TUGAS

BIOTEKNOLOGI PRODUKSI METABOLIT

“DNA LIGASE”

OLEH:

KELOMPOK III

IIS RAHIMA J 17.01.243

ACHNIS AKBAR JUM 17.01.244
ALVIN REYNALDI RUMIMPER 17.01.266
SURIANA 17.01.272
ANDI ANNISA SAFITRI WULANDARI 17.01.275
M. ERWIN PUTRA HADITYA ATMA 17.01.277
ANNISA FITRI HARDIYANTI 17.01.280
AIDA RANI ALHARI 17.01.281
MEILY AULIANA SARI 17.01.282
IRAWATI UMAR 17.01.288
SITI HARTINA MASHANAFI 17.01.468
SINIATI 17.01.297
ARFAN ABUBAKAR 16.01.387
ARDY TANTIL TAN 15.01.027

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI

MAKASSAR

2018

1
 Dalam teknologi DNA rekombinan ada beberapa enzim yang
digunakan yaitu salah satunya enzim DNA ligase yang digunakan untuk
menyambung DNA. Dalam proses replikasi DNA ada proses yang kita
kenal sebagai ligasi dan tahap ini memerlukan enzim DNA ligase.
Sebelum memahani istilah DNA ligase dalam pemanfaatannya pada DNA
rekombinan dan bioteknologi terlebih dahulu sebaiknya kita memahami
fungsi utama enzim tersebut dalam proses replikasi DNA pada suatu sel.
Pada replikasi DNA, RNA Primer yang awalnya menjadi bagian fragmen
Okazakiakan didehidrasioleh aktivitas eksonuklase 5’ ke 3’ dari enzim flap
endonuclease 1 (FEN1) yang bekerja sama dengan PCNA. Bagian RNA
yang terdegradasi selanjutnya diisi dengan molekul DNA oleh aktivitas
polimerisasi 5’ ke 3’ yang dimiliki oleh DNA polimerisasi 𝜀. Selanjutnya,
terjadi celah antara fragmen Okazaki yang disebabkan oleh belum adanya
ikatan fosfodiester antara ujung 3’-OH pada nukleotida terakhir yang
disintesis oleh DNA polimerisasi 𝜀 dengan ujung 5’-P fragmen DNA yang
ada didekatnya. Celah tersebut akan disambungkan (ligasi) dengan
pembentukan ikatan fosfodiester antara beberapa fragmen Okazaki oleh
aktivitas DNA ligase I yang berhubungan dengan PCNA (Yunita, O, 2016).

Dalam teknik DNA rekombinan pada ilmu bioteknologi juga dikenal

istilah ligasi. Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen
DNA dengan fragmen DNA lainnya atau disebut suatu proses
pengabungan fragmen DNA yang saling berlinear dengan menggunakan
ikatan kovalen, ikatan kovalen yang dimaksud adalah ikatan fosfodiester
antara ujung 3’ dari fragmen yang satu dan ujung 5’ dengan fragmen yang
lain. Di dalam pengklonan gen, DNA insert disambungkan dengan vector
pengklonan. Terdapat beberapa jenis vector, diantaranya vector untuk
bakteri adalah plasmid, phage dan cosmid, serta beberapa vector lain
yang digunakan untuk organisme selain bakteri, yaitu Yeast Artificial
Chromosomes (YAC), Bacterial Artificial Chromosomes (BAC), Plant
Cloning Vectors dan Mammalian Cell Vectors (Barnum, 2005). Faktor

2
yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase. Enzim
ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan fragmen DNA yang
telah dipotong dengan enzim restriksi dengan fragmen DNA vector. DNA
insert (fragmen DNA asing) dipotong pada bagian yang sesuai dengan
bagian pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat saling
berkomplemen. Terdapat dua jenis enzim ligase yang dihasilkan oleh
Escherichia coli, diantaranya T4 DNA Ligase yaitu enzim ligase yang
dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah terinfeksi virus T4 dan E.coli DNA
Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh E.coli sendiri. Kedua enzim
tersebut mempunyai fungsi mensintesis pembentukan ikatan
phosphodiester yang menghubungkan nukleotida yang satu dengan
nukleotida di sebelahnya. Perbedaan dari kedua enzim tersebut hanya
terletak pada kofaktornya, pada T4 DNA Ligase adalah ATP sedangkan
pada E.coli DNA Ligase adalah NAD+ (Muladno, 2002).

Proses ligasi ini dilakukan oleh enzim DNA ligase dengan bantuan
dari ATP. Ligase dapat dilakukan baik pada ujung-ujung sticky end
maupun blunt end, namun proses ligase antara ujung – ujung blunt end
memerlukan konsentrasi enzim DNA ligase yang lebih tinggi daripada
ujung-ujung sticky end. Proses ligase ini merupakan salah satu teknik
penting yang diperlukan dalam melakukan rekombinasi DNA, termasuk
protein, untuk menghasilkan konstruksi DNA yang diinginkan (Buwono,
dkk., 2018).

