Cuartas Jornadas de Jóvenes Investigadores UNT - CONICET Tucumán, 22, 23 y 24 de Junio de 2010

PROIMI (Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos).

Av. Belgrano y Pasaje Caseros, T4001 MVB, Tucumán, Argentina

DISEÑO DE UNA ACTIVIDAD LIPASA DE Aspergillus niger MYA 135 POR

FERMENTACIÒN SUMERGIDA: POTENCIAL APLICACION PARA LA SINTESIS DE
BIODIESEL

Autor: Bqca. Verónica L. Colin

Director: Dr. Mario D. Baigorí
Co- Director: Dra Licia M. Pera
Dirección electrónica: veronicacollin@yahoo.com.ar

Palabras claves: Aspergillus niger, Lipasas, biodiesel

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Introducción
Las lipasas (EC 3.1.1.3) son enzimas incluidas dentro de la familia de las hidrolasas
(Brockerhoff & Jensen, 1974), capaces de hidrolizar el enlace éster de los acilglicéridos
mediante la adición de una molécula de agua, dando lugar a la formación de ácidos grasos
libres y glicerol. Estas enzimas también pueden catalizar la reacción inversa en medios con
bajo contenido de agua (Pandey et al. 1999), promoviendo la síntesis de esteres mediante
reacciones de esterificación y transesterificación. Actualmente las lipasas constituyen uno de
los grupos mas importantes de biocatalizadores para aplicaciones biotecnológicas. Estas
enzimas pueden ser producidas y/o purificadas para su uso en sistemas homogéneos
(enzimas solubles) o heterogéneos mediante su inmovilización en soportes específicos
(Petkar et al. 2006). Para expandir la funcionalidad de estos últimos sistemas, la ingeniería de
superficie celular brinda una estrategia alternativa que permite inmovilizar genéticamente
enzimas en la superficie celular (Shigara et al. 2005). Sin embargo, existe un sistema
alternativo relativamente poco estudiado, que usa biocatalizadores naturalmente ligados a la
biomasa (Romano et al. 2005). Cuando la biomasa se utiliza directamente como fuente del
catalizador, a menudo se utiliza la frase “enzimas naturalmente inmovilizadas”. En este
tipo de sistema, la estructura celular puede actuar como una matriz natural capaz de proteger
la actividad enzimática de agentes externos, suministrando un efecto análogo al ejercido por
una matriz utilizada para inmovilizar enzimas.
Los biocatalizadores naturalmente inmovilizados como las lipasas microbianas intracelulares
o ligadas a la célula tienen muchas ventajas sobre sus contrapartes extracelulares; por lo
que en la actualidad están recibiendo cada vez mas atención (Hama et al. 2008). Aunque la
mayoría de los estudios son realizados en base a la actividad hidrolítica de estas enzimas,
casi todas las lipasas ligadas al micelio se usan en solventes orgánicos para catalizar
reacciones de síntesis (Romero et al. 2007; Fregolente et al. 2009), debido a la excepcional
estabilidad de las mismas en este contexto (Zanotto et al. 2009).
Considerando el panorama energético de Argentina, el petróleo (41%) y el gas natural
(49%), constituyen la fuente primaria de energía y son recursos no renovables, por lo que
tienen gran impacto social y ambiental. Por esta razón, el desarrollo de fuentes alternativas
de energía se convierte en una cuestión estratégica, sobre todo considerando que nuestro
país esta en vía de ser un importador de crudo y gas. En este marco, la síntesis de biodiesel
catalizado por lipasas, ha despertado gran interés en los últimos años (Shah & Gupta, 2007;
Park et al. 2008). La ruta más común para la síntesis de biodiesel es por reacciones de
transesterificación de aceites vegetales con metanol o etanol, mediante la acción de un
catalizador homogéneo, generalmente hidróxidos de metales alcalinos. Sin embargo, el
mayor inconveniente con el empleo de los catalizadores homogéneos en aplicaciones
industriales, es la necesidad de separar dicho catalizador del producto formado en la misma

