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VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN DE POLIFENOLES EN EL

EXTRACTO FLUIDO DE Tamarindus indica L

Article · January 2011

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Julio Cesar Escalona Arranz

University of Oriente (Cuba)
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 VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN
DE POLIFENOLES EN EL EXTRACTO FLUIDO DE
Tamarindus indica L
Jesús Rafael Rodríguez-AmadoI; Julio César Escalona-ArranzI; Roberto Rodríguez-RomeroII;
Yaimara Rodríguez-BatistaII
jimmy@cnt.uo.edu.cu
"
I
Departamento de Farmacia, Universidad de Oriente, Santiago de Cuba; IIEmpresa Comercializadora
de Medicamentos, Santiago de Cuba

z Resumen

Se realizó la validación del método de Folin Ciocalteau para cuantificar polifenoles en el extracto
fluido de tamarindo, ya que hasta el momento, no se cuenta con un método que permita evaluar la calidad
química de este extracto. Se registró suficiente evidencia para afirmar que este método en las condiciones
practicadas mantiene los parámetros linealidad, selectividad, especificidad, exactitud, precisión (repetibilidad
y reproducibilidad), dentro de los criterios de aceptación de la literatura especializada, por lo que puede
asegurarse que es fiable, y se propone como método para el control de la calidad química del extracto
fluido de tamarindo.
Palabras clave: validación, tamarindo, Folin Ciocalteau, extracto fluido.

z Abstract

The Folin Ciocalteau spectrofotometric analytical method, to quantified polyphenols in Tamarindus

indica L. fluid extract was validated because of, until this moment, there is not an analytical procedure
to evaluate the chemical quality of this extract. It was recorded enough analitical evidences to affirm that
this method, under the practiced conditions, maintains the parameters linearity, selectivity, specificity,
accuracy, precision (repeatability and reproducibility) and robustness, inside the international acceptance
criteria. This way, it can conclude that, this method is reliable and it intends for the chemical quality control
of the Tamarindus indica L fluid extract.
Keywords: validation, tamarind, Folin Ciocalteau, fluid extract.

z Introducción previstos especificados. La literatura especializada

En la actualidad se ha incrementado el empleo de
las plantas medicinales, por esta razón es vital que los
medicamentos de origen natural, tanto en la fase
inicial de estandarización como en la fase de desarrollo
de formas farmacéuticas en las que se encuentran
como principio activo, cuenten con métodos analíticos
validados que permitan garantizar la calidad de los
mismos y la realización de los estudios de estabilidad.
La Organización Mundial de la Salud /1/ define la
validación como, "el establecimiento de pruebas
documentales que aportan un alto grado de seguridad
de que un proceso planificado se efectuará
uniformemente en conformidad con los resultados
recomienda que para los métodos de control de
calidad de materias primas, y productos terminados se
evalúen como parámetros de validación linealidad,
selectividad, especificidad, exactitud, precisión
(repetibilidad y reproducibilidad) y robustez /3, 4/.
Para el desarrollo químico-farmacéutico de un
nuevo medicamento es imprescindible la utilización de
un método analítico que permita cuantificar, de manera
fiable, el metabolito responsable de la actividad
farmacológica, el producto mayoritario, o de interés,
ya sea en la materia prima pura o cuando está
formando parte como ingrediente activo de una
formulación /5, 6/.

