Abstrk

Heparinoid umumnya digunakan untuk pengobatan thrombophlebitis superfisial, suatu kondisi di

mana peradangan dan pembekuan terjadi di vena di bawah permukaan kulit. Namun, stratum
korneum adalah penghalang utama yang membatasi pengiriman heparinoid hidrofilik, di dalam dan di
kulit. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan formulasi topikal yang tidak mengiritasi
untuk heparinoid yang menggabungkan peningkat penetrasi kimia dan menyelidiki pengiriman
heparinoid melintasi epidermis manusia menggunakan sel difusi Franz vertikal in vitro. Nanoemulsi
minyak-dalam-air yang dikembangkan (NEs; NE-1 dan NE-2) menghasilkan jumlah heparinoid yang
lebih tinggi (masing-masing 91,58 ± 25,75 mg / sq.cm dan 62,67 ± 5,66 mg / sq.cm) setelah 72 jam
dibandingkan dengan formulasi lain yang dikembangkan, yang pada gilirannya juga memberikan
jumlah yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan formulasi komersial: krim (1,78 ± 0,07 mg / sq.cm),
salep (9,95 ± 4,41 mg / sq.cm), dan gel (0 mg / sq. cm) (p <0,05). Mikroskop elektron transmisi,
mikroskop cahaya polarizing, dan penelitian hamburan cahaya dinamis dilakukan untuk
mengkarakterisasi struktur mikro NEs ini dengan peningkat kimia. NE-1 diuji untuk menjadi nonirritant
dengan viabilitas sel yang lebih besar dari 50% dan pelepasan IL-1a minimal dengan menggunakan
model "in vitro Epiderm tissue". Hasil kami menunjukkan bahwa formulasi NE merupakan strategi
potensial untuk menyediakan terapi lokal untuk pengobatan thrombophlebitis superfisial.

Intro

Heparinoid adalah turunan dari heparin dan memberikan efek antikoagulan yang sama seperti
heparin. Mereka memblokir jalur pembekuan darah dengan mempercepat pembentukan antitrombin
(AT) III, yang menghambat pembentukan dan aktivitas trombin. Heparin adalah antikoagulan yang
paling sering digunakan dan diberikan melalui suntikan untuk pengobatan tromboemboli vena.
Heparinoid umumnya digunakan untuk pengobatan spontan atau thrombophlebitis superfisial yang
diinduksi, suatu kondisi di mana peradangan dan pembekuan diamati di dalam pembuluh darah di
bawah permukaan kulit. Mereka juga telah digunakan secara topikal untuk perawatan kulit kering dan
asteatosis cutis karena mereka memainkan peran penting dalam regenerasi jaringan kulit dengan
merangsang proliferasi jaringan kulit.

Pemberian parenteral adalah rute konvensional untuk pemberian antikoagulan, tetapi memiliki
kepatuhan pasien yang rendah karena invasif dan risiko komplikasi yang terkait dengan fluktuasi
konsentrasi heparin dalam darah. Selain itu, mungkin tidak disarankan untuk menggunakan
antikoagulan secara sistemik untuk kondisi yang relatif kecil seperti tromboflebitis superfisial. Jadi,
antikoagulan antarseluler dan non-invasif akan lebih disukai untuk pengobatan kondisi yang terjadi di
dekat atau pada kulit. Pemberian obat transdermal atau topikal menawarkan alternatif yang menarik
untuk suntikan melalui meminimalkan rasa sakit dan kemungkinan pelepasan obat secara
berkelanjutan. Penyerapan yang buruk dari molekul hidrofilik besar melintasi stratum corneuis
menjadi kendala utama untuk pengiriman heparinoid yang efektif

