BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian dan Rancangan Penelitian

Metode yang digunakan dalam penelitian merupakan true experimental

laboratorium dengan rancangan penelitian eksperimental post test only control

group design. Desain ini bertujuan untuk mengetahui suatu gejala atau pengaruh

yang timbul sebagai akibat dari adanya perlakuan tertentu (Notoamodjo, 2010).
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

3.2.1 Tempat Penelitian

Penelitian akan dilakukan di ruang Laboraturium Terpadu Universitas

Islam Al-Azhar Mataram.

3.2.2 Waktu Penelitian

Waktu penelitian dilakukan pada bulan Desember 2018 - Januari 2019.

3.3 Sampel Penelitian

Sampel yang digunakan adalah ekstrak etanol buah sawo (Manilkara Zapotta)

3.4 Variabel dan Definisi Operasional

3.4.1 Variabel Bebas (Independent variabel)

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak buah sawo

(Manilkara zapotta).

3.4.2 Variabel Terikat (Dependent variabel)

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah pertumbuhan

bakteri Salmonella thypi.

3.4.3 Definisi operasional

3.4.3.1 Bakteri Salmonella Thypi

 Merupakan bakteri patogen bagi manusia dan hewan, yang

proses infeksinya terjadi pada saluran cerna dan menyebar lewat

peredaran darah.

3.4.3.2 Efek Antibakteri

Efek antibakteri merupakan kemampuan suatu zat untuk

membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri atau

mikroorganisme.

3.4.3.3 Buah sawo (Manilkara zapotta).

Sawo merupakan tanaman berbatang keras dan berkayu,

yang memiliki khasiat mampu meningkatkan pembentukan sel

darah merah, karena mengandung asam folat yang juga dapat

mencegah terbentuknya homosistein yang sangat berbahaya bagi

kesehatan.

Senyawa aktif yang terkandung pada Sawo (manilkara

Zapota) antara lain Alkaloid berfungsi sebagai antibakteri dengan

mengganggun komponen penyusun peptidoglikan pada sel baktei

sehingga lapisan dinding sel tidak terbentuk secara utuh dan

menyebabkan kematian sel. Dan Flavonoid berfungsi sebagai

antibakteri dengan cara membentuk senyawa kompleks terhadap

protein extraseluler yang mengganggu keutuhan membran sel

bakteri. Mekanisme kerjanya dengan cara mendenaturasi protein

sel bakteri dan merusak membran sel tanpa dapat diperbaiki lagi.

Serta Tanin bekerja dengan cara mengerutkan dinding sel,

membran sel bakteri dan denaturasi protein dan faktor-faktor yang

dapat menghambat pertumbuhan bakteri meliputi temperatur, pH,

 cahaya dan nutrisi yang terdapat dalam media pertumbuhan bakteri

(Yuliani dkk, 2003).

3.5 Populasi dan Sampel

3.5.1 Populasi

Populasi dalam penelitian ini adalah bakteri Salmonella Thypi.

3.5.2 Sampel

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini Salmonella Thypi.

3.5.3 Besar unit replikasi dan jumlah unit percobaan

Besar sampel yang akan digunakan untuk penelitian menggunakan

rumus Federer :

( t-1 ) ( r-1 ) ≥ 15

Keterangan :

t : jumlah kelompok perlakuan

r : jumlah replikasi

Berdasarkan rumus tersebut, jumlah replikasi :

( t-1 ) ( r-1 ) ≥ 15

( 6-1) (r-1 ) ≥ 15

5 (r-1 ) ≥ 15

r ≥4

Untuk mengantisipasi hilangnya unit eksperimental, maka dikoreksi

dengan faktor koreksi 25% sehingga jumlah unit eksperimental atau sampel

secara keseluruhan adalah 4 sampel.

 Jumlah unit percobaan :

Perlakuan (t) :6

Replikasi (r) :4

txr =6x4

= 24 unit perlakuan (Hanifah, 1997).