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Por estos motivos, en este trabajo se realiza la
validación del método espectrofotométrico UV-visible,
para la cuantificación de polifenoles en el extracto de
las hojas de la especie Tamarindus indica L.
z Materiales y métodos
Preparación de las soluciones
La preparación del reactivo de Folin Ciocalteau,
la solución de carbonato de sodio (Riedel – de Haiën,
Alemania) al 20 %, y la solución de ácido tánico
(Riedel – de Haiën, Alemania) 0,05 mg/mL se realiza
según procediendo descrito en la BP 2007 /7, 8/.
TABLA 1. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES A ENSAYAR
Evaluación de los parámetros de validación
Linealidad
Se construyó una curva de calibración y para
ello se prepararon soluciones de un patrón de
referencia de ácido tánico a seis niveles de
concentración: 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,12; 0,14
mg/mL. Se realiza el análisis por quintuplicado en
cada nivel de concentración. Se determinó el
coeficiente de variación del factor respuesta. Se
realizó un análisis de varianza en todos los niveles
de concentración estudiados. Se realiza el análisis
de regresión simple entre las variables cantidad
recuperada contra cantidad añadida. Se realizó la
prueba de linealidad y de proporcionalidad. Se
calcularon además los por cientos de recuperación
en cada nivel de concentración /3, 6/.
Los criterios de aceptación fueron: coeficiente de
variación del factor respuesta (CVFR) menor del
5 %, análisis de varianza no significativo, coeficiente
de correlación (R) mayor que 0,99, coeficiente de
determinación (R2) mayor que 0,98, intervalo de
confianza del intercepto incluye el 0, intervalo de
confianza de la pendiente: incluye el 1, cantidad de
analito recuperado entre 97 y 103 % /3, 6/.
Vol. XXIII, Nº 1, enero-abril, 2011 43
Preparación de la muestra de ensayo
Se toma 1ml del extracto fluido de tamarindo y
se diluye en un volumétrico de 250 mL con agua
destilada hasta enrasar. Se filtra la solución a
través de papel de filtro y se desechan los primeros
20-30 mL. El filtrado se reserva para el análisis.
Procedimiento analítico
El procedimiento para la preparación del
blanco, el patrón y la muestra se presentan en la
tabla 1.
Selectividad
Se evaluó por el método de adición de estándar,
por ser la muestra un producto natural, o sea una
matriz muy compleja; con el objetivo de determinar si
el resto de los componentes presentes en el extracto
fluido interfieren en la respuesta del método. Se
preparan ocho frascos volumétricos de 25 mL, y se les
añade a cada uno 3 mL de la muestra filtrada, a los que
se fueron añadiendo cantidades prefijadas de la
solución patrón de ácido tánico equivalentes a 0; 15;
30, 45; 60; 75; 90 y 105 ppm. Se les determina la
concentración de polifenoles recuperada, y se lleva a
cabo una regresión, calculando correlación y de
determinación, se realiza un test para determinar la
significación del intercepto, una prueba C de Cochran
para determinar homocedasticidad en los distintos
niveles de adición como prueba de que la matriz no
afecta la respuesta del método y se determina además
el coeficiente de variación en cada nivel de adición
estudiado /2, 3/.
Los criterios de aceptación fueron: coeficiente de
correlación mayor que 0,99; coeficiente de
determinación mayor que 0,98; prueba C de Cochran

