lain:
1. Mengkaji lebih lanjut mengenai rekayasa genetika.
2. Mengkaji lebih dalam mengenai penerapan rekayasa genetika (teknologi
DNA rekombinan/kloning gen) pada berbagai bidang ilmu.

30
 DAFTAR RUJUKAN

Alberts B, Bray D, Lewis J, Roberts K and Watson JD. 1989. Molecular Biology
of the Cell, 2nd Ed. Garland Press. New York.pp.1059-136.
Campbell, N.A., Reece, J.B., & Mitchell, L.G. (2002). Biologi. Jilid 1. Edisi
Kelima. Alih Bahasa: Wasmen. Jakarta: Penerbit Erlangga.
Fried, George H., dkk. 2006. Biologi Edisi Kedua. Jakarta: PT Gelora Aksara
Pratama.
Hardiato, toto. 2013. Prinsip Dasar Teknik-Teknik DNA Rekombinan, Analisis
Transkrip Dan Analisis Protein. Bogor: BB Biogen.
Karmana , Oman. 2005. Cerdas Belajar Biologi. Jakarta: Grafindo.
Old, R.W., dan Primrose, S.B. 2003. Prinsip-prinsip Manipulasi Gen; Pengantar
Rekayasa Genetika (penterjemah: Herawati Susilo). UI Press: Jakarta.
Radji, M. 2011. Rekayasa Genetika; Pengantar untuk Profesi Kesehatan. Sagung
Seto: Jakarta.
Sambrook, J & Russell. 2001. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. New
York. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Tjahjoleksono, Aris. (tanpa Tahun). Teknologi DNA Rekombinan. Bogor : Jurusan
Biologi FMIPA, Institut Pertanian Bogor Kampus IPB Baranangsiang, Jalan
Raya Pajajaran. Bogor
Walsh, G. 2007. Pharmaceutical Biotechnology; Concepts and Application.
Wiley: England.

31