Informe de extracción de ADN

GUÍA PRÁCTICA

CURSO:

BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

DOCENTE:
EDGAR NEYRA VALDEZ

INTEGRANTES:
 SUMMER

 KEVIN OBANDO BALLARDO

 RICARDO RAMOS QUISPE

 KATHERINE LUGO BARDALES

 Introducción

Objetivos:

Marco Teórico:
Fundamento científico

La saliva arrastra las células del epitelio que recubre las paredes internas de la boca y que
se están desprendiendo constantemente. La sal común (NaCl), con esa concentración, es
un medio hipertónico que provoca el estallido de las células y los núcleos, quedando libre
las fibras de cromatina. El detergente cumple la misión de formar un complejo con las
proteínas histonas y separarlas del ADN.

Colecta de la muestra

Obtener una muestra de sangre puede resultar tremendamente estresante y doloroso para
el paciente, y especialmente complicado en el caso de niños, ancianos, pacientes
psiquiátricos.
Una vez obtenida la muestra, surge otro hándicap, y es el transporte y almacenamiento de
la misma, necesitando realizar los envíos con hielo seco y a temperatura controlada y
almacenarlas refrigeradas y/o congeladas.

Por el contrario, la utilización de muestras de saliva para extracción de ADN nos permite:

 Simple recogida de la muestra y fácil manejo

 No invasivo, indoloro para el paciente
 No genera ansiedad en los pacientes, facilitando el reclutamiento
 La muestra es estable a temperatura ambiente, lo que permite el transporte por correo
ordinario así como el almacenamiento sin necesidad de refrigeración/congelación (esto
cobra especial relevancia en el caso, por ejemplo, de estudios multicéntricos).
La reducción de costes al utilizar saliva frente a sangre, que queda demostrada en
diversos estudios, impacta a distintos niveles:

 Recogida de la muestra: No es necesario que el paciente se traslade al centro

médico para la recogida. Se evitan además los costes asociados el personal
especializado para realizar la flebotomía
.
  Envío de la muestra: el envío se realiza a temperatura ambiente, evitando los
cargos por envío en hielo seco y reduciendo el tamaño del paquete.
 Almacenamiento de la muestra: la muestra es estable a temperatura ambiente,
evitando costes asociados a la congelación/refrigeración

Cuando se trata de material genómico, el ADN obtenido a partir de saliva debe rendir en la
misma medida que lo hace el obtenido a partir de una muestra de sangre.

Perspectivas
Uno de los objetivos principales de los métodos modernos de extracción es automatizar el
proceso, mediante el uso de kits y extractores automáticos robotizados con la mínima
intervención de operadores, que permitan mejorar la precisión, obtener resultados
reproducibles y reducir el tiempo de extracción, en particular cuando se requiere procesar
una gran cantidad de muestras. De esta manera se favorece que los investigadores se
enfoquen en analizar e interpretar la gran cantidad de datos genómicos obtenidos. La
extracción de ADN íntegro y sin contaminantes es esencial para tener éxito en la obtención
de datos genéticos, es el primer paso en la lista de técnicas moleculares que nos llevarán a
comprender mejor y conservar la diversidad biológica a partir del conocimiento de genes y
genomas que anteriormente era inaccesible para le ecología y la evolución.

Procedimientos:
1. Preparar en un tubo de ensayo con Etanol absoluto por cada alumno y poner a enfriar lo
máximo que sea posible (-20°C).

2. Poner un 20mL de agua en un vaso y enjuagarse la boca enérgicamente durante al

menos medio minuto para arrastrar el mayor número posible de células de descamación
de la mucosa bucal (antes de hacerlo conviene haber tragado saliva para eliminar la
acción de los enzimas contenidos en ella).

3. Mientras tanto pondremos 20mL de tampón de Lisis (EDTA, SDS, Tris SHDL y HCl) y
2mL del Sol NaCl 3M (precipita el ADN) en el mismo vaso.

4. Expulsar el agua en el vaso de precipitados sobre la solución anterior. Dejaremos actuar

durante unos 10 minutos, removiendo de vez en cuando suavemente para disolver estos
componentes evitando la formación de espuma.

5. A continuación, añadir la solución suavemente al tubo de ensayo que contiene el alcohol

muy frío dejándola resbalar por la pared del tubo inclinado. El filtrado, más denso que el
alcohol y algo turbio, se deposita en el fondo del tubo. Dejar reposar durante 2 ó 3
minutos sin moverlo en absoluto. El alcohol formará un sobrenadante por encima de la
fase acuosa, en la que se encuentra el ADN en disolución, provocando que éste
precipite.

6. Esperar unos minutos mientras el ADN precipita en la interfase alcohol-agua formando

una masa blanquecina que asciende lentamente formando un grumo de aspecto
algodonoso.