no significativa, intervalo de confianza del
intercepto incluye el valor de la absorbancia de la
muestra sin adición de patrón, el coeficiente de
variación del factor respuesta en cada nivel es
menor de 2 % /3, 6/.
Exactitud
Se realizó el estudio por el método de muestra
enriquecida con patrón según se plantea en la literatura
para este tipo de muestra /9/. Se toman 3 mL y se le
añaden cantidades crecientes de ácido tánico 0; 45;
75 y 105 ppm, se le añade 1ml de la solución de Folin
y 2 mL de la solución de carbonato de sodio al 20 %.
Se lee la absorbancia de las mismas por triplicado, se
promedia, y luego se evalúa la cantidad recuperada
del analito con relación a la cantidad añadida
inicialmente. Posteriormente se realizó una regresión
simple de la respuesta del método (absorbancia)
contra concentración de patrón añadido que permita
calcular la cantidad de analito que se recupera en
cada nivel de adición. Se calculan además el
coeficiente de variación (CV) y el por ciento de
analito recuperado /3, 6, 8/.
Los criterios de aceptación fueron:
coeficiente de correlación mayor que 0,99;
coeficiente de determinación mayor que 0,98; el
intervalo de confianza del intercepto incluye la
concentración inicial de la muestra sin adición
del patrón, pendiente de la recta es mayor que
0,95; el intervalo confianza de la pendiente:
incluye el 1, el coeficiente de variación del
factor respuesta es menor que 3 % y la cantidad
de polifenoles recuperada está entre 98 y
102 % /3, 6, 8/.
Precisión
Repetibilidad
Se evalúa como repetibilidad. Se toma una cantidad
de muestra de extracto fluido de 3 mL y se le añaden
cantidades crecientes de ácido tánico, de 15; 60 y 105
ppm, se realizan nueve réplicas por cada nivel de
adición, el mismo día, con el mismo equipo y el mismo
analista. Los criterios de aceptación son: prueba C de
Cochran no significativa, coeficiente de variación del
factor respuesta menor que 3 % /3, 6/.
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Reproducibilidad
Se evaluó con la muestra correspondiente al
100 %, por quintuplicado, con dos analistas en
dos espectrofotómetros diferentes uno Cezil
7000, UK y el otro Pharmacia LKB-Ultrospec
III, Suecia. Se realiza una prueba F para evaluar
diferencias entre las desviaciones típicas entre
cada uno de los factores estudiados. El criterio
establecido para la reproducibilidad es la no
significación de la prueba F y un coeficiente de
variación menor del 3 % /3, 6/.
Especificidad
Se analizaron muestras de placebo (etanol
20 %), placebo enriquecido con patrón, y placebo
enriquecido con la muestra de extracto fluido de
tamarindo al 100 % de la concentración. Todos los
ensayos se efectuaron por quintuplicado y como
criterio se estableció que no debe existir absorbancia
significativa del placebo en la longitud de onda de
trabajo con relación al patrón, ni diferencias
significativa entre la absorbancia de las soluciones
de placebo enriquecido con patrón y con muestra
a un mismo nivel de concentración /9, 10/.
Robustez
Se realizó un diseño factorial 22, donde se evaluó el
efecto de las variables independientes analistas (analista
1 y 2) y el tiempo de preparación del reactivo de Folin
Ciocalteau (0 y 15 días) sobre la cantidad recuperada
de polifenoles. Cada analista utilizó cristalería diferente
y en cada tiempo, evaluó las muestras del otro analista.
Análisis estadístico
Se realizaron pruebas Anova para evaluar
diferencia de medias en cada experimento en los
diferentes niveles utilizados, se utilizó el test de Rangos
Múltiples de Duncan para evaluar grupos de medias
diferentes. Se realizó análisis de regresión simple
donde correspondió para evaluar la correlación entre
las variables. Se utilizó el paquete estadístico
Statgraphics Plus V.5.0.1 para Windows (StatEase
Co. Minneapolis USA) para las pruebas estadísticas
realizadas y para la construcción de los gráficos se
utilizó el Software Origin (v6.1052 (B232) de
OriginLab Co., MA. USA).
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z Resultados y discusión
Evaluación de la linealidad
Los resultados obtenidos en los seis niveles de concentraciones estudiados se muestran en la tabla 2.
TABLA 2. REGISTRO DE LOS DATOS PARA LINEALIDAD

El coeficiente de variación del factor respuesta El valor de R en la regresión fue de 0,999 0

obtenido fue menor de 1 % en todos los niveles, por
lo que se puede afirmar que existe homogeneidad en
los resultados en todos los niveles estudiados. Esto lo
corrobora los excelentes valores de recuperación
obtenidos que se encuentran entre 98,5 y 101,5 % en
todos los niveles estudiados, por lo que se puede decir
que el aumento de la concentración no afecta la
respuesta del método. No se encontraron diferencias
significativas entre las cantidades añadidas y
recuperadas, con 95 % de confianza.
La expresión lineal obtenida es la siguiente:
valor que se encuentra por encima del valor
recomendado por la literatura, /3, 6, 10/ lo que
indica una fuerte relación entre las variables
estudiadas y R 2 resultó igual a 0,9979, mayor
que 0,98, que es el criterio recomendado por de
la literatura /3, 6, 10/, este valor indica que el
modelo lineal ajustado explica en un 99,80 % la
variabilidad de la cantidad recuperada en función
de la cantidad añadida.

donde Cr es la cantidad recuperada y Ca la concentración de la solución estándar.

