ARTIKEL ILMIAH

PRAKTIKUM BIOKIMIA

PENGARUH WAKTU HIDROLISIS PROTEIN GELATIN OLEH ENZIM PROTEASE

TERHADAP VOLUME NaOH DAN mg NITROGEN ASAM AMINO MELALUI
TITRASI FORMAL ASAM AMINO

Oleh:

Ni Putu Fitria Atrisa (1213031068)

JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN GANESHA
SINGARAJA
2015
 PENGARUH WAKTU HIDROLISIS PROTEIN GELATIN OLEH ENZIM PROTEASE
TERHADAP VOLUME NaOH DAN mg NITROGEN ASAM AMINO MELALUI
TITRASI FORMAL ASAM AMINO

Ni Putu Fitria Atrisa*, 1213031068

*Mahasiswa Jurusan Pendidikan Kimia, Fakultas MIPA, Undiksha Singaraja

Jalan Udayana, Singaraja 81117 Telepon (0362) 25072

ABSTRAK

Tujuan percobaan ini adalah untuk menghidrolisis protein dengan enzim protease dan untuk membuat kurva
hubungan antara volume NaOH terhadap waktu hidrolisis pada titrasi formal asam amino. Percobaan ini dilakukan
dengan metode kuantitatif yaitu titrasi formal asam amino. Hasil yang diperoleh dari percobaan ini adalah volume
NaOH yang dibutuhkan pada titrasi menit ke-0, 15, 30, 45 dan 60 berturut-turut sebanyak 13,00 mL, 16,50 mL,
18,00 mL, 21,8 mL dan 25,7 mL. Berdasarkan perhitungan yang dilakukan, jumlah mg nitrogen yang dihasilkan
pada sampel menit ke-0, 15, 30, 45 dan 60 berturut-turut sebanyak 3,64 mg, 4,62 mg, 5,04 mg, 6,104 mg dan 7,196
mg. Derajat hidrolisis protein gelatin berdasarkan percobaan dan perhitungan yang dilakukan adalah 0,211. Kurva
hubungan antara waktu dengan volume NaOH dan mg Nitrogen adalah berbanding lurus. Semakin lama waktu
hidrolisis, maka volume NaOH yang digunakan dalam titrasi dan jumlah mg nitrogen yang dihasilkan akan semakin
banyak.

Kata Kunci : Titrasi formal, asam amino, gelatin, hidrolisis, enzim protease.

ABSTRACT

This experiment aims to hydrolyze the protein with protease enzymes and to make the curve of the relationship
between the volume of NaOH and hydrolysis time on formal titration of amino acids. This experiment was
conducted using a quantitative formal titration of amino acids. The results obtained from this experiment is the
volume of NaOH used to titrate sample from minute 0, 15, 30, 45 and 60 respectively as 13,00 mL, 16,50 mL, 18,00
mL, 21,8 mL and 25,7 mL. Based on calculations performed mg amount of nitrogen produced in minute samples of
0, 15, 30, 45 and 60 respectively as much as 3.64 mg, 4.62 mg, 5:04 mg, 6104 mg and 7196 mg. the degree of
protein hydrolysis of gelatin based on experiments conducted is 0,211. Curve relationship between time with the
volume of NaOH and mg Nitrogen is directly proportional. The longer the time of hydrolysis, the volume of NaOH
used in titration and the amount of nitrogen mg produced will be more

Keywords: formal titration, amino acids, gelatyn, hydrolyze, protease enzymes.