3.6 Bahan dan bahan serta metode penelitian

3.6.1 Alat dan bahan

1. Blender

2. Sawo (Manilkara Zapota)

3. Etanol

4. Akuades dan larutan control kloramfenikol

5. Isolat murni Salmonella thypi

3.6.2 Cara Penelitian

3.6.1 Persiapan Penelitian

3.6.1.1 Pembuatan standar kekeruhan Mc Farland dibuat dari campuran asam sulfat 1%

dengan BaCl 1% depan perbandingan sebagai berikut :

Tabel 3.1. Mc Farland Nephelometer Standar

Unit Mc H2SO4 BaCl 1 Perkiraan Jumlah

1% (ml) % (ml)
 Farland Bakteri (jutaan/ml)
0,5 9,95 0,05 150
1 9,9 0,1 300
2 9,8 0,2 600
3 9,7 0,3 900
4 9,6 0,4 1.200
5 9,5 0,5 1.500
6 9,4 0,6 1.800
7 9,3 0,7 2.100
8 9,2 0,8 2.400
9 9,1 0,9 2.700
10 9,0 1,0 3.000
Sumber : (Soemarno, 2000)

3.6.1.2 Pembuatan suspensi Escherichia coli 0,5 unit Mc Farland menurut Soemarno (2000)

sebagai berikut :

1. Diambil satu ujung ose koloni Escherichia coli dari biakan murni.

2. Disuspensikan ke dalam NaCl steril (5 ml), kemudian dibandingkan dengan

standar kekeruhan 0,5 unit Mc Farland.

3. Jika kekeruhannya >0,5 unit Mc Farland lakukan pengenceran sampai kekeruhan

sama dengan 0,5 unit Mc Farland.

3.6.1.3 Ekstraksi daun jambu biji (Psidium guajava Linn)

Proses ekstraksi dalam penelitian ini menggunakan metode modifikasi

ekstraksi refluks dan perendaman. Proses ekstraksi dimulai dengan mencuci bersih

daun jambu biji (Psidium guajava Linn), kemudian dikeringkan tanpa bantuan

matahari. Daun jambu biji (Psidium guajava Linn) yang sudah bersih kemudian

diblender dan disaring sampai menjadi bubuk lalu ditimbang dengan menggunakan

timbangan digital. Tiap 20 gram bubuk daun jambu biji (Psidium guajava Linn)

masing-masing dilarutkan dalam 60 ml pelarut etanol didalam tabung Erlenmeyer

dan direndam selama 24 jam pada suhu kamar. Setelah itu, rendaman bubuk daun

jambu biji (Psidium guajava Linn) tersebut disaring dengan kertas saring. Cairan

hasil filtrasi tersebut kemudian diletakkan dalam sebuah wadah pada suhu kamar
 hingga semua pelarut menguap. Setelah semua pelarut menguap (wadah kering)

kemudian dilakukan pengerukan untuk mengambil ekstrak kering daun jambu biji

(Psidium guajava Linn). Kemudian ekstrak tersebut yang diperoleh dimasukkan

dalam lemari es dengan suhu 4-8°C hingga proses uji efek antibakteri dilakukan.

3.6.1.4 Pengenceran konsentrasi ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn)

 Konsentrasi ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn) yang digunakan

adalah: 20%, 40%, 60% dan 80%

 Rumusan pengenceran yang digunakan adalah:

V1.C1 = V2.C2

Keterangan :

V1 : Volume ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn) yang akan

diencerkan.

V2 : Volume ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn) yang akan dibuat.

C1 : Konsentrasi ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn) yang akan

diencerkan.

C2 : Konsentrasi ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn) yang akan dibuat.

 Jumlah ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn) yang diperlukan dalam

masing-masing konsetrasi adalah :

a. Pembuatan ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn) 20%

Diperlukan 0,2 mg ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn) dalam 1

ml aquades.

b. Pembuatan ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn) 40%

Diperlukan 0,4 mg ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn) dalam 1

ml aquades.

c. Pembuatan ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn) 60%

 Diperlukan 0,6 mg ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn) dalam 1

ml aquades.

d. Pembuatan ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn) 80%

Diperlukan 0,8 mg ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn) dalam 1

ml aquades.