7. Tras unos minutos de reposo, el ADN tiende a subir hacia la superficie del alcohol.

8. Entonces podremos recogerlo utilizando una varilla de vidrio, una pipeta Pasteur o
simplemente un palillo. Para ello, se introduce en la masa de ADN y se extrae
suavemente mientras se hace girar entre los dedos.
 9. Entretanto habremos preparado los tubos de microcentrífuga con 1mL de alcohol de 70º.

10. Una vez extraído el ADN podemos suspenderlo en el tubo de microcentrífuga y a

proceder a realizar un par de lavados con alcohol al 70%.

Resultados:
El ADN obtenido a partir de saliva debe rendir en la misma medida que lo hace el obtenido
a partir de una muestra de sangre. La diferencia está en las enzimas y/o bacterias
naturalmente presentes en la saliva, que pueden alterar y degradar ese material genético

La saliva arrastra las células del epitelio que recubre las paredes internas de la boca y que
se están desprendiendo constantemente. Durante el enjuague el agua ha recogido las
células que se desprenden de las encías, las paredes de la boca, la lengua, etc. Para poder
acceder al ADN primero tenemos que acceder al núcleo de la célula y para eso es necesario
romper la membrana plasmática. Después debe romperse la membrana nuclear, para dejar
libre el ADN. Por último debemos proteger el ADN de enzimas que puedan destruirlo y para
aislarlo hay que hacer que se precipite en alcohol. La sal común (NaCl), con esa
concentración, es un medio hipertónico que provoca el estallido de las células y los núcleos,
quedando libre las fibras de cromatina. El detergente cumple la misión de formar un complejo
con las proteínas histonas y separarlas del ADN. El ADN es soluble en agua pero cuando
se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interface alcohol – agua. El alcohol
también separa el ADN de otros componentes celulares que son dejados en la solución
acuosa. En realidad el procedimiento descrito es para separar ácidos nucleicos, por lo que
obtenemos una mezcla de ADN y ARN.

El producto filamentoso obtenido de la extracción no es ADN puro ya que, entremezclado

con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción "profesional" se realiza añadiendo enzimas
que fragmentan las moléculas de ARN e impiden que se unan al ADN. El ADN se precipita
en el alcohol fuera de la solución, donde puede ser visto. Además de permitirnos ver el ADN,
el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la
solución acuosa.

Una vez obtenido el material genético, es importante determinar el rendimiento mediante

espectrofotometría. La ley de Beer-Lambert indica que la concentración de una molécula en
solución depende de la cantidad de luz absorbida de las moléculas disueltas. Una
característica del ADN es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm y permite estimar su
concentración mediante espectrofotometría. Cuando la longitud de la celda en que se
disuelve el ADN, es de 1 cm, la absorbancia es igual a la densidad óptica (DO).

Cuantificación de ADN Las muestras de ADN se cuantificaron por espectrofotometría en un

equipo Nanodrop de baja retención con un micro litro de muestra, usando como blanco agua
libre de nucleadas. Se hacen las lecturas a diferentes longitudes de onda para verificar si
hay contaminación además de los ácidos nucleicos (260nm). A 280nm se verifica
contaminación de proteínas, a 320nm algunos compuestos inorgánicos, a 230 nm
carbohidratos. Se determina el factor de 260/280nm que se desea de 1.8-2.0 para una buena
calidad del ADN. En el equipo solo se debe visualizar un pino de lectura a 260nm.

La calidad del ADN obtenido a partir de muestras de saliva fue muy buena. Esto se basa en
el coeficiente de las absorciones a dos longitudes de onda 260/280nm. En la mayoría de las
muestras obtuvimos valores mayores o iguales a 1.8. Esto nos habla de que no hay
contaminantes como proteínas.
 Conclusiones:
 Al realizar adecuadamente el procedimiento sobre extracción del ADN pudimos
observar la estructura fibrilar del ADN y su cuantificación.

 El producto filamentoso obtenido de la extracción no es ADN puro, ya que

entremezclado en el existen pequeños pedazos de propinas y ARN.

Cuestionario
1. Describa cuáles son los pasos comunes para la extracción de ADN a partir de
células/tejidos.

Disgregación o Fragmentación del tejido

Lisis celular Tampón o buffer

ta

Clarificación

Purificación

Los pasos básicos involucrados en la extracción de ADN de células y tejidos animales son los
mismos que los descritos en la introducción y para los microbios. Sin embargo, los kits necesitan
incorporar modificaciones para tener en cuenta las características especiales de las células
animales. El cultivo y la preparación de células animales son a menudo diferentes de los
utilizados para células microbianas. La mayoría de las células animales no tienen pared celular
como las células microbianas, y consecuentemente, son más fáciles de lisar y pueden ser lisadas
utilizando sólo detergentes. Sin embargo, el tejido animal necesita primero ser homogeneizado
mecánicamente o tratando con enzimas para ser lisado. La lisis celular es seguida de la
separación del ADN de otros componentes celulares, y su purificación.