Dalam penelitian ini, kami berhipotesis untuk mengembangkan formulasi topikal untuk pengiriman
heparinoid yang efektif di epidermis manusia. Strategi seperti penggabungan peningkat permeasi atau
pengembangan liposom dan nanoemulsi (NEs) telah banyak digunakan untuk meningkatkan
penyerapan perkutan di kulit. Penetapan peningkat penetrasi kimia adalah salah satu pendekatan
yang paling banyak digunakan untuk meningkatkan pengiriman obat topikal dan transdermal karena
mereka murah dan relatif mudah untuk dimasukkan. Peningkat permeasi kimia menawarkan potensi
yang luar biasa untuk meningkatkan transportasi molekul obat dengan mengatasi sifat-sifat penahan
kulit. Mereka dapat mempromosikan difusi zat aktif melintasi penghalang kulit dengan mempartisi diri
menjadi lipid bilayer, mengganggu struktur bilayer lipid dengan mengekstraksi lipid, dan / atau dengan
berinteraksi dengan protein dari kulit dan dengan demikian menciptakan jalur untuk permeasi obat. .
Namun, keampuhan mereka dalam mengganggu penghalang kulit terbatas pada konsentrasi rendah,
dan mereka dapat menyebabkan iritasi pada konsentrasi tinggi. Seringkali, campuran bahan kimia ini
pada konsentrasi yang lebih rendah telah terbukti memberikan permeabilisasi kulit yang tinggi
dibandingkan dengan bahan kimia individu pada konsentrasi yang lebih tinggi, tanpa menyebabkan
iritasi kulit. Kami menghipotesiskan bahwa penggunaan perancah permeasi kulit dapat meningkatkan
permeabilitas kulit heparinoid. , sehingga meningkatkan pengirimannya di kulit. Untuk memungkinkan
penggabungan sejumlah peningkat kimia hidrofilik, lipofilik, atau amfipatik, NE dipilih karena potensi
pelarutannya yang tinggi.

Selain pengiriman obat, penting untuk memastikan keamanan formulasi topikal; karenanya, potensi
iritasi kulit formulasi topikal NE diselidiki. Salah satu model yang umum digunakan untuk merestorasi
iritasi kulit adalah "invitro reconstructed Epiderm tissue" model. Model ini telah secara rutin
digunakan untuk menguji iritasi kulit oleh Pusat Eropa untuk Validasi Metode Alternatif. Jumlah IL-1a
yang dilepaskan dan persentase viabilitas jaringan digunakan untuk mengevaluasi potensi iritasi kulit
untuk NE. Karena iritasi kulit menginduksi aktivasi kekebalan bawaan, jumlah sitokin yang dilepaskan
dapat dihubungkan dengan potensi iritasi dari formulasi. Iritasi kulit memicu pelepasan sitokin dan
kemokin, dengan IL-1a menjadi salah satu indikator. Dengan demikian, dalam penelitian ini, IL-1a
digunakan sebagai penanda potensial untuk iritasi kulit. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
mengembangkan formulasi berbasis NE baru yang mengandung peningkat kimia untuk pengiriman
dermal heparinoid dan menyelidiki permeasi in vitro dan potensi iritasi kulit. Formulasi topikal yang
dikembangkan juga dibandingkan dengan formulasi topikal konvensional termasuk gel, krim, dan
salep di pasaran.

Material

Heparinoid (8-16 kDa, pKa ~6.5) was provided by Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd. (Osaka, Japan).
Chromogenix Coatest Heparin kit was purchased from Diapharma Laboratories (West Chester, OH).
Ammonium hydroxide, acetic acid, 96-well plates, Tween 80, Span 20, propylene glycol (PG), and
isopropyl alcohol (IPA) were obtained from Thermo Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ). Oleyl alcohol, N-
methyl-2-pyrrolidone (NMP), triethanolamine, and isopropyl myristate (IPM) were purchased from
Millipore Sigma (Burlington, MA). Phosphate-buffered saline (PBS) (pH 7.4) and ethanol were
purchased from MedSupply Partners (Atlanta, GA). Oleic acid (OA) was a gift sample from Croda Inc.
(Snaith, UK). Dermatomed human skin was obtained from New York Fire Fighters (New York City, NY)
and deionized water (MQ res: 18.2 MUcm, perm C: 7.4 mS/cm) was generated by Mili-Q Direct 8 Water
Purification System (Millipore Sigma, Burlington, MA). In vitro EpiDerm™ skin irritation test (EPI-200-
SIT) kit was purchased from MatTek Corporation (Ashland, MA). Human IL-1 alpha/IL-1F1, Quantikine
ELISA kit was purchased from R&D Systems (Minneapolis, MN).

