ANALISIS DE ADN POR ELECTROFORESIS EN GEL DE

AGAROSA
I. INTRODUCCION
La extracción de ADN requiere hacer varias series de etapas básicas. En
primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana
plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. Después debe
romperse igual la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por último
hay que proteger el ADN de enzimas que puedan disminuirlo y para
aislarlo hay que hacer que se precipite en alcohol. El ADN es soluble en
agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en
la interface entre el alcohol y el agua. Además de permitirnos ver el ADN,
el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son
dejados en la solución acuosa. La sal evita la unión de las proteínas al
ADN.

La electroforesis se ha convertido en la técnica más utilizada para la

separación y caracterización de moléculas de ácidos nucleicos. Los
soportes mas utilizados en este procedimiento son la agarosa y la
poliacrilamida, dependiendo su elección del tamaño de las moléculas a
separar. Moléculas por debajo de los 500 pares de bases (pb) son
generalmente resueltas con mayor claridad en geles de poliacrilamida. En
agarosa pueden separarse moléculas DNA que va desde 100 pb hasya
miles de pb.

La agarosa es un polisacarido natural que se obtiene principalmente de

algas marinas. Es capas de formar geles con rigidez suficiente para ser
manipulados a partir del 0,2 %. La agarosa no polimeriza al gelificar si
no que simplemente sufre un cambio de estado. Para formar los geles, la
agarosa sólida es disuelta en tampón TAE 0,5X por calentamiento el
punto de fusión de la agarosa ordinaria esta alrededor de los 80°C; sin
embargo, la agarosa gelifica por debajo de unos 45°C.

La movilidad del DNA en los geles de agarosa puede considerarse

dependiente del efecto tamiz de las fibras del gel, ya que cada vez que
una molécula choca con una fibra del gel es retenida. El tamaño de la
malla depende de la concentración de la agarosa. En términos generales
puede decirse que a mayor concentración mayor resistencia al avance de
la muestra sin embargo la linealidad solo se mantiene en un margen
estrecho de concentraciones perdiéndose en valores extremos,
especialmente a concentraciones altas de agarosa.

La electroforesis en gel puede ser usada para determinar el tamaño

de las moléculas del DNA debido a la variabilidad de experimento a
experimento, es necesario introducir patrones de tamaño conocido en
cada gel que luego nos permitirá determinar el tamaño del DNA problema.

II. OBJETIVOS

- Preparar geles de agarosa

- Visualizar el DNA separado en gel de agarosa
- Analisis de ADN a través de electroforesis en gel de agarosa

III. REACTIVOS
 BUFFER TAE 50X
- 242 g de Trizma BAse
- 100 ml EDTA 0.5M, pH 8
- 57.2 ml Acido Acetico Glacial
- Volumen final 1000ml de agua destilada pH 8,4
Solución de trabajo

- Para gel = 1X
- Para electroforesis = 0.5X

 BUFFER SAMPLE
- Agua destilada + glicerol 30% + azul brillante de comassie 0,01%
- Mezclar un volumen de solución que contenga 1 g de DNA con
otro volumen igual de buffer sample

IV. PROCEDIMIENTO
DEGRADACION Y SINTESIS DE DNA

- Pesar 3 gramos de hígado de pollo

- Homogenizar en una licuadora con 16 ml de PBS y 4 ml de EDTA
0,1 M
- Una vez homogenizado se filtra 2 veces con gasa, para después
añadir 2 ml de SDS 10% al filtrado (10 ml)
- Llevar a baño maria por 10 min a 60°c
- Posteriormente se añade 6,3 ml de cloruro sódico 5M, y también
cloroformo alcoholisoamilico 24:1
- Llevar a centrifugadora por 5 min a 6000 rpm
- Con ayuda de una micropipeta extraer la fase acuosa donde se
encuentra el ADN y llevara aun vaso con 4 ml de etanol al 96 % frio
PREPARACION DE GELES DE AGAROSA AL 1.5%

- Pesar 750 mg de agarosa y disolverlos con 50 ml de buffer TAE 1X

en un erlenmeyer de 200 ml de capacidad, calentarlo hasta una
ebullición para lograr una disolución completa. Enfriar hasta
aproximadamente 45 °C, añadir 1 ul de Colorante fluorescente y
vaciar en un molde ya preparado (como se muestra en la figura 2)
y en posición horizontal. colocar luego una peineta para formar los
pocillos y dejar enfriar durante 30 minutos.
- Una vez frios, retirar el gel del molde y envolverlos en bolsas
plásticas con 2 ml de TAE1X para su conservacion, sellarlas y
guardar a 4 C. hasta su uso.

ANALISIS DE DNA POR ELECTROFORESIS EN GEL AGAROSA

- Colocar el gel dentro de la cubeta de electroforesis, y cubrir con

TAE- 1X
- Con mucho cuidado cargar en los pocillos 10 ul de las siguientes
soluciones:
o Pozo 1:
o Pozo 2:
o Pozo 3:
o Pozo 4:

- Conectar la cubeta a una fuente de poder y aplicar una potencia

de 100 V, dejar correr por un tiempo de 30 minutos.
- Terminada la electroforesis retirar el gel y observar en un cuarto
obscuro por transiluminación usando una lampara Ultra-violeta
 (se recomienda usar una lámpara con luz azul, Safe Imager™
Transilluminator, de Invitrogen)

Nota: no mirar directamente la luz UV, es mutageno, usar siempre lentes

para UV.

V. PROCEDIMIENTO DETALLADO

EXTRACCIÓN DE DNA

PREPARACION DE GELES DE AGAROSA AL 1.5%

ANALISIS DE DNA POR ELECTROFORESISI EN GEL AGAROSA

COMPONENTES DEL SISTEMA DE ELECTROFORESIS EN

FUNCIONAMINETO
Imagen1:

 cámara de electroforesis, con el gel de agarosa cubierto de Tae

1x.
 cable rojo: polo positivo.
 Cable negro: polo negativo.
Imagen 2:

 Adaptador de corriente.

VI. RESULTADOS

1. PEGUE UN FOTO EN DONDE SE OBSERVA LA IMAGEN DEL

GEL DE AGAROSA EN EL TRANSILUMINADOR. ROTULE LO
QUE SE OBSERVA EN EL GEL.

VII. ANEXOS

Medida de las concentración del ADN.

La concentración de ADN y ARN debe ser determinada midiendo la

absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotómetro. Para mayor
precisión, las lecturas de absorbancia a 260 nm debe estar entre 0,15 y
1,0.

ADN puro tiene una relación A260/A280 de 1,8-2,0 en Tris 10 mM • HCl,

pH 8,5.
Absorbancia a A280 elevada, resulta en una baja relación A260/A280.
indica la presencia de contaminantes, tales como proteínas.

Absorbancia fuerte a 270 nm y 275 nm puede indicar la presencia de

contaminación de fenol.

La absorbancia a 325 nm sugiere la contaminación por partículas en la

solución o cubetas sucias.

Conversiones espectrofotométricas de la absorbancia a 260 nm

A260 unit Concentration (µg/ml)*

dsDNA 50
ssDNA 33
Oligonucleotides 20–30