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fase. Los esfuerzos dirigidos para mejorar los procesos de producción de biodiesel han
centrado su atención en el uso de catalizadores heterogéneos como ruta alternativa,
facilitando así la etapa de separación del producto. En este sentido, se observó que las
lipasas de Aspergillus niger MYA 135 poseen una elevada estabilidad en mezclas de
reacción que contiene metanol o etanol (Romero et al. 2007), lo que podría resultar muy
promisorio para su potencial empleo en la síntesis de biodiesel (Yang et al. 2009).
Debido a que las propiedades catalíticas de las lipasas pueden ser modificadas no solo por
variaciones en las condiciones de reacción sino también por modificaciones en las
condiciones de producción del biocatalizador, en este trabajo se evalúa la performance de
una actividad lipasa, constitutiva e inducible, de A. niger MYA 135 producida bajo diferentes
condiciones de cultivo en la transesterificación del etanol. Estos ensayos podrían sentar las
bases y constituir el punto de partida para su posterior aplicación en la síntesis de biodiesel.

Materiales y Métodos
Microorganismo y Mantenimiento
Aspergillus niger ATCC MYA 135 perteneciente a los cultivos de colección de PROIMI
(Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos) es una cepa aislada y caracterizada
por el grupo de trabajo; y se empleó para realizar estos estudios. La cepa fue mantenida en
glicerol al 20 % a -20º C. Para la obtención de los conidios el microorganismo fue cultivado
en agar-papa-glucosado (apg) a 30º C y conservado a 4º C. Los repiques en apg fueron
realizados mensualmente, a fin de mantener un stock del cultivo.
Medio de Fermentación y Condiciones de Cultivo
Los cultivos se realizaron en un Medio Base (MB) cuya composición (en g/l) se detalla a
continuación:
Sacarosa.............................................................10,0
KH2PO4...............................................................1,0
NH4NO3..............................................................2,0
MgSO4.7H2O......................................................0,2
CuSO4.5H2O.......................................................0,06
pH 5

Todos los parámetros morfológicos y metabólicos determinados en MB a pH inicial 5 y 30°

C, fueron considerados como control o referencia. Las modificaciones en las condiciones de
producción del biocatalizador se realizaron por variaciones del pH inicial del medio (2 a 8),
la temperatura de crecimiento (25 a 37º C) o por la adición de Ca+2 (0,5 g/l) o Fe+3 (1,0 g/l) al
MB. A su vez, cada condición fue ensayada tanto en ausencia (Actividad lipasa constitutiva)
como en presencia de un 2 % de aceite de oliva (Actividad lipasa inducible).

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Producción Enzimática
Los conidios de entre 10 a 15 días de edad fueron cosechados a partir de un cultivo en apg
para preparar una suspensión estandarizada de los mismos (aproximadamente 106
conidios/ml) en agua bidestilada estéril. Posteriormente, los medios de cultivo fueron
inoculados con la suspensión de conidios, a una concentración final de 105 conidios/ml.
Finalmente, los cultivos se incubaron en agitador rotatorio a 200 rpm.
Transesterificación Enzimática
La producción de actividad lipasa ligada a la biomasa de A. niger MYA 135 se determinó
sobre la base de su actividad hidrolíca según Winkler y Stuckman (1979). La actividad
sintética se determinó en n-hexano, usando p-nitrofenil palmitato (pNPP) como acil dador,
según la metodología propuesta por Romero et al. (2007). Para los ensayos de síntesis, en
el momento de la máxima producción, los micelios fueron cosechados, lavados y filtrados
para luego ser sometidos a los ensayos de transesterificación del etanol. Las reacciones se
llevaron a cabo a 37º C y la absorbancia del p-NP liberado se midió a 405 nm previa
extracción con Na2CO3 0,25 M antes de la lectura.
Determinación de Biomasa
Para determinar la concentración de biomasa, al final de cada período de cultivo los
micelios se recuperaron por filtración, utilizando discos de papel de filtro (Whatman Nº 1). A
continuación los micelios fueron lavados repetidamente con agua destilada y secados a
105º C hasta peso constante.