Evaluasi Ketahanan Kulit.

Integritas epidermis dievaluasi menggunakan pengaturan listrik yang terdiri dari multimeter digital
(34410A 6 ½ digit multimeter; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) dan generator gelombang
(Agilent 33220A, 20 MHz fungsi / generator gelombang sembarang). Epidermis dipasang pada sel
difusi Franz vertikal, dan PBS (10 mM, pH 7,4) ditambahkan ke reseptor dan kompartemen donor.
Elektroda perak klorida ditempatkan di donor, dan elektroda perak ditempatkan di reseptor. Load
resistor (RL) dihubungkan secara seri dengan kulit, dan tegangan drop-in di sirkuit lengkap (V0) dan di
seluruh kulit (VS) dicatat seperti yang ditampilkan pada multimeter.

Skin resistance (RS) was calculated using the formula:

where RL and V0 were 100 KU and 100 mV

Pengiriman Heparinoid di Epidermis Manusia Dari Formulasi Yang Berbeda: Larutan Berair, Saraf, dan
Formulasi yang Dipasarkan (Krim, Gel, dan Salep).

Pengiriman heparinoid melalui epidermis manusia diselidiki dengan melakukan studi permeasi in vitro
menggunakan sel difusi Franz statis vertikal (PermeGear, Hellertown, PA). Semua formulasi heparinoid
termasuk NE-1, NE-2, dan formulasi larutan berair (F3, F4, F5, F6) dibandingkan dengan formulasi
konvensional yang tersedia secara komersial (krim, gel, dan salep) untuk pengiriman heparinoid di
seluruh epidermis manusia (n ¼ 4 untuk setiap grup). Kompartemen reseptor mengandung 5 mL PBS
yang dipertahankan pada 37 C menggunakan jaket sirkulasi air yang dibangun di sekitar ruang reseptor
untuk membawa suhu kulit hingga 32 C; area difusi efektif adalah 0,64 cm2. Epidermis manusia
dipasang pada perakitan sel difusi Franz dengan stratum korneum menghadap kompartemen donor.
Formulasi (100 mL) diaplikasikan pada kulit di kompartemen donor. Aliquot (300 mL) ditarik dari
kompartemen reseptor pada periode sampling yang telah ditentukan (0, 6, 24, 48, dan 72 jam) setelah
aplikasi formulasi, dan volume yang diambil diganti dengan PBS segar. Deskripsi kelompok yang
digunakan disediakan pada Tabel 2.

Sampel dianalisis oleh Chromogenix Coatest® heparin assay kit setelah pengenceran yang sesuai. Hasil
yang diperoleh dari formulasi kosong (drugfree) dikurangi dari yang diperoleh untuk formulasi uji
untuk memperhitungkan nilai absorbansi dari komponen kulit atau formulasi. Hasil dari percobaan
permeasi diplot sebagai jumlah kumulatif dari obat yang diresapi terhadap waktu.

Studi Ekstraksi Kulit.

Setelah studi permeasi, sampel kulit dikeluarkan dari sel difusi Franz. Permukaan kulit dibersihkan
secara menyeluruh dengan menyeka formulasi dengan Kimwipes® diikuti dengan membersihkan
dengan Q-tips (2x) yang dicelupkan ke dalam buffer reseptor dan akhirnya dengan dry Q-tips (2x).
Ekstraksi kulit kemudian dilakukan untuk menentukan jumlah heparinoid di kulit. Kulit yang terpapar
ke area difusi dipotong-potong kecil menggunakan gunting dan ditempatkan dalam botol kaca 20 mL
untuk ekstraksi dengan PBS. Sampel disimpan pada roller shaker (New Brunswick Scientific Company,
Inc., Edison, NJ) pada suhu kamar (25 C) semalam pada 150 rpm. Supernatan disaring menggunakan
filter 0,45-mm dan kemudian dianalisis.