PENDAHULUAN
Protein berasal dari akar kata protos dari
bahasa Yunani yang berarti “yang paling
utama”. Protein adalah senyawa organik
kompleks dengan berat molekul tinggi yang
merupakan polimer dari monomer-monomer
asam amino yang dihubungkan satu sama lain
dengan ikatan peptida. Molekul protein
mengandung unsur karbon, hidrogen, oksigen,
nitrogen dan kadang sulfur serta fosfor. Suatu
molekul protein disusun oleh sejumlah asam
amino tertentu dengan susunan yang sudah
tertentu dan bersifat turunan (Aisjah Girindra
dalam Tika, 2010).
Asam amino merupakan ion dipolar yang
pada umumnya mempunyai dua atau lebih
pKa. Asam amino yang menyusun suatu
protein tertentu, kadar asam aminonya tidak
sama. Protein jika dihidrolisis akan
menghasilkan asam amino bebas. Asam amino
H H
R C COOH
(aq)
NH2
Gambar 1. Struktur dipolar asam amino
Dari gambar tersebut, gugus amino
diprotonasi dan hadir sebagai ion
ammonium, sedangkan gugus karboksil
kehilangan protonnya dan hadir sebagai
anion karboksilat. Struktur ini konsisten
dengan sifat asam amino yang seperti
garam, yang memiliki titik leleh agak tinggi.
Asam amino bersifat amfoterik artinya
berperilaku sebagai asam dan mendonasikan
proton pada basa kuat atau dapat juga
berperilaku sebagai basa dan menerima
proton dari asam kuat.
Bila suatu protein dihidrolisis, akan
didapatkan asam aminonya. Hidrolisis
protein dapat dilakukan dengan
menggunakan enzim protease dari tripsin.
Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan
asam amino bebas. Asam amino bebas ini
bila direaksikan dengan formaldehid
berlebih akan membentuk derivate metilol.
Reaksi ini menyebabkan asam amino bebas
bentuk isoelektrik kehilangan satu proton
dari gugus NH3+ (Tika, 2010).
H+ yang dilepaskan pada reaksi ini
dapat dititrasi langsung dengan NaOH
sampai dengan pH 8,0 (titik akhir indicator
ekuivalen). Titrasi asam amino atau
campuran asam amino dalam keberadaan
formaldehid disebut dengan titrasi formal
asam amino. Titrasi ini merupakan metode
analisis untuk mengikuti pembentukan asam
amino bebas yang dihasilkan pada proses
hidrolisis protein oleh enzim proteotik (Tika,
2010).
tidak larut di dalam eter karena merupakan
senyawa dipolar dan dalam air menunjukkan
struktur kutub ganda (Zwitter ion) yaitu:
R C COO -
(aq)
NH3+
Pada percobaan ini dibuat kurva titrasi
dari asam amino yang diperoleh dari hasil
hidrolisis protein dengan menggunakan
enzim protease dari tripsin. Tripsin adalah
suatu enzim proteolitik atau enzim yang
mengkatalisis hidrolisis protein. Tripsin
mengkatalisis hidrolisis ikatan amida di
bagian karboksil dari lisin atau arginin
(Fessenden, 2010). Selama hidrolisis suatu
protein, sejumlah gugus karboksil dan gugus
amino bertambah terus. Penentuan secara
kuantitatif salah stau gugus akan dapat
memberikan indikasi untuk mengetahui
derajat hidrolisis protein. Menurut teori
zwiiterion, kalau suatu asam amino dalam
larutan dititrasi dengan basa, berarti ion
hydrogen dari ammonium yang dititrasi.
Gugus ammonium dari asam amino yang
bersifat buffer pada daerah pH tinggi atau di
atas pH 11, sehingga tidak mungkin dititrasi
sampai titik akhir. Hal yang sama juga
terjadi pada gugus karboksil yang bersifat
buffer pada pH rendah sehingga tidak
mungkin juga dititrasi dengan basa (Tika,
2010).