3.6.1.5 Pembuatan media Mueller Hinton Agar (MHA)

 Disiapkan labu Erlenmeyer untuk melarutkan media.

 Ditimbang media MHA 38 gram menggunakan neraca analitik kemudian

dilarutkan ke dalam 1 liter aquades.

 Mengukur pH dengan cara mencelupkan kertas pH ke dalam pembenihan yang

akan diperiksa, perubahan warna yang terjadi dibandingkan dengan standar warna

yang ada pada bungkus pH untuk menentukan berapa pH nya, pH untuk media

harus stabil kira-kira 7 ke atas.

 Media dipanaskan sampai larut, kemudian disterilkan dalam autoclave suhu

121°C selama 15 menit.

 Media dituangkan ke dalam petridish-petridish dengan ketebalan 4 mm dan

dibiarkan beku.

3.6.1.6 Uji Penghambatan Pertumbuhan atau Uji Sensitivitas

Menurut Soemarno (2000) untuk mengetahui zona hambat ekstrak daun jambu

biji (Psidium guajava Linn) terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli sebagai

berikut:

a. Disiapkan suspensi murni Escherichia coli dengan kepekatan 0,5 unit Mc

Farland.

b. Disiapkan media Mueller Hinton Agar (MHA) dengan ketebalan 3-4 mm.
 c. Dioleskan suspensi bakteri dengan swab steril hingga merata pada permukaan

media MHA, inkubasi 5-15 menit.

d. Dibuat sumuran dengan menggunakan blue tip steril yang ditekan pada

permukaan media hingga terbentuk lubang (sumuran) dengan diameter 8 mm.

e. Memasukan Aquabidest sebagai kontrol negatif, Ciprofloxacin sebagai kontrol

positif, serta ekstrak daun jambu biji dengan konsentrasi masing-masing 20%,

40%, 60% dan 80% sebagai kelompok eksperimental. Semua unit perlakuan,

baik kontrol dan eksperimental, dimasukkan dengan volume masing-masing

sebanyak 50 µl.

f. Diinkubasi pada suasana aerob 37°C selama 24 jam dengan posisi petridish tidak

terbalik.

g. Melihat adanya zona hambatan dan mengukur diameter zona hambatan dengan

penggaris.

3.7 Alur Penelitian

Kelompok eksperimental akan diberikan perlakuan berupa ekstrak daun jambu biji.

Kelompok kontrol akan dibagi menjadi dua kelompok yakni kelompok kontrol positif akan

diberikan perlakuan berupa pemberian Ciprofloxacin sedangkan kelompok kontrol negatif

diberikan perlakuan berupa Aquabidest. Setiap unit perlakuan dari kelompok eksperimental

akan diberikan empat tingkat konsentrasi yang berbeda yakni 20%, 40%, 60% dan 80% .

Konsentrasi yang digunakan berdasarkan penelitian pra-laboratorium yang telah

dilaksanakan oleh peneliti sebelumnya yakni pada tanggal 17 April 2016. Penelitian pra-

laborotrium tersebut dilakukan perasan daun jambu biji (Psidium guajava Linn) dengan

konsentrasi yakni 50-100%. Penelitian pra laboratorium tersebut menunjukkan zona hambat

sebesar 14-16 mm pada konsetrasi 50-100% menunjukkan kriteria kuat, bukan kriteria sangat
kuat, dengan alasan peneliti tidak hanya ingin menguji sifat antibakteri berdasarkan zona

hambat, tetapi juga ingin menggunakan konsentrasi yang terendah dengan efektivitas yang

tinggi sehingga dapat digunakan sebagai pengganti antibiotik yaitu Ciprofloxacin dengan

diameter 40-42 mm.