Observaciones Morfológicas
Los patrones morfológicos obtenidos en cada caso fueron caracterizados determinando la
morfología del crecimiento como también el diámetro medio de los pellets formados, cuando
esto corresponda.
Análisis Estadísticos
Los análisis estadísticos se realizaron empleando los programas Infostat (versión 2004;
Grupo Infostat, FCA, Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba, Argentina) y Minitab
(versión 14, Minitab Inc.). Los resultados fueron expresados como la media ± la desviación
standard. Las diferencias significativas entre las medias para un 95 % de confianza
(P<0,05) fueron determinadas empleando el análisis de la varianza (ANOVA).
Resultados
Efecto de las Condiciones de Cultivo sobre la Morfología del Crecimiento
La Fig. 1 muestra la morfología del crecimiento de A. niger MYA 135 cultivado en MB bajo
diferentes condiciones de pH inicial, temperatura de crecimiento y presencia de Ca+2 o Fe+3
en el medio (Colin et al. 2008). Cabe destacar que el suplemento de aceite de oliva, no
produjo modificaciones importantes en la morfología del crecimiento.

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Figura 1. Morfologías del crecimiento de A. niger MYA 135 en MB bajo diferentes condiciones de cultivo.

Aunque dentro del rango de temperaturas ensayadas solo se formaron pellets, las
modificaciones del pH inicial como el suplemento de ciertos iones al medio de cultivo,
promovieron el desarrollo de patrones morfológicos variados, desde la formación de pellets
de distintos diámetros hasta un crecimiento típicamente filamentoso.
Con respecto a la influencia del pH inicial, se observó que la aglomeración de esporos no se
vio favorecida a valores de pH muy ácido. De esa forma, mientras que a pH inicial 2 se
obtuvo un desarrollo filamentoso, a partir de pH 3 comenzaron a observarse pequeños
agregados de micelio en el caldo de cultivo, los que aumentaron su tamaño conforme se
incrementó el pH del medio. Por su parte, el aumento en la temperatura de crecimiento tuvo
un efecto negativo sobre el tamaño de los pelles formados. Así, el diámetro medio a 37º C
fue sustancialmente menor que el observado a 30º C.
Finalmente, el suplemento de Ca+2 o Fe+3 al MB, afectaron de modo significativo la
morfología del crecimiento. Mientras que en presencia de Ca+2 los pellets formados fueron
aproximadamente 10 veces más pequeños que los desarrollados en la condición de
+3
referencia, el micelio crecido en presencia de Fe adoptó un patrón típicamente
filamentoso, cuyas hifas se dispusieron regularmente distribuidas en el medio.
Efecto de las Condiciones de Cultivo sobre la Concentración de Biomasa
En la Fig. 2 se observa el efecto de los factores ambientales sobre la concentración de
biomasa al final de cada período de cultivo. Si bien la morfología del crecimiento no fue

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significativamente afectada por el suplemento de aceite de oliva al medio, el crecimiento

fúngico si se modificó por la presencia del sustrato lipídico.

Figura 2. Concentración final de biomasa de A. niger MYA 135, producida en MB a diferentes condiciones
ambientales ya sea en presencia (■) o en ausencia de aceite de oliva al 2 % (■). Las barras con diferentes letras,
(A-H) en ausencia y (a-h) en presencia de aceite de oliva, representan diferencias significativa (P<0,05). Las
barras de error corresponden a la desviación estándar calculada a partir de tres ensayos independientes.