Untuk mengatasi hal tersebut, maka
formaldehid ditambahkan ke dalam larutan
asam amino agar bereaksi dengan gugus
amino yang tidak bermuatan sehingga
memungkinkan gugus ammonium
membuffer pada daerah pH yang lebih
rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir
secara kuantitatif menggunakan indicator
(Tika, 2010).
 Penambahan formalin ke dalam larutan
asam amino akan membentuk dimetilol.
Dengan terbentuknya dimetilol berarti gugus
amino dari protein sudah terikat dan tidak
akan mempengaruhi titik akhir titrasi
sehingga titik akhir titrasi dapat ditentukan
dengan tepat. Indikator yang digunakan
adalah fenolptalein (Tika, 2010).
Pada praktikum ini digunakan gelatin
yang merupakan produk alami yang
O O
H H
O C N C
H H H2 H
N C C N C C N CH 2
H C
CH 3 O CH 2
NH
C NH
NH 2
Gambar 2. Struktur Gelatin (Sumber: Tika, 2010)
MATERI DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam percobaan ini
adalah gelas kimia 100 mL, labu Erlenmeyer
100mL, buret 50 mL, statif dan klem, spatula,
batang pengaduk, labu ukur 100 mL, kaca
arloji, termometer, pipet tetes dan labu ukur 25
mL. Bahan yang diperlukan dalam percobaan
ini adalah larutan glisin 1%, NaOH 0,2 M,
HCl 0,1 M, indikator PP 1%, larutan
formaldehid 40%, larutan tripsin 1% dan
aquades.
Prosedur Kerja
Penyiapan Larutan Gelatin
Sebanyak 250 mL larutan gelatin
ditambahkan 1 mL fenolftalein dan NaOH 0,2
diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen.
Gelatin merupakan protein yang larut dan
bersifat gelling agent (bahan pembuat gel).
Sumber bahan baku gelatin dapat berasal
dari tulang dan kulit dari sapi atau babi.
Gelatin terdiri dari glisin dengan komposisi
besar, protein dan 4-hidroksi residu.
Struktur gelatin adalah sebagai berikut:
O O
H H2 H H H
C N C C N C C N OH
CH 2
NH
CH 2
O CH2
C O
C O
O-
NH O
C
M tetes demi tetes hingga timbul warna merah
muda. Setelah itu larutan gelatin ditambahkan
tetes demi tetes larutan HCl 0,1 mL sampai
warna merah mudanya hilang. Larutan
kemudian direndam pada inkubator air dengan
suhu 38oC selama beberapa menit.
Penyiapan Larutan Tripsin
Larutan tripsin sebanyak 62,5 mL
ditambahkan dengan 1 mL larutan
fenolftalein dan tetes demi tetes larutan
NaOH 0,2 M sampai timbul warna merah
muda. Larutan tripsin yang berwarna merah
muda direaksikan dengan tetes demi tetes
larutan HCl 0,1 M sampai hilang warna
merah mudanya hilang. Larutan kemudian
diinkubasi dalam inkubator air pada suhu
38oC selama beberapa menit.
Titrasi Formal Asam Amino
Larutan tripsin dan larutan gelatin
dicampurkan dan diaduk perlahan. Setelah
tercampur merata, 10 mL campuran diambil
dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 100
mL. Larutan ini digunakan sebagai kontrol
atau waktu nol. Larutan kemudian dididihkan
untuk merusak enzim kemudian didinginkan.
Larutan yang sudah dingin ditambahkan 15
mL formalin netral dan 3 tetes indikator PP,
kemudian dititrasi menggunakan NaOH 0,02
M. Langkah di atas diulang pada interval
waktu 15, 30, 45, dan 60 menit dari waktu
nol. Data yang didapat digunakan untuk
membuat kurva titrasi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan percobaan yang telah
dilakukan pada proses penyiapan larutan
gelatin dan tripsin, diperoleh hasil pengamatan
seperti yang disajikan dalam tabel berikut.