2. Mencione y describa el principio de los métodos comúnmente usados para la

extracción y purificación de DNA

Extracción:

Lisis por ruptura mecánica y extracción con disolventes orgánicos

Cuando se realiza el lisado de las células mediante un proceso mecánico se tiene que tener
en cuenta la posibilidad de ruptura de las moléculas de ADN, las cuales se tratan de separar
para logar la lisis de las células pero con el cuidado debido para proteger el ADN. Este
método puede ser usado para extraer ADN de material crudo, liofilizado o congelado, que
puede romperse con un mortero, por congelación-descongelación o usando ultrasonidos.

Método de salting-out
Se pueden separar las moléculas de proteínas y otros contaminantes del ADN mediante la
adición de altas concentraciones de sal a partir de un lisado celular las cuales permiten
disminuir la solubilidad de las moléculas orgánicas en la fase acuosa.

Uso de la proteinasa K y el dodecilsulfato de sodio

Debido a la digestión de la muestra se puede realizar la extracción del ADN con proteinasa
K, la cual es activada por el dodecil sulfato de sodio. La proteinasa K inactiva las DNAsas
presentes en el lisado celular usando detergente aniónico el SDS

Uso de resinas de intercambio iónico

Para la extracción del ADN también se han diseñado resinas que son capaces de formar
complejos con el ADN. El uso de resinas hidrocarbonadas con estructuras rígidas en tres
dimensiones permite que la superficie se encuentre cargada con alguna sustancia como el
dietilaminoetilo que puede protonarse en medio ácido y quedar cargado positivamente por
lo que interacciona con los grupos fosfatos del ADN.

Purificación

Cromatografía de intercambio iónico.

El mecanismo básico es el intercambio reversible de los iones en solución con los grupos
funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina.

Por ejemplo, un ácido nucleico con carga negativa a pH 7 se une a un intercambiador iónico
con grupos cargados positivamente, pero eludirá de la columna al cambiar al pH del tampón
ya que los iones del tampón de elución interaccionan con los grupos cargados del ácido
nucleico o del intercambiador iónico. Se empieza eludirse de la columna las moléculas
cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y luego se añade el tampón
de elución, eludirán las moléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga
negativa neta.

Cromatografía de adsorción.

Se basa en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos en presencia de sales

caotrópicas. Bajo condiciones nativas, los ácidos nucleicos están recubiertos de una capa
hidratante de moléculas de agua que mantienen la solubilidad del DNA en soluciones
acuosas. Con la adición de iones caotrópicos a los ácidos nucleicos, se destruye esta
ordenada estructura de moléculas de agua de la capa hidratante, por lo que las sales
caotrópicas crean un entorno hidrofóbico alrededor del DNA

Con esta tecnología, no se produce ningún efecto sobre las moléculas de los ácidos
nucleicos ya que la unión intramolecular de los mismos no es de naturaleza hidrofóbica. Con
este rápido proceso de purificación mediante la tecnología de la adsorción-desorción sobre
membranas de sílica, se obtiene ácidos nucleicos altamente purificados y listos para usar
en procesos posteriores como PCR, RT-PCR, QPCR, secuenciacion, blotting, clonaje, etc.

3. ¿Cuál es la función del NaCl en la extracción de DNA?

El NaCl es utilizado al momento de extraer el DNA, debido a que se encarga de romper

membranas y paredes celulares dejando libre los componentes celulares incluyendo el DNA.
La sal rodea las moléculas de ADN impidiendo que se mezclen con otros restos o
componentes celulares.

4. Explique ¿por qué y cómo el ADN precipita con la adición del alcohol frío?
El ADN es una molécula polar, pero la reacción con el etanol a muy bajas temperaturas hace
que se vuelva apolar e insoluble en el etanol formándose un precipitado justo entre la capa
con etanol líquido y la capa con el extracto.

El ADN es el único componente de la solución que no es soluble en el etanol, y hace visible

porque las diferentes cadenas se van aglutinando entre si al precipitar debido a la acción de
fuerzas físicas. El alcohol es menos denso que el agua del extracto y por eso flota sobre la
capa del extracto.

El protocolo de extracción de ADN indica el uso del alcohol frio para hacer precipitar el
material. Esto se realiza al final del proceso donde uno quiere concentrar el material que
venimos limpiando con otras sustancias.

Referencias URL
Extracci%C3%B3n-de-ADN-del-epitelio-bucal.pdf
http://www.labome.es/method/DNA-Extraction-and-Purification.html