Fig. 1 Gráfico del modelo ajustado para linealidad.

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El intervalo de confianza (0,952 58 hasta 1,047 24) del método de análisis utilizado. La figura 1 muestra
de la pendiente (test de linealidad) incluyó el valor 1, el gráfico de la función de linealidad.
y el intervalo de confianza del intercepto (test de
proporcionalidad), incluye valor 0 (-0,423 87 hasta Evaluación de la selectividad
0,422 72) lo que corrobora estadísticamente el paso de
la función por el punto 0,0; criterio establecido por la En la tabla 3 se presentan los resultados de la
literatura /2,3,10/ y que es indispensable en el recuperación de polifenoles en presencia de la matriz
cumplimiento de la ley de Lamber Beer, fundamento (extracto fluido).
TABLA 3. RESULTADOS DE LA EVALUACIÓN DE LA SELECTIVIDAD

Nivel 0 se corresponde con la muestra sin adición de patrón.

El coeficiente de correlación igual a 0,998 4 (mayor
de 0,99) indica una fuerte relación entre la respuesta
del método y la cantidad añadida de patrón, lo que
evidencia que la respuesta no se ve afectada por los
componentes de la matriz con un 95 % de confiabilidad.
Esto lo corrobora el análisis de varianza de la regresión
que mostró un valor de F igual a 188 0,98 y un p-valor
de 0,000 0. El coeficiente de determinación igual a
0,996 8 (mayor de 0,98), satisface los requerimientos
que se expresan en la literatura /2, 3/, e indica que el
modelo explica en un 99,68 por ciento la variabilidad
de la absorbancia en función de la cantidad de patrón
añadida, cuando están presentes todos los componentes
de la matriz.
El valor de la absorbancia de la muestra sin adición
de estándar (0,384) se encuentra dentro del intervalo
de confianza del intercepto (0,373 813 - 0,384 09), lo
que evidencia la proporcionalidad de la respuesta del
método, cuando la matriz se enriquece con adiciones
crecientes del patrón. La figura 2 muestra el gráfico
del modelo ajustado para selectividad.

Fig. 2 Gráfico del modelo ajustado para selectividad.

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La expresión de este modelo se presenta en la ecuación 2.

Donde Cr es la cantidad recuperada y Ca la para este test cumplen con el criterio propuesto en la
concentración del patrón. literatura (2 %) /2, 3, 8, 10/.

Los coeficientes de variación del factor respuesta
(absorbancia) en todos los niveles de adición se
mantienen por debajo de 0,5 %, demostrando la poca
variabilidad y la homogeneidad de la respuesta, esto
se confirma ya que no se encontraron diferencias
significativas (p-valor= 0,802 4 > 0,05; prueba C de
Cochran) entre las desviaciones estándar de las
mediciones en ninguno de los niveles de adición
utilizados, lo que evidencia la homogeneidad del
resultado. Los valores del coeficiente de variación
TABLA 4. REGISTRO DE LOS DATOS DEL
PARÁMETRO EXACTITUD
La evidencia obtenida en los ensayos permite
asegurar que los resultados no se afectan por la
presencia de los componentes de la matriz, por lo
que el método posee una adecuada selectividad.
Evaluación de la exactitud
En la tabla 4 se muestran los resultados obtenidos
de la recuperación de polifenoles durante el ensayo de
evaluación de la exactitud.