Tabel 1. Hasil Pengamatan pada Proses Penyiapan Larutan Gelatin dan Tripsin
Larutan Warna yang larutan
Gelatin Bening kekuningan
Gelatin + PP Bening kekuningan
Gelatin + PP + NaOH Merah muda
Gelatin + PP + NaOH + HCl Bening kekuningan
Tripsin Kuning kehijauan
Tripsin + PP Kuning kehijauan
Tripsin + PP + NaOH Merah kekuningan
Tripsin + PP + NaOH + HCl Kuning kehijauan

Penambahan larutan fenolftalein (PP) gambar 3b). Campuran kemudian ditambahkan

berfungsi sebagai indikator yang akan
menunjukkan perubahan warna ketika pH
lingkungannya berubah. Penambahan larutan
NaOH bertujuan agar larutan bersifat sedikit
basa. setelah ditambahkan NaOH,larutan
berubah warna menjadi merah muda (lihat
HCl tetes demi tetes hingga warna merah muda
hilang (lihat ambar 2c). Tujuan penambahan
HCl ini adalah agar pH menjadi 8 karena pada
pH ini enzim tripsin mampu bekerja secara
optimal.

a b c

Gambar 3. (a) Larutan Gelatin bening kekuningan, (b) Gelatin +PP + NaOH berwarna merah muda,
(c) Gelatin + PP + NaOH setelah ditambah HCl berwarna bening kekuningan
 Hal yang sama juga dilakukan pada
larutan tripsin. Larutan tripsin berwarna kuning
kehijauan (lihat gambar 4a). setelah
ditambahkan indikator PP dan NaOH larutan
berubah warna menjadi merah kekuningan
(lihat gambar 4b). Penambahan NaOH
a b
Gambar 4. (a) larutan tripsin berwarna kuning kehijauan, (b) tripsin + indikator PP + NaOH
berwarna merah kekuningan, (c) tripsin + indikator PP + NaOH setelah ditambah HCl
berwarna kuning kehijauan.
Selanjutnya dilakukan inkubasi terhadap
larutan gelatin dan tripsin dengan inkubator air
suhu 38oC agar enzim protease dapat bekerja
secara optimal. Suhu dijaga jangan sampai
melebihi 38oC karena bisa terjadi pembentukan
gel yang sangat mempengaruhi proses
degradasi untuk menghasilkan asam amino.
Selanjutnya setelah diinkubasi, maka kedua
larutan ini dicampur. Tujuan pencampuran ini
adalah untuk mengdegradasi larutan gelatin
dengan menggunakan enzim tripsin. Tripsin
merupakan enzim proteolitik yang hanya terdiri
dari suatu rantai polipeptida. Enzim ini akan
mendegradasi gelatin menghasilkan asam
amino penyusunnya.
10 mL larutan campuran tripsin dan
gelatin ini diambil dan dididihkan untuk
merusak enzim, kemudian didinginkan
(digunakan sebagai sampel kontrol atau waktu
bertujuan untuk membuat larutan menjadi
bersifat sedikit basa. Selanjutnya dilakukan
penambahan HCl yang menyebabkan larutan
kembali berwarna kuning kehijauan (lihat
gambar 4c).
c
nol). Setelah didinginkan larutan ditambahkan
15 mL formalin netral dan 3 tetes indikator PP.
Pada titrasi ini dipilih indikator PP karena
trayek pH indikator PP adalah 8,3-12, sehingga
sesuai dengan pH larutan yaitu pH=8. Larutan
kemudian dititrasi dengan NaOH 0,02 M.
Larutan ini digunakan sebagai kontrol atau
sampel waktu nol. Prosedur yang sama diulangi
dalam selang waktu 15 menit sampai menit ke-
60. Data hasil titrasi kemudian dicatat
kemudian dapat dibuat kurva titrasinya.
Penambahan formalin netral dilakukan
agar gugus karbonil dalam formalin bereaksi
dengan asam amino yang tidak bermuatan
sehingga memungkinkan gugus amonium
bereaksi dengan NaOH dan membuffer pada
pH yang lebih rendah. Reaksi yang terjadi
secara keseluruhan dalam titrasi formal asam
amino dapat dilihat dalam gambar 5.
 H H

R C COOH R C COO -
(aq) (aq)

NH 2 NH3 +

H O H

R C COO- + C R C COOH
(aq) (aq)
H H
NH3+ H N CH2OH
(aq)
O

C
H H

R C COOH

HOH2 C N CH2OH
(aq)
dimethilol
H H

R C COOH + NaOH R C COO-Na+ + H 2O (l)

(aq)

HOH2 C N CH2OH (aq) HOH 2C N CH2OH (aq)

Natrium dimethilol

Gambar 5. Reaksi Keseluruhan dalam Titrasi Formal Asam Amino

Volume NaOH yang dibutuhkan dalam titrasi hubungan antara volume NaOH terhadap
sampel waktu ke-0, 15, 30, 45 dan 60 menit waktu pada titrasi formal asam amino (lihat
disajikan dalam tabel 2. Berdasarkan data gambar 6).
yang terdapat pada tabel 2, dapat dibuat kurva

Tabel 2. Data Volume NaOH yang Digunakan dalam Titrasi

Waktu (menit) Volume NaOH (mL)
0 13,0
15 16,5
30 18,0
45 21,8
60 25,7
 Gambar 6. Kurva Hubungan Volume NaOH terhadap Waktu

