FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES

CARRERA DE INGENIERÍA AMBIENTAL

“RESPIRACIÓN CELULAR ALTERACIÓN POR METALES PESADOS”

Bilbao Soto Valeria, Lloclla Gamarra Claudia, Pampacata Sanchez Romina & Ramos Monzon Ana

Docente: Vélez Azañero Armando

2018
INTRODUCCIÓN

Todas las transformaciones de energía y los procesos químicos que ocurren dentro
de un organismo se conocen como metabolismo. La energía es necesaria para
realizar actividades metabólicas esenciales para el crecimiento, reparación y
mantenimiento (Alberts & Bray, 2006). Cada célula de un organismo requiere
nutrientes que contienen energía. Durante la respiración celular, las células captan
la energía liberada por las moléculas de nutrientes a través de una serie de
reacciones químicas cuidadosamente reguladas (Audesirk, et al, 2008). La célula
puede utilizar esta energía para hacer su trabajo, incluyendo la síntesis de
materiales necesarios para hacer una nueva célula . Prácticamente todas las células
realizan respiración celular (Campbell, 2001). La exposición a metales pesados es
uno de los factores que afectan este proceso indispensables para la vida, ya que los
grupos sulfhihidrilo de los sistemas enzimáticos que intervienen en el proceso
metabólico son receptores específicos para estos metales (Repetto, 1997). Estos se
unen a las enzimas y las desnaturalizan, evitando de esa manera que estas
cumplan con sus funciones (Solomon, 2013).

Entender los efectos de los metales pesados en la respiración celular permiten

conocer las enfermedades que estos producen, puesto que éstas reflejan con
frecuencia diferencias en absorción, distribución o metabolismo (Martínez, et
al,2012). Además, sus efectos sirven de indicadores de su presencia en suelo o
agua (Baird, 2001); ya que los organismos presentes en dichos medios manifiestan
cambios al entrar en contacto (Nava & Méndez, 2011). Conocer los efectos que
estos metales tienen sobre los organismos es indispensable para los ingenieros
ambientales, ya que suponen una herramienta de detección para aplicar un
adecuado control y manejo de los recursos y del medio (Cervantes,1999).

El objetivo del trabajo fue verificar la inhibición del ciclo de krebs por el plomo y
comprobar una reacción de Óxido-Reducción mediante el azul de metileno.
Materiales y Métodos

En el primer paso para este experimento, los tubos de ensayo y vasos fueron
etiquetados para asegurar la identificación precisa. Cinco tubos de ensayo se
marcaron # 1 a # 5; cinco pipetas se marcaron dependiendo de la solución.
Preparación del homogenizado de hígado al 10%
Se pesa una pequeña porción de hígado en una balanza de precisión. El valor
obtenido se multiplicó por 9, el producto es la cantidad de agua destilada que hay
que mezclar con el hígado, utilizando un mortero. Luego, esta mezcla se lleva a un
sistema de filtrado, donde el homogenizado se almaceno en un matraz E. de 100
ml.
Preparación de las baterías
Las baterías se llevaron a cabo en tubos de ensayo. Utilizando las pipetas se añadió
0.5 ml de succinato 0.4M a los tubos a excepción del tubo # 2. A continuación, 1 ml
de buffer fosfato a pH 7.4 y 0.5 ml de azul de metileno 0.1% a todos los tubos.
Al tubo # 1 se le agrega 8 ml de agua destilada completando 10 ml de solución,
convirtiéndola el tubo control. El tubo # 2 se le agregó 8 ml de agua destilada y 0.5
ml de homogenizado de hígado; tubo # 3, se le agregó 7.5ml de agua destilada y 0.5
ml de homogenizado de hígado; tubo # 4, se le agregó 7 ml de agua destilada y 0.5
ml de homogenizado de hígado, además, de 0.5 ml de acetato de plomo 10 M,
convirtiéndola en el tubo con inhibidor. Finalmente, al tubo 5, se le agregó 7.5 ml de
agua destilada y 0.5 ml de homogenizado de hígado.
Terminado los homogenizados, se agrego una capa de 0.5 cm de aceite vegetal en
todos los tubos excepto en el tubo # 5.

Determinación de la actividad en los tubos

Las pruebas colorimétricas de azul de Metileno indican la variación del potencial de
oxido-reducción en la leche por cambios en la tonalidad del colorante en solución,
dependiendo de la actividad reductora de las enzimas y de las sustancias
reductoras presentes en la solución (Jhon Jairo Zambrano y José Fernando Grass
Ramírez, 2008).
Resultados

La siguiente tabla muestra los resultados de las pruebas realizadas en 22 horas, el

tiempo de la reducción del Azul de Metileno en ciertas las soluciones.
Como se observa en la tabla, el tubo control no presentó coloración, este no
presento homogenizado, ni inhibidor.

