Pruebas de actividad inhibitoria por conteo en placa

Microorganismos

- E. coli

Reactivos y material

- Agar soya Tripticaseína

- Caldo Soya Tripticaseína
- NaCl al 0.9%
- Solución para escala McFarlan
o Ácido Sulfúrico 1%
o Cloruro de Bario 1%

Lista de Material y equipos

- 60 cajas Petri
- 4 Matraz Erlenmeyer de 500mL
- 2 Matraz Erlenmeyer de 125 mL
- 10 tubos pequeños
- 7 tubos grandes
- 2 Agitador magnético
- Micropipeta de 100 a 1000 uL
- Micropipeta de 10 a 100 uL
- Parrilla de agitación y calentamiento
- Spectófotometro UV-vis
- Lámpara UV (254 nm)
- Incubadora a temperatura de 35 °C

Metodología

Paso Descripción

1 Dejar aclimatar la bacteria (E. coli) después de extraerla del congelador (- 20 °C).

2 Preparar medios de cultivo en Placa para hacer dilución por estría, 5 cajas Petri.

2.1 Para preparar 5 cajas Petri se requieren 100 mL de medio Luria Bertani Agar (0.5 g NaCl,
0.5 g de extracto de levadura, 1 g de Peptona de caseína y 1.5 g de Agar). Ya homogénea
la mezcla se esteriliza en un equipo de autoclave a 90 °C por 121 psi. Sacar de autoclave
dejar que enfrié (para poder manipular), vaciar en caja y dejar que solidifique.

2.2 Prepara medio de cultivo caldo se requieren 100 mL de medio Luria Bertani Agar (0.5 g
NaCl, 0.5 g de extracto de levadura, 1 g de Peptona de caseína). Ya homogénea la mezcla
se esteriliza en un equipo de autoclave a 90 °C por 121 psi. Almacenar en el refrigerador a
4 °C.
3 Realizar dilución por estría y dejar encubando a 35 °C durante 24 h, para aislamiento de
bacterias.
4 Realizar tinción de Gram e identificar que la bacteria sea totalmente pura por observación
en microscopio.
5 Ya asegurada la pureza de la bacteria. Utilizar el medio almacenado.
5.1 Prepara medio de cultivo en agar para el no. de pruebas que se van a realizar.
6 Realizar resiembra en medio líquido, esperar 8 hrs de crecimiento y realizar prueba
MacFarlan para obtener una concentración de bacteria de 1.8 x10 8 cell/mL. Se requiere
el uso de un espectrofotómetro para leer la longitud de onda de 625 nm.

6.1 Para realizar la prueba McFarlan se prepara el tubo 0.5 de la escala que contiene BaCl2 al
1% con 0.048 M (pesar 0.005g y disolver en 0.5 mL) y H2SO4 al 1% con 0.18 M (tomar
0.096 mL y adicionarlos a 9.95 mL), agitar vigorosamente y leer en el espectrofotómetro.

7 Preparar la solución que contendrá 0.05 g de nanopartículas , está se suspenderán de 9

mL NaCl al 0.9 % (pesar 0.175 g de NaCl).
9 Preparar una solución de 9 mL con medio de cultivo (caldo Soya Tripticaseína) y
adicionarle 1 mL de inoculó a 1x106 células/mL
10 Realizar una mezcla de 9 mL de NaCl al 0.9 % con nanopartículas y adicionarle 1 mL de
cultivo.
11 Dar tratamiento de nanopartículas con exposición de luz UV a una longitud de onda de
254 nm por 40 min y dejar crecer la bacteria medio de cultivo por 20 h a 35° C. Tomar una
muestra antes de exposición a la luz (tiempo 0 y 40 min). Realizar por duplicado.

9 Realizar una prueba con el mismo tiempo de crecimiento de la bacteria, pero sin
tratamiento de incidencia de luz UV. Tomar una muestra al tiempo 0 y a los 40 min.
Realizar por duplicado.
10 Pasadas las 20 horas realizar conteo por de U.F.C

Resultados

1. Aislamiento de bacteriano

Se prepararon 5 cajas de medio de cultivo, de estás 5 cajas la etiquetada con el no. 4 (figura 1)
contenía un cultivo puro de E. coli, esto se establece por la prueba de Tinción de Gram y
observación al microscopio. Las características de la bacteria son bacilos cortos (cilindros
pequeños), Gram negativos (color rosa).
 Figura 2. figura de cadenas de E.coli.
Figura 1. Dilución por estría y aislamiento de E.coli.