(n=3)
A:absorbanciamedia;DS:desviaciónestándar;Cv:coeficientedevariación;
Cant Rec: cantidad recuperada; % Rec: por ciento recuperado.
El análisis de regresión mostró un valor de R igual intervalo de confianza (-0,452 6 hasta 5,746 1) incluye
a 0,999 8 (R > 0,99), y un valor de R2 igual a 0,997 el 0, lo que indica que la señal del analito se detecta
(r2 > 0,98) valores que cumplen con los criterios de sin interferencias de la matriz. El intervalo de confianza
aceptación para este parámetro reportados en la de la pendiente (0,908 5 hasta 1,025 3) incluye al valor
literatura /2, 3, 8/. El intercepto dio un valor igual a 1, y su valor es superior a 0,95 (tabla 5) criterio de
la cantidad muestra sin adición del patrón y su aceptación la literatura /2, 3, 8, 10/.
TABLA 5. PARÁMETROS DE LA ECUACIÓN DE REGRESIÓN AJUSTADA
CON SU INTERVALO DE CONFIANZA

El Coeficiente de variación en todos los casos
dio un valor por debajo del 0,3 %; (la literatura
establece hasta un tres por ciento) /2,3/. En los tres
niveles de adición utilizados se obtuvo una
recuperación dentro del límite establecido por la
literatura (± 2 %) /2,3/. Estos criterios permiten
asegurar que el método es exacto en el intervalo de
trabajo estudiado.
Precisión
Repetibilidad: En la tabla 6 se muestran los
resultados del estudio de la precisión del método
expresada como repetibilidad.

Vol. XXIII, Nº 1, enero-abril, 2011 47

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TABLA 6. RESULTADOS DE LA EVALUACIÓN DE LA PRECISIÓN

COMO REPETIBILIDAD

DE desviación estándar, Cv coeficiente de variación.

El coeficiente de variación para los tres
niveles de concentración es menor del 0,5 %,
cumpliendo el requerimiento de la literatura
especializada (menor de 3 %) /2, 3, 10/, por lo
que se puede afirmar que en estas condiciones
de trabajo el método posee buena precisión.
Esto se confirma con la prueba C de Cochran
que mostró homocedasticidad de las varianzas
en los 3 niveles de concentración con p-valor de
0,498 7, valor superior al nivel de significación
(a= 0,05) para un 95 % de confianza. Esto es un
indicador de que la respuesta del método es precisa,
cuando la muestra se carga con patrones pues no se
afecta la repetibilidad de los resultados.
Reproducibilidad: La tabla 7 muestra el resumen
estadístico de los resultados de la evaluación para la
reproducibilidad.

TABLA 7. RESUMEN ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS

DE LA EVALUACIÓN DE LA REPRODUCIBILIDAD
(N=5)

El coeficiente de variación de la absorbancia absorbancia de de 0,345 ± 0,05 y 0,347 ± 0,04.

estuvo en todos los casos por debajo de 0,6 %, hecho
que indica la buena reproducibilidad de los resultados
que se alcanzan con este método. Esto se corrobora
con el test ANOVA, que arrojó un valor de F igual a
1,75 con un valor de probabilidad de 0,345 8. Puesto
que el p-valor de la prueba F es superior a 0,05, no hay
diferencia estadísticamente significativa entre las
medias obtenidas por ambos analistas, ninguno de los
días evaluados con un 95,0 % de confiabilidad.
De este resultado se infiere que el placebo no
tiene una absorción importante a la longitud de
onda de trabajo, y que no hay diferencias
significativas entre la absorbancia del placebo
enriquecido con patrón y con muestra (evaluado
por los intervalos de confianza) con un 95 % de
confiabilidad. Por lo que puede asegurarse que
en las condiciones ensayadas el método es
específico /8, 10/.

Evaluación de la especificidad Evaluación de la robustez

La muestra del placebo utilizado (solución
hidroalcohólica al 20 %) dio un valor medio de
absorbancia de 0,000 1, a la longitud de onda de
trabajo, mientras que la solución del patrón de ácido
tánico con el placebo y de la muestra con el placebo
(a iguales concentraciones) dieron valores medios de
En la tabla 8 se presentan los resultados
obtenidos con la aplicación del diseño factorial
que evaluó el efecto de los analistas y el tiempo
de preparación del reactivo de Folin Ciocalteau
para conocer su influencia sobre la respuesta
del método.