Figura 1.Niveles de reducción de Azul de Metileno en función a la respiración celular en

diferentes tratamientos en el tiempo cero

Figura 2.Niveles de reducción de Azul de Metileno en función a la respiración celular en

diferentes tratamientos a las 18 horas

Figura 3. Niveles de reducción de Azul de Metileno en función a la respiración celular en

diferentes tratamientos a las 22 horas
Tabla 1. Resultados de la reducción de Azul de Metileno en función a la respiración celular
de tejido hepático

DISCUSIÓN

El Azul de Metileno es un indicador de una reacción Redox; se evidencia por

cambios en la tonalidad del colorante en solución (fig.3), dependiendo de la
actividad reductora y de las sustancias reductoras presentes en la solución(Jean F.
Macfaddin, 2003); lo que confirma nuestros resultados, tubo número 3 (fig.3), por el
homogenizado de hígado. Ahí, se encuentra el succinato deshidrogenasa que es un
agente reductor por eso el azul de metileno de su forma oxidada (azul) pasa a la
reducida (incolora) (Jhon Jairo Zambrano y José Fernando Grass Ramírez, 2008).

En el tubo 1 se observó que no hubo una decoloración, esto se debe a la ausencia

de succinato deshidrogenasa, el cual se encontraba en el homogenizado de pollo, y
al no haber succinato DH, el succinato no se oxida, por lo tanto, no se reduce el
FAD a FADH2 (Miguel Ordorica Vargas & María Velázquez, 2009). Y al no haber
una reducción del FAD, el azul de metileno no actúa como aceptor de electrones,
por lo cual no se reduce, entonces se queda de color azul. (Carlos Guevara, 2008)
En el tubo número 2 se observó una decoloración ligera, a pesar de que no se
agregó succinato, pero es probable que en el homogenizado de hígado quedará
succinato remanente (José Maraculla & Felix Goñi,1994). Al haber un poco de
succinato, el succinato deshidrogenasa actúa oxidando el succinato, y haciendo que
el FAD se oxide y el azul de metileno acepte electrones y se reduzca, lo que
provoca ligera decoloración. (Carlos Guevara, 2008)

Para el tubo número 4, observamos que la decoloración se dio con menor rapidez
en comparación al tubo número 3, esto puede deberse a la adición del Acetato de
plomo el cual actúa como inhibidor de la Succinato Deshidrogenasa (Rubio,
Riqueros, Gasco, Yucra, Miranda y Gonzales, 2006) el acetato de plomo retrasa la
catalización de la oxidación del succinato, de igual forma que la reducción del FAD
no se produce con rapidez, de modo que el azul de metileno como indicador demora
en evidenciar la reducción en la solución (Miguel Ordorica y María Velázquez,
2009)

El acetato de plomo actúa de dos formas bioquímicas, afectando la transducción de

señales de calcio e interactuando con proteínas uniéndose a los grupos sulfhidrilos,
fosfatos y carboxilos (Goering, 1993). La succinato deshidrogenasa se conforma por
FAD, un grupo hemo tipo b, además de tres núcleos con hierro y azufre (Miguel
Ordorica y María Velázquez, 2009); el acetato de plomo tiene la capacidad de
unirse a las proteínas generando problemas en su estructura y funcionamiento
adecuado, afectando principalmente a la síntesis del grupo hemo, lo cual
determinaría la inhibición de la enzima (Landrigan, Boffetta y Apostoli, 2000),

La capa de aceite en los tubos funciona como un aislante del medio que contiene
oxígeno (Jimenez, 2011) y tras el transcurso del tiempo hay descenso del O2,
creando una atmósfera anaeróbica rica en CO2 convirtiendo un ambiente
anaeróbico (Francisco T. Biaggi, Ramon T. Casanovas y Remigio Dargallo, 1929), lo
que concuerda con nuestro experimento, en los tubos 2,3 y 4, entonces evita que el
azul de metileno se oxida.

Sin embargo, en el tubo número 5, se observó la decoloración formándose a partir

de la parte inferior del tubo, esto sería generado por la ausencia del aceite, el cual
se utilizó como una sustancia aislante para evitar el contacto de la solución con el
oxígeno del ambiente, que al entrar en contacto con la enzima actúa como agente
oxidante (Tinsey, 1979). La parte superior de la solución que estuvo expuesta,
evidencio las reacciones de oxido-reducción, generadas respectivamente por el
oxígeno y la enzima deshidrogenasa (Nelson y Cox, 2013).

RECOMENDACIONES

Se recomienda rotular todas las pipetas y tubos de ensayos antes de utilizarlos, esto
evita que haya error en los resultados de las muestras y contaminación de reactivos
con otros reactivos o muestras.

Cuestionario

1. ¿Qué rutas metabólicas forman Acetil CoA? Explique

La glucosa que ingresa a la célula sufre un proceso de diez reacciones
denominado glucólisis, del cual se obtiene piruvato, este a su vez es
metabolizado por el complejo enzimático piruvato deshidrogenasa, que está
compuesto por tres enzimas diferentes, y es convertido en Acetil CoA (Perez,
2013).

2. ¿Cuál es la función del Malonato?