Enzim DNA ligase ini akan menyambungkan ujung 3’ –OH dengan

ujung 5’ –PO4 melalui tiga tahapan kimia, yaitu :

3
 Gambar 1. Gambar skematis reaksi DNA ligase

1. Ligase bereaksi dengan ATP (atau NAD) untuk membentuk suatu

covalent ligase-adenylate intermediate, dimanan AMP akan berikatan
dengan gugus N dari asam amini lisin yang terdapat dalam enzim
melalui suatu ikatan fosfoamida (P-N)
2. AMP dipindahkan dari ligase menuju ujung 5-PO4 untuk membentuk
suatu DNA adenylate intermediate (AppDNA)
3. Ligase mengkatalis penyerangan 3-OH terhadap ujung dari AppDNA
untuk membentuk suatu ikatan fosfodiester dan melepas AMP
(Buwono, dkk., 2018).

Enzim ligase hanya dapat menggabungkan fragmen DNA yang

mempunyai ujung tidak rata (sticky end) yang saling berkomplemen dan
ujung rata (blunt end). Enzim ligase mengkatalisasi pembentukan ikatan
kovalen antara gula dengan phosphate dari nukleotida yang berdekatan,
yang menghendaki satu nukleotida mempunyai ujung 5’ phosphate bebas
dan nukleotida yang berdekatan mempunyai ujung 3’gugus hidroksil.
Enzim ligase tidak membedakan DNA-DNA dari organisme yang berbeda.
Oleh karena itu, dua fragmen DNA dari organisme yang berbeda pun
dapat digabungkan oleh enzim ini. Kedua fragmen ini kemudian menjadi

4
satu molekul DNA yang disebut sebagai DNA rekombinan. DNA
rekombinan ini tidak dapat dilihat keberhasilannya kecuali dengan
memperbanyaknya di dalam sel inang. Proses ini disebut sebagai
transformasi atau cloning gen (Barnum, 2005).

Ligasi berhasil bila kedua ujung yang akan disambungkan

berkomplemen. Kecocokan yang sangat spesifik dibutuhkan bila fragmen
DNA yang akan disambungkan mempunyai ujung tidak rata (sticky end),
karena penyambungannya harus mengikuti kaidah Chargaff, yaitu T
berpasangan dengan A dan G berpasangan dengan C. Sedangkan
fragmen DNA yang mempunyai ujung rata (blunt end) dapat
disambungkan dengan sembarang fragmen DNA lain yang berujung rata.
Oleh karena itu untuk mengklon suatu fragmen DNA yang spesifik
menggunakan ujung tidak rata sedangkan pengklonan DNA yang tidak
memerlukan spesifikasi tertentu menggunakan ujung rata (Suharsono dan
Widyastuti, 2006).

Contoh penggunaan DNA ligase adalah pada pembuatan DNA

rekombinasi. Seperti pembuatan Tomat-BT yang sangat tahan terhadap
hama dan serangga dibuat melalui teknik DNA rekombinan, dimana tomat-
Bt disandikan oleh gen yang berasal dari bakteri Bacillus thuringiensis
(BT). Jadi,ada beberapa komponen yang digunakan (disebut sebagai
perangkat dan pengangkut) dalam DNA rekombinan tersebut seperti
plasmid bakteri, enzim retriksi, DNA ligase, dan bakteri. Tahap
pemanfaatan enzim DNA ligase dapat dilihat pada gambar berikut :

5
 Dari gambar tersebut diketahui bahwa dalam pembuatan DNA
rekombinan tidak hanya digunakan DNA ligase tetapi ada tahap
sebelumnya yang dibentuk menggunakan enzim dan media lain.
Contohnya enzim retriksi (dalam hal ini diambil contoh EcoRI) akan
mengenali enam urutan basa spesifik dan membuat potongan pada fosfat-
gula, kemudian enzim ini menghasilkan suatu fragmen DNA dengan
ujung-ujung “lengket”. Ujung tersebut akan saling melengket melalui
ikatan hidrogen yang secara “sesaat” menggabungkan menggabungkan
kembali fragmen tersebut dalam susunan rekombinan yang baru. DNA
ligase kemudian dapat mengkatalisis pembentukan ikatan kovalen yang
menyambung ujung-ujungnnya. Jika fragmen tersebut berasal dari sumber
yang berbeda maka dihasilkanlah DNA rekombinan (Campbell, dkk.,
2002).

6
 DAFTAR PUSTAKA

Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd edition. USA:

Thomson Brooks
Buwono, I. D, dkk. 2018. Buku Ajar Teknologi DNA Rekombinan Untuk Perakitan
Konstruksi Vektor Ekspresi Ikan Lele Transgenik. Yogyakarta : CV BUDI
UTAMA

Campbell, N.A, dkk. 2002. Biologi Jilid 1 Edisi 5. Jakarta : Erlangga

Muladno. 2002. Teknologi Rekayasa. Genetika. Bogor: Pustaka
Wirausaha.
Suharsono, Widyastuti U. 2006. Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan
Gen. Bogor: Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi
IPB
Yunita, O. 2016. Biologi Sel Aplikatif Untuk Profesi Kesehatan. Jakarta:
Erlangga