2. De este cultivo se realiza resiembra a un medio de cultivo en caldo Soya tripticaseína y se

esteriliza para realizar pruebas inhibitorias.
3. El cultivo se realizó por primera vez a las 11:30 am y se con concluyó a las 7:30 p.m, que
fue cuando se transcurridas las 7 hrs, se establece la cantidad de células contenidas en el
medio de cultivo, esto se realizó mediante la prueba espectrofométrica McFarlan, que por
medio de un espectrofotómetro UV-vis (Shimadzu 1800 ) se toma la absorbancia a 600 nm
y mediante la escala ya establecida se determinó que se tiene 15x108 UFC/mL.
4. De este cultivo se toma 1 mL y se adicionó a un tubo con contenido de caldo. Después se
adiciona 1 ml de esta solución y se adiciona a los tubos con contenido de NP’s.
5. De las soluciones preparadas se toman 10 uL y se adicionan en cajas de Petri a t=0 min y a
t=40 min sin y con exposición a luz Ultravioleta a 254 nm.
6. Se adiciona agar al final de cada intervalo de tiempo realizando la técnica de caja invertida
y se mezcla homogéneamente y se deja solidificar, al terminó de esto se incuba por 20 hrs
(se retiraron las cajas a las 3 pm del dia siguiente).
7. Lo obtenido es que las cajas a t=0 min no hay presencia de inhibición bacteriana (Figura 3),
al t= 40 min la población disminuye, pero dado que no es gran cantidad no es posible el
conteo (Figura 4).
Figura 3. Crecimiento bacteriano de E. coli con NP’s a t= 0 min. las cajas van ordenadas en concentraciones comenzando
por el testigo.

Figura 4. Crecimiento bacteriano con contenido de NP's con tiempo de exposición a estas por 40 min. El orden de las
cajas es con base en la concentración.
8. Para el t=40 min con exposición se observa una disminución considerable de bacterias
obteniendo una disminución considerable de población bacteriana (Figura 4).

Figura 5. Crecimiento bacteriano con contenido de NP's con tiempo de exposición a estas por 40 min y en presencia de
luz UV a 254 nm. El orden de las cajas es con base en la concentración.

9. Se realizó una segunda prueba bajo las mismas condiciones el cambio que presentó fue
que las cajas que estuvieron a t=40 min con exposición, esta ocasión presentó mayor
cantidad de población bacteriana, aún de este modo se observa la disminución bacteriana
(Figura 5, 6 y 7).
 Figura 5. Crecimiento bacteriano con contenido de NP's con tiempo de exposición a estas por 0 min. El orden de las cajas es con base en la
concentración.

Figura 6. Crecimiento bacteriano con contenido de NP's con tiempo de exposición a estas por 40 min. El orden de las cajas es con base en
la concentración.

Figura 7. Crecimiento bacteriano con contenido de NP's con tiempo de exposición a éstas por 40 min y en presencia de luz UV . El orden de las
cajas es con base en la concentración.

10. Una tercera prueba es realizar una esterilización en seco de las Np´s y adicionarlas al
mismo momento que se adiciona la bacteria, esta prueba ser realiza con exposición de UV
en las NP’s sin bacteria y en estado sólido (Figura 8). La diferencia es que hay mayor
disminución de población bacteriana (Figura 9) cuando la exposición a la luz UV se realiza
en solución de contenido bacteria- NP’s.

Figura 8. Crecimiento bacteriano con contenido de NP's agregadas al mismo tiempo que E.coli y esterilizadas en un horno. El orden de las cajas
es con base en la concentración.
Figura 9. . Crecimiento bacteriano con contenido de NP's agregadas al mismo tiempo que E. coli, esterilizadas en un horno y
con exposición en seco a 40 min de luz UV. El orden de las cajas es con base en la concentración.

11. La observación al microscopio de estas soluciones no muestra ningún cambio entre unas y
otras soluciones dado que el microscopio solo tiene capacidad de observación hasta 200
micras.