El malonato tiene una estructura similar al succinato, pero funciona como
inhibidor de la enzima succinato deshidrogenasa que actúa en la conversión
de succinato a fumarato en el ciclo del ácido cítrico (Voet & Voet, 2006;
Rojas, et al, 2010).

3. Explique químicamente el cambio de color del indicador azul de metileno

El azul de metileno oxidado es de color azul, pero reducido es incoloro; esta
propiedad hace que nos sirva de indicador dentro de la experiencia; ya que el
ciclo de Krebs dá como productos moléculas con poder reductor, que
reducirán el azul de metileno el cual perderá su color azul, si el ciclo se dá
con normalidad, sin embargo si es interrumpido el azul de metileno no se
reducirá porque el ciclo no producirá las moléculas reductoras (ACS, 2007).
 4. ¿Qué contiene el homogenizado de hígado?
el hígado está involucrado en la degradación de metabolitos, por ello sugiere
una presencia enorme de enzimas (Donald Voet y Judith Voet, 2006)
5. ¿Cómo actúa el aceite en la experiencia realizada?
El aceite funciona como un aislante del medio que contiene oxígeno, el cual
oxidará el azul de metileno devolviendo su color azul después de que haya
sido reducido (Jiménez, 2001).

Bibliografía

American Chemical Society (ACS).(2007). Química: un proyecto de la Amerinan

Chemical Society. Reverte, España.

Audesirk, T; Audesirk, G & Byers, B. (2008). Biología: La vida en la

Tierra. Pearson Educación, México. 132-140 pp.

Biaggi, F.T., Casanovas, R.T.y Dargallo, R.(1929) Revista española de medicina y

cirugía. Michigan: Universidad de Michigan

Macfaddin, J. F. (2003) Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de

Importancia Clínica. 3ª Ed. Argentina Editorial Médica Panamericana, S. A

Martínez, K, Souza, V; Bucio, L; Gómez, L & Gutiérrez, M.(2012). Cadmio: efectos

sobre la salud. Respuesta celular y molecular. Universidad Autónoma de México,
México.

Nava, C & Méndez, M.(2012). Efectos neurotóxicos de metales pesados (cadmio,

plomo, arsénico y talio). Arch Neurocien, México.

Repetto, M.(1997). Toxicología Fundamental. Ediciones Diaz de Santos,

España.154-156 pp.

Goering Pl. (1993). Neurotoxicology: Lead protein interactions as a basis for lead
toxicity. pp. 45-60.
Landrigan P., Boffetta P. y Apostoli P. (2000). La toxicidad reproductiva y la
carcinogenicidad del plomo: una revisión crítica. pp. 231-243.

Rojas, M; Garzón, R & Del Riesgo, L.(2010).Estructura y función de biomoléculas.

Universidad del Rosario, Colombia.

Rubio J., Riqueros M., Gasco M., Yucra S., Miranda S. y Gonzales G. (2006).
Lepidium meyenii (Maca) reversed the lead acetate induced-damage reproductive
function in male rats. pp. 22-44.

Perez, J.(2013). Manual de patología general. Masson, Elsevier Health Sciences.

Ordorica M. y Velázquez M. (2009). Ciclo del ácido Cítrico. pp 7-8.

Solomon, M. (2013). Biología. Cengage Learning Editores S.A, México. 154-172 pp.

Zambrano, J. y Grass, J. (2008) "Valoración de la calidad higiénica de la leche cruda

en la asociación de productores de leche de Sotará – asproleso, mediante las
pruebas indirectas de resazurina y azul de metileno", Biotecnología en el Sector
Agropecuario y Agroindustrial, 6(2),56-66 pp.

Alberts, B & Bray, D.(2006). Introducción a la biología celular. Médica

Panamericana.

Campbell, N.(2001). Biología: conceptos y relaciones. Pearson Educación.

Cervantes, C.(1999). Contaminación ambiental por metales pesados: Impacto en los

seres vivos. Instituto Nacional de Cardiología, Departamento de Bioquímica.

Baird, C.(2001). Química Ambiental. Reverte.

Voet, D & Voet, J.(2006). Bioquímica. Médica Panamericana, España. 499 p.

Tinsey I. (1979). Conceptos químicos en el comportamiento de los contaminantes.
Ed. Wiley Interscience, Canadá.

Ordorica, M. Velazquez, M. (2009) Ciclo de ácido cítrico.

Maraculla, J. & Goño, F. (1994) Bioquímica humanal: curso básico. Volume 5 of

Serie Reverté ciencia y sociedad, pp.218

Guevara, C. (2008) Determinación de la actividad de la enzima succinato

deshidrogenasa.

Voet D. y Voet J. (2006). Bioquímica. p. 638.

Jimenez, B.(2001). La contaminación Ambiental en México. Editorial Limusa,

México. 136 p.

Macfaddin, J. F. pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de

Importancia Clínica.820013 3ª Ed. Argentina Editorial Médica Panamericana, S. A

Nelson D. y Cox M. (2013). Principios de bioquímica. Editorial W.H. Freeman and

Company.