Pemba

Pengiriman Heparinoid dalam Epidermis Manusia Dari Berbagai Formulasi: NEs, Solusi, dan Formulasi
yang Dipasarkan: Krim, Gel, dan Salep)

Semua formulasi topikal yang dikembangkan diselidiki untuk permeasi heparinoid di dan di seluruh
epidermis manusia. Formulasi ini juga dibandingkan dengan formulasi yang tersedia secara komersial
seperti krim, gel, dan salep. Kelompok drugfree dimasukkan dalam penelitian permeasi in vitro untuk
menguji keberadaan endogen heparinoid pada epidermis manusia. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa tidak ada endogen heparinoid pada epidermis manusia setelah 72 jam pencucian ke dalam
ruang reseptor sel difusi Franz.

Pengiriman heparinoid (0,3% b / b) dari formulasi yang berbeda dalam epidermis manusia
digambarkan pada Gambar 2b. Meskipun semua formulasi dapat memberikan heparinoid di
epidermis, formulasi gel menunjukkan persalinan tertinggi (95,82 ± 2,33 mg / sq.cm). Penambah
permeasi NMP menunjukkan secara signifikan (p <0,05) pengiriman lebih tinggi (9,73 ± 1,53 mg /
sq.cm) di kulit, dibandingkan dengan krim (2,56 ± 0,66 mg / sq.cm) dan salep (2,01 ± 0,30 mg / sq. cm).

Perlu dicatat bahwa retensi kulit heparinoid dari kedua formulasi NE lebih rendah dibandingkan
dengan gel dan formulasi berair lainnya. Retensi Heparinoid dari NE-1 dan NE-2 ditemukan 1,28 ± 0,4
dan 3,28 ± 1,1 mg / sq.cm, masing-masing, yang secara signifikan lebih rendah dari itu dari formulasi
gel Attonon. Namun, jumlah heparinoid adalah serupa dan tidak berbeda secara signifikan antara NE-
1 dan NE-2, bila dibandingkan dengan formulasi krim dan salep komersial konvensional heparinoid.
Tidak ada heparinoid yang terdeteksi pada kulit setelah pengobatan dengan formulasi plasebo NEs.
Formulasi larutan lain, F2 (9,73 ± 1,5 mg / sq.cm), F3 (9,5 ± 2,8 mg / sq.cm), dan F4 (7,43 ± 1,9 mg /
sq.cm), menunjukkan jumlah heparinoid yang lebih tinggi di kulit dibandingkan dengan krim (2,56 ±
0,7 mg / sq.cm) dan salep (2,01 ± 0,30 mg / sq.cm). Jumlah heparinoid yang tersisa di kulit adalah yang
tertinggi untuk gel (95,82 ± 2,3 mg / sq.cm). Retensi kulit yang tinggi dari gel dapat dikaitkan dengan
retensi obat di kulit. Namun, karena situs target pengiriman untuk tindakan terapeutiknya adalah pada
dermis, pengiriman heparinoid di epidermis kurang penting.

Kesimpulan

Komposisi yang tepat dari formulasi NE termasuk jenis dan tingkat fase minyak, surfaktan,
cosurfactant, fase air, dan peningkat permeasi penting untuk mencapai pengiriman ke atau di kulit.
Dalam penelitian ini, kami mengembangkan dan mengkarakterisasi formulasi NE minyak-dalam air
untuk pengiriman dermal heparinoid. Studi permeasi in vitro menunjukkan bahwa aplikasi dari kedua
formulasi NE menghasilkan secara signifikan meningkatkan pengiriman topikal heparinoid di
epidermis dibandingkan dengan formulasi topikal konvensional lainnya (krim, gel, dan salep) (p <0,05).
Selanjutnya, penetrasi heparinoid ditemukan meningkat dengan penggunaan oleyl alcohol dan IPM
sebagai peningkat permeasi dibandingkan dengan peningkat lain. Selain peningkatan permeasi, uji
MTT menunjukkan keamanan dermal dari formulasi NE. Kesimpulannya, formulasi NE dapat menjadi
kendaraan yang menjanjikan untuk pengiriman topikal heparinoid dan alternatif potensial untuk
teknik invasif seperti suntikan untuk pengiriman heparinoid di kulit.