En cuanto al crecimiento observado en ausencia de aceite, los valores óptimos se

observaron en el rango comprendido entre 6 y 7, donde la concentración de biomasa
aumentó significativamente en comparación al control (P<0,05). Por su parte, los cambios
en la temperatura de incubación y el suplemento de Ca+2 o Fe+3 al MB, también afectaron el
crecimiento fúngico. A 25 y 37º C la concentración de biomasa cayó sustancialmente con
respecto al crecimiento obtenido a 30º C. Por el contrario, el suplemento de Ca+2 o Fe+3 al
medio de cultivo produjeron un incremento importante en la concentración de biomasa,
cuyos valores fueron de 11,5 y 13,8 g/l, respectivamente.
Finalmente, en presencia de aceite el crecimiento fúngico aumentó aproximadamente 1,5
veces, con respecto a sus contrapartes sin aceite, sugiriendo el empleo del sustrato lipídico
como una fuente de carbono.
Aplicación de las Lipasas Producidas en la Transesterificación del Etanol
Con el objeto de analizar las potenciales aplicaciones de la actividad lipasa asociada a la
biomasa de A. niger MYA 135 en la síntesis de biodiesel, se evaluó la performance de dicho
catalizador, desarrollado en diferentes condiciones ambientales, en la transesterificación del
etanol, usando pNPP como acil dador (Fig. 3). En nuestras condiciones de ensayo, la
actividad lipasa ligada a la biomasa, producida en el rango de pH inicial de 2 a 8, fue capaz
de catalizar la síntesis de etilpalmitato. Sin embargo, la actividad de transesterificación
constitutiva fue máxima cuando el micelio fue producido a pH inicial 3 o 7, mientras que las

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mayores actividades sintéticas de los micelios crecidos en presencia de aceite de oliva se

observaron a pH inicial 5 y 8.

Figura 3. Transesterificación en n-hexano del etanol con p-NPP, empleando las lipasas ligadas al micelio de A.
niger MYA 135 producidas en MB, ya sea sin aceite (barras vacías) o con aceite de oliva al 2 % (barras llenas).
Las barras con diferentes letras, (A-G) para la actividad constitutiva y (a-d) para la actividad inducible,
representan diferencias significativa (P<0,05). Las barras de error corresponden a la desviación estándar
calculada a partir de tres ensayos independientes.

En cuanto al efecto de la temperatura de crecimiento fúngico, se observó actividad de

transesterificación en presencia de biocatalizador desarrollado en todo el rango de
temperatura ensayado. Sin embargo, los perfiles de transesterificación fueron, una vez más,
muy diferentes según el catalizador se desarrolle en presencia o ausencia de aceite de
oliva. Mientras que el aumento en la temperatura de crecimiento micelial tuvo un efecto
positivo sobre la actividad sintética constitutiva resultante, alcanzando su máximo valor
cuando se cultivó a 37º C, los micelios crecidos en presencia de aceite de oliva mostraron
una respuesta catalítica opuesta. En este caso, la mayor actividad de transesterificación se
detectó cuando se usó el catalizador desarrollado a 25º C.
Con respecto al suplemento de los iones Ca+2 o Fe+3 al MB, el comportamiento de las
lipasas constitutivas e inducibles también fue diferente. Para las fuentes enzimáticas
producidas en ausencia de aceite de oliva, el mejor rendimiento en la transesterificacón del
etanol estuvo asociado al micelio crecido en presencia de Fe+3. Sin embargo, la adición del
mismo al MB no favoreció la actividad sintética inducible. Finalmente, la actividad de
transesterificación utilizando el biocatalizador desarrollado presencia de Ca+2 no se vio
mayormente favorecida.
De acuerdo a nuestros resultados, la capacidad catalítica de las lipasas de esta cepa fue
sustancialmente modificada por las condiciones de producción del biocatalizador. En este

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sentido, las mejores actividades sintéticas se asociaron a los micelios producidos en