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TABLA 8. RESUMEN ESTADÍSTICO DE LOS VALORES DE

ABSORBANCIA MEDIDOS PARA ROBUSTEZ

A1M1 analista 1 muestra 1, A2M2 analista 2 muestra 2,

A1M2 analista 1 muestra 2, A2M1 analista 2 muestra 1.

El análisis de varianza realizado mostró un valor
de F igual a 27,789 5 con una probabilidad de 0,000 0
(menor de 0,05) por lo que se puede asegurar con un
95 % de confianza que los factores analizados afectan
la respuesta del método. El test de rangos múltiples de
Duncan mostró dos grupos homogéneos, los ensayos
correspondientes al tiempo 0 y tiempo 15
independientemente del analista, por lo que puede
afirmarse que el tiempo de preparación del reactivo
afecta la respuesta del método, por lo que es
necesario, utilizar siempre este reactivo recién
preparado. Esto se corrobora gráficamente en
la figura 3. De acuerdo con los resultados
obtenidos, puede asegurarse que en las
condiciones ensayadas, la respuesta del método
colorimétrico de Folin Ciocalteau no se altera
por cambios en el analista, ni por el tiempo de
preparación del reactivo.

A, B, C y D se corresponden con los ensayos a tiempo 0 de ambos analistas,

F, G, H e I con los tiempos 15 días de preparado el reactivo de Folin.
Fig. 3 Gráfico de medias para robustez.

 Conclusiones parámetros de linealidad, precisión (repetibilidad

Los resultados obtenidos en este trabajo
permiten afirmar que, en las condiciones
ensayadas, el método espectrofotométrico
propuesto para la cuantificación de polifenoles
expresados como ácido tánico en el extracto fluido
de Tamarindus indica L. es fiable, ya que los
y reproducibilidad), selectividad, exactitud y
especificidad cumplen los criterios de aceptación
propuestos en la literatura especializada para
estos fines. La respuesta del método se afecta
cuando el reactivo Folin ciocalteau no está recién
preparado, por lo que debe emplearse siempre
acabado de preparar.

Vol. XXIII, Nº 1, enero-abril, 2011 49

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Bibliografía
1
OMS. Guía de la OMS sobre los requisitos de las
prácticas adecuadas de fabricación (PAF). Ed. WHO
Library Cataloguing in Publication Data. Ginebra. Zuisa
1998.
2
EURACHEM Guide, The Fitness for Purpose of
Analytícal Methods. A Laboratory Guide to Method
Validation and Related Topics. First English Edition.
UK 2003.
3
ICH Harmonised tripartite guideline validation of
a n a l y t i c a l p r o c e d u r e s : m e t h o d o l o g y . Q 2B .
Recommended for Adoption at Step 4 of the ICH
Process. NY. USA 1996.
4
Sharapin N. Fundamentos de tecnología de productos
fitoterapéuticos. Secretaría Ejecutiva Convenio Andrés
Bello. Santa Fe de Bogotá. DC. Colombia 2004.
50 Vol. XXIII, Nº 1, enero-abril, 2011
View publication stats
5
WHO. Quality control methods for medicinal plant
materials. Ed. WHO Library Cataloguing in Publication
Data. Geneva. Suitherland 2003.
6
British Pharmacopoeia (BP). Ed. Her Majesty Stationary
Office. London; UK 2007.
7
United State Pharmacopeia. United State Pharmacopeia
Convention. 30 th Edition. USA 2007.
8
ICH Topic Q 1 A. Stability Testing Guidelines. Stability
testing of new drug substances and product. NY. USA
2004.
9
Gutiérrez G, Y; Miranda M, M; Varona T, N; Rodríguez
A, T. Validación de 2 métodos espectrofotométricos
para la cuantificación de taninos y flavonoides en Psidium
Guajaba L. Rev Cub Farmacia 2000; 34 (1): 50-55.
10
Chow C, Ch .Analytical method validation and
instrument performance verification. Ed. John Wiley &
Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. USA 2004.