HPLC 2011

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
RESOLUCIÓN (HPLC)
• Componentes de un equipo HPLC
• Tipos de Detectores
• Fases móviles en HPLC
• Parámetros cromatográficos
• Tipos de cromatografía
• Consideraciones prácticas
Los métodos cromatográficos se pueden clasificar en
función de diversos parámetros: fase móvil, fase
estacionaria, mecanismo de retención y forma de contacto
Fase Cromatografía Disposición Fase Cromatografía Abrv.
Móvil Estacionaria
Gas De gases (GC) Columna Líquida Gas-líquido GLC

Sólida Gas-sólido GSC
Líquida Planar Superficie Sólida En capa fina TLC

Sobre papel PC
Líquida De líquidos Columna Sólida Adsorción LSC

(LC, HPLC) Ligada Partición LLC/BPC
IEC
Iónica Intercambio iónico
SEC/GPC
Porosa Exclusión molecular
1
ESQUEMA DE UN EQUIPO HPLC
Principales componentes de un equipo de HPLC: (1) reservorios; (2) bomba; (3) inyector
automático con diferentes carruseles de muestras; (4) columna cromatográfica; (5)
detectores en serie; (6) sistema de tratamiento de datos; (7) botella para desechos.
OBJETIVO FINAL
2
PRECAUCIONES A SEGUIR CON LA FASE MÓVIL
Filtrar Siempre
Desgasificar Gradientes en baja presión
Termostatizar Fases móviles con solventes de bajo punto de ebullición
Fases móviles muy viscosas
Agitación Fases móviles complejas con solventes poco miscibles
INYECTORES
• INYECTOR MANUAL
• INYECTOR AUTOMÁTICO
• Precisión
• Termostatización
• Programabilidad
3
INYECTORES
DE BUCLES
(LOOP)
La función del inyector es introducir la muestra en

la corriente de fase móvil bajo alta presión
Volumen del loop: 5 μL a 5 mL
Recomendación: llenar loop con 5 veces su
volumen
INYECTORES AUTOMÁTICOS:
parámetros
Precisión y linealidad
Volumen de inyección
Refrigeración (Peltier)
Compatibilidad con viales, placas
multipocillo
Capacidad
Volumen interno
Tiempo de equilibrado
Contaminación cruzada
Programación
4
VIALES para INYECTORES AUTOMÁTICOS
REQUERIMIENTOS DEL SISTEMA DE BOMBEO

Debe soportar presiones de hasta 6000 psi (aprox. 400
bar)
9 Para permitir separaciones en tiempos razonables
Debe proporcionar flujos en el rango 0.1 a 10 mL/min,

con saltos de 0.1 mL/min
Control de flujo y reproducibilidad < 0.5%
Resistencia a la corrosión
5
9 Las bombas HPLC son casi exclusivamente

de PISTÓN
9 Un dispositivo eléctrico actúa sobre el

pistón que entra en una cámara donde se
halla la fase móvil, para comprimirlo y
enviarlo a presión al resto del sistema.
9 El flujo deseado se mide y alcanza en

función del número de emboladas por
unidad de tiempo.
9 Incorporan un dispositivo electrónico de medida y control de la

presión del sistema, en el que el usuario establece un límite máximo de
presión .
9 El principal inconveniente de estas bombas es la aparición de

oscilaciones en la línea base por cada embolada. Para evitarlo:
Utilizar atenuador de pulsos a la salida de la bomba
Bombas de dos pistones en serie
Bombas de dos pistones en paralelo
SISTEMA DE BOMBEO
• ISOCRÁTICO
La composición de la fase móvil no se modifica durante el
análisis
• GRADIENTE
La composición de la fase móvil se modifica durante el
análisis para ir aumentando su poder de elución.
6
BOMBAS DE GRADIENTE
Tiempo Fase Móvil Flujo

(min)
0 MeOH:H2O (v/v) 80:20 1,2 ml/min
7 MeOH:H2O (v/v) 80:20 1,2 ml/min
8 MeOH 100% 1,2 ml/min
20 MeOH 100% 1,2 ml/min
¿Por qué utilizar gradientes?

1. Para separar mezclas complejas con
componentes de polaridad diferente.
3
100
90
Gradiente (% Metanol)
80
Respuesta (volts)
2 70
60
50
Oleato de metilo Dioleina
40
1
30
Ac. oleico
20
Trioleina
10
0 0
0 5 10 15 20
Tiempo (h)
7
2. Para reducir el tiempo total de análisis y

eliminar las “colas” de los picos.
Isocrático Gradiente
Señal
0 40 80 120 0 20 40
Tiempo Tiempo
FORMACIÓN DE GRADIENTES
MEZCLA A ALTA PRESIÓN
Una bomba para cada
componente de la fase
móvil. La mezcla se realiza
en una cámara de mezcla
situada entre las bombas y
el inyector. La mezcla tiene
lugar en el lado de alta
presión de la bomba
8
FORMACIÓN DE GRADIENTES
MEZCLA A BAJA
PRESIÓN
Una válvula situada

antes de la bomba
controla la composición
abriendo la entrada de
cada eluyente durante
un tiempo proporcional a
la composición deseada.
La mezcla se realiza en
una cámara situada
entre la válvula y la
bomba. La mezcla tiene
lugar en el lado de baja
presión de la bomba
COMPARACIÓN BOMBAS DE GRADIENTE