Berdasarkan grafik di atas, dapat Pada waktu t = 0

dinyatakan bahwa semakin lama larutan
dibiarkan, maka semakin banyak volume Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 13,00
NaOH yang digunakan untuk proses titrasi. mL
Hal ini terjadi karena selama proses hidrolisis
gelatin oleh tripsin menghasilkan sejumlah Mol NaOH = 13,00 mL x 0,02 M = 0,26 mmol
asam amino yang konsentrasinya bertambah 1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg
seiring dengan bertambahnya kontak antara nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,26
larutan gelatin dengan larutan tripsin. Derajat mmol NaOH ekuivalen dengan:
hidrolisis dari enzim tripsin juga dapat
dihitung berdasarkan kurva di atas, yaitu 0,1 mmol 1,4 mg

dengan perhitungan sebagai berikut: 0,26 mmol x mg

V NaOH
Derajat hidrolisis 
t 0,26 mmol
x 1,4 mg  3,64 mg
(25,7  13,0) 0,1 mmol
Derajat hidrolisis   0,0211
(60  0) nitrogen asam amino

Jadi, derajat hidrolisis dari asam amino
adalah 0,0211
Dengan mengasumsikan 1 mL NaOH
ekivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino,
maka dapat dihitung jumlah mg asam amino
pada tiap volume NaOH saat titrasi seperti
perhitungan berikut;
Dengan perhitungan yang sama dapat
dihitung pula miligram nitroen pada menit ke-
15, 30, 45, 60, Data mg asam amino untuk tiap
volume NaOH dapat dilihat pada tabel 3.
Berdasarkan data tabel 3, dapat dibuat
kurva hubungan antara massa nitrogen terhadap
waktu (lihat gambar 7).
 Tabel 3. Jumlah Miligram Nitrogen untuk Masing-masing Volume NaOH
Waktu (menit) Volume NaOH (mL) mg Nitrogen Asam Amino
0 13,0 3.64
15 16,5 4.62
30 18,0 5.04
45 21,8 6.104
60 25,7 7.196

Gambar 7. Kurva Hubungan mg Nitrogen terhadap Waktu

Berdasarkan kurva pada gambar 7, dapat UCAPAN TERIMAKASIH

dilihat bahwa jumlah mg Nitrogen semakin
banyak seiring dengan bertambahnya waktu.
SIMPULAN
Berdasarkan uraian pembahasan di atas
dapat dibuat simpulan sebagai berikut:
1. Larutan gelatin (protein) dapat
dihidrolisis dengan menggunakan
tripsin (enzim protease) dan
menghasilkan asam amino.
2. Berdasarkan kurva pada gambar 6 dan
gambar 7 diperoleh bahwa semakin
lama waktu inkubasi larutan campura
gelatin dan tripsin, maka volume
NaOH yang diperlukan dalam titrasi
dan milligram Nitrogen yang
dihasilkan akan semakin banyak.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan
kepada Dr. I Nyoman Tika, M.Si., sebagai
dosen pengampu mata kuliah Praktikum
Biokimia, Kadek Dewi Wirmandianthy,
S.Pd.,M.Si selaku asisten dosen, dan I Dewa
Subamia selaku laboran di Jurusan
Pendidikan Kimia atas masukan dan sarannya
sehingga percobaan ini dapat dilaksanakan
dengan baik.
DAFTAR PUSTAKA
Fessenden dan Fessenden. 1994. Kimia
Organik Jilid 2. Edisi Ketiga.
Jakarta : Erlangga.
Redhana, I Wayan dan Siti Maryam.
2003. Penuntun Praktikum
Biokimia. Singaraja : IKIP
Negeri Singaraja
Tika, I Nyoman. 2007. Penuntun Wirahadikusuma, Muhamad. 2001.
Praktikum Biokimia. Singaraja: Biokimia :Protein, Enzim, dan
Universitas Pendidikan Ganesha Asam Nukleat. Bandung :
Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun Penerbit ITB
Praktikum Biokimia. Singaraja:
Universitas Pendidikan Ganesha