Berdasarkan besar unit replikasi terdapat 4 unit eksperimental Escherichia coli yang

berasal dari isolat laboratorium Biomedik RSUP NTB yaitu EC1, EC2, EC3 dan EC4

selanjutkan untuk jumlah unit percobaan terdapat 24 perlakuan yang diinterpertasikan

sensitivitas masing-masing unit perlakuan terhadap unit eksperimental yaitu K20 dengan EC1

(K20EC1), K20 dengan EC2 (K20EC2), K20 dengan EC3 (K20EC3), K20 dengan EC4

(K20EC4) kemudian K40 dengan EC1 (K40EC1), K40 dengan EC2 (K40EC2), K40 dengan

EC3 (K40EC3), K40 dengan EC4 (K40EC4) kemudian K60 dengan EC1 (K60EC1), K60

dengan EC2 (K60EC2), K60 dengan EC3 (K60EC3), K60 dengan EC4 (K60EC4) kemudian

K80 dengan EC1 (K80EC1), K80 dengan EC2 (K80EC2), K80 dengan EC3 (K80EC3) dan

K80 dengan EC4 (K80EC4) kemudian KP dengan EC1 (KPEC1), KP dengan EC2 (KPEC2),

KP dengan EC3 (KPEC3), KP dengan EC4 (KPEC4) kemudian KN dengan EC1 (KNEC1),

KN dengan EC2 (KNEC2), KN dengan EC3 (KNEC3) dan KN dengan EC4 (KNEC4).
Bagan Alur Penelitian

Persiapan

Bakteri Salmonella thypi Buah Sawo

Bakteri Escherichia coli 0,5 Mc Ekstrak Buah sawo

Farland

Membuat media Mueller Hinton Agar

Mengoleskan(MHA)
bakteri dengan swab

Membuat sumuran mikro

Memasukkan ekstrak daun jambu biji

sesuai unit perlakuan

Kelompok Eksperimental Kelompok Kontrol

K20 K40 K60 K80 KP KN

Diinkubasi dalam kondisi aerob

selama 24 jam dengan
suhu 37°C
 Mengukur Zona Hambat Escherichia coli
coli
Tabulasi data

Analisa data

Laporan
Keterangan:

K20 : Ekstrak daun jambu biji dengan konsentrasi 20%

K40 : Ekstrak daun jambu biji dengan konsentrasi 40%

K60 : Ekstrak daun jambu biji dengan konsentrasi 60%

K80 : Ekstrak daun jambu biji dengan konsentrasi 80%

KP : Ciprofloxacin

KN : Aquabidest

3.8 Analisis Data

Untuk mengetahui adanya pengaruh perlakuan terhadap variabel, dilakukan uji

Anova pada tingkat kepercayaan 95%, Pα (0,05) dengan bantuan software SPSS versi 16.0.

apabila dengan Anova diperoleh nilai yang bermakna, baru dilakukan perbedaan dengan

metode Turkey HSD untuk mencari letak perbedaannya.

Apabila hasil dari uji hitung ternyata P hitung >Pα (0,05), berarti tidak terdapat daya

hambat ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn), sedangkan apabila P hitung <Pα

(0,05) berarti ada daya hambat ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava Linn) pertumbuhan

bakteri Escherichia coli penyebab diare.

 3.4 Rancangan Penelitian

Rancangan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak

Lengkap (RAL) dengan 4 kelompok perlakuan yang terdiri atas ekstrak buah sawo

(Manilkara Zapotta) dengan konsentrasi 20%, 40%, 60%, 80%. Konsentrasi yang

digunakan disesuaikan dengan penelitian sebelumnya yang menggunakan ekstrak

etanol buah sawo terhadap bakter Salmonella thypi (Ramadanti, 2012).

3.4.1 Kelompok Perlakuan

Tabel 3.1 Metode pengelompokkan perlakuan berdasarkan konsentrasi buah sawo

No. Kelompok Perlakuan

Kelompok 1 (K1) Kelompok bakteri Salmonella Thypus yang diberikan ekstrak

buah sawo dengan konsentrasi 20%.

Kelompok 2 (K2) Kelompok bakteri Salmonella thypus yang diberikan ekstrak

etanol buah sawo dengan konsentrasi 40%.

Kelompok 3 (K3) Kelompok bakteri Salmonella Thypus yang diberikan ekstrak

etanol buah sawo dengan konsentrasi 60%.

Kelompok 4 (K4) Kelompok bakteri Salmonella thypus yang diberikan ekstrak

etanol buah sawo dengan konsentrasi 80%.