ausencia de aceite de oliva. Además, es interesante destacar que la adición de Fe+3 al MB
mejoró la actividad constitutiva de transesterificación en un 71 %, comparada a la actividad
informada previamente para esta cepa (Romero et al. 2007).
Como se hace referencia en numerosos trabajos (Papagianni, 2004; Wagner et al. 2004;
Hsieh et al. 2005; 2006), el control de las formas de crecimiento es de gran importancia en los
procesos biotecnológicos que utilizan organismos morfológicamente complejos como los
hongos filamentosos. En cuanto al desarrollo filamentoso, si bien este patrón trae apareado
los problemas relacionados con la elevada viscosidad de los cultivos y otras limitaciones
prácticas; afortunadamente existen diversas técnicas de inmovilización de células
microbianas. Las técnicas de inmovilización celular se refieren a sistemas o técnicas en las
que existe un confinamiento físico o localización de los microorganismos, lo que permita su
posterior reutilización (Anderson, 1975). El interés inicial en las células inmovilizadas, fue
debió a su utilización como alternativas de ciertas enzimas inmovilizadas, ya que el empleo
de células enteras evita los tediosos y costoso procesos de aislamiento y purificación
enzimática.
En un principio, la mayoría de los esfuerzos estuvieron dirigidos a la inmovilización de las
células bacterianas. Luego, tanto levaduras como hongos filamentosos comenzaron a recibir
cada vez mayor atención (Anderson, 1975). Finalmente en la década del 90´, se reconoció el
valioso potencial de las células inmovilizadas de los hongos filamentosos para la producción
de ciertos metabolitos como los ácidos orgánicos (Federici & Petruccioli, 1997; Vassilev &
Vassileva, 1992; Vassilev et al. 1993) y enzimas tales como la glucosa oxidasa (Fiedurek &
Ilczuk, 1991) y la glucoamilasa (Abraham et al. 1991). Desde entonces, varios materiales y
métodos se han utilizado para la inmovilización de células microbianas, incluyendo
adsorción, atrapamiento, enlaces cruzados, y enlaces covalentes. Sin embargo, los dos
primeros son los de uso más frecuente (Federici & Petruccioli, 1997; Vassilev & Vassileva,
1992; Arica et al. 1993).
El empleo de células inmovilizadas de los hongos tienen varias ventajas sobre las células
dispersas, como su fácil separación del medio líquido y la reducción de la viscosidad del caldo
de cultivo (Thongchul & Yang, 2003). Por otra parte, la inmovilización protege a las células de
daños potenciales dando lugar a una mayor productividad volumétrica (Vassilev & Vassileva,
1992; Fiedurek & Ilczuk, 1991; Abraham et al. 1991). Otra ventaja observada con las técnicas
de inmovilización es la reducción de la actividad proteasa. En este sentido, Liu et al. (1998)
estudió el efecto de la inmovilización de células de A. niger (ATCC 13496) en la inhibición de
la secreción de proteasas, encontrando que la máxima actividad específica extracelular, se
redujo de 129 a 28 unidades/g de peso seco. Sin embargo y pese a lo expuesto hasta aquí, la
aplicación de las técnicas de inmovilización de células en la industria, tiene también sus

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limitaciones. Por un lado, el proceso de inmovilización puede resultar costoso, sumado a las
limitaciones de transferencia de masa, lo que puede tener un efecto importante en la fisiología
y la cinética de las células. Además, las limitaciones en la transferencia del oxígeno son
consideradas una de las desventajas más graves en un cultivo de células inmovilizadas.
Afortunadamente, el crecimiento de hongos en forma de pellets puede ser considerado como
un sistema de auto-inmovilización de los microorganismos (Anderson, 1975; Xu et al. 2000),
donde se superan los problemas asociados a la inmovilización artificial, siempre y cuando el
tamaño de los mismos se mantenga por debajo del diámetro crítico. En este sentido, si bien
en muchos casos los mejores rendimientos de un determinado metabolito se a asociaron a
una crecimiento filamentoso, podría resultar adecuado realizar un balance costo-beneficio a la
hora de fijar las mejores condiciones de trabajo.
Conclusiones
Bajo nuestras condiciones de ensayo se observó que tanto la morfología del crecimiento y
la concentración de biomasa, como también la capacidad catalítica de la actividad lipasa en
términos de actividad sintética, fue sustancialmente modificado por las condiciones de
producción del biocatalizador. Sobre la base de nuestros resultados, se propone que las
lipasas constitutivas de A. niger MYA 135 podrían ser potenciales candidatos para su uso
en la producción de biodiesel, entre otras aplicaciones biotecnológicas. Por lo tanto, nuestro
próximo objetivo es diseñar reactores enzimáticos para la síntesis de biodiesel, usando las
lipasas ligadas a la biomasa de esta cepa.

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