ALTA PRESIÓN-BAJA PRESIÓN
ALTA PRESIÓN BAJA PRESIÓN
PRECIO Superior
Calidad de la mezcla Buena Buena
Desgasificación No necesaria Necesaria
Flujos bajos Mejor
Porcentajes bajos de algún Mejor
disolvente
Volumen “muerto” Pequeño Grande
9
TUBOS DE CONEXIÓN
Metal: Acero inoxidable 316, Nitronic 50, Níquel 200, EFNI
(electroformed nickel), Hastelloy C-22 (aleación de
níquel, cromo y molibdeno), Inconel 600, Titanio, etc.
No metal:
PTFE (politetrafluoroetileno), familia a la que pertenece el popular
teflón. Son muy resistentes químicamente, pero no tanto frente a
las altas presiones o temperaturas.
FEP (fluoroetilenpropileno). También de la familia de los

fluorocarbonos, con similares propiedades de resistencia que el
PTFE.
PEEK (polieteretercetona). Es el polímero inerte y biocompatible

por excelencia. Excelente resistencia química, térmica y a las altas
presiones (5000 psi). Sólo es atacado por dimetilsulfóxido, ácido
sulfúrico concentrado, ácido nítrico concentrado y cloruro de
metileno.
TUBOS DE CONEXIÓN
DIÁMETRO EXTERNO
1 in = 25.40 mm
½ in = 0.5´´ = 12.70 mm
¼ in = 0.25´´ = 6.35 mm
1/8 in = 0.125´´ = 3.175 mm
1/16 in = 0.06´´ = 1.59 mm
DIÁMETROS INTERNOS TÍPICOS DE LOS TUBOS HPLC

0.040´´ aprox. 1 mm (0.8 mL por metro)
0.020´´ aprox. 0.5 mm (0.4 mL por metro)
0.009´´ aprox. 0.2 mm (50 μL por metro)
10
TUBOS DE CONEXIÓN
0.040’’
0.009’’
TUBOS DE CONEXIÓN
11
UNIONES
Sirven para conectar los diferentes módulos del HPLC
ACERO: Férula, cono

No se pueden reutilizar
Necesario utilizar herramientas
PLÁSTICO (PEEK) Integrados

Reutilizables
Se enroscan a mano
RESOLUCIÓN (HPLC)
12
CARACTERÍSTICAS DEL
DETECTOR IDEAL:
Respuesta específica a analitos de interés
No afectado por cambios en temperatura o composición de
la fase móvil (ej. gradientes)
Alta sensibilidad (análisis de trazas)
No contribuir al ensanchamiento de bandas, volumen de
celda pequeño
Respuesta rápida
Fácil manejo, duradero y barato
Precisión
Respuesta lineal
RUIDO DEL DETECTOR

Corto o frecuencia alta (>1 Hz)
Incertidumbre en el valor de
la línea base de la señal, en
ausencia de un analito.
Frecuencia alta: Toma de tierra, excesiva Largo o frecuencia baja
amplificación (<0.1 Hz)
Frecuencia baja: Fase móvil con

impurezas, burbujas, flujo no estable, etc.
Deriva (drift): Uso de gradientes con
detectores no adecuados o con fases
Deriva
móviles que absorben, cambio en la Tamb.
13
LÍMITES DE DETECCIÓN Y
CUANTIFICACIÓN
LOD LOQ
Señal/Ruido = 3 Señal/Ruido = 10
LOD: Cantidad mínima detectable de un analito

LOQ: Cantidad mínima cuantificable de un analito
LINEALIDAD DE UN DETECTOR
Ideal
Señal del detector
y = mx + b
Real
Concentración de analito
donde: y = Re spuesta de la muestr a

x = Concentración
m = Pendiente
b = Ordenada en el origen
14
Otros parámetros
¾Volumen de celda:
Debe tener una influencia despreciable en la
anchura de los picos
No sobrepasar los límites máximos de presión
y caudal de cada tipo de celda
¾Tiempo de respuesta:
No debería ser superior a 0.3 segundos para
picos muy agudos
TIPOS DE DETECTORES
Generales: Responden a las

propiedades de la fase móvil que varían en
presencia de solutos (índice de refracción,
viscosimétricos, etc.)
Específicos: Responden a alguna

propiedad del soluto, no presente en la
fase móvil (absorbancia UV-VIS, masas,
etc.)
15
Ópticos:
• Fotométricos:
Absorbancia UV/VIS: longitud de onda
discreta o rango espectral continuo (PDA -
fotodiodos)
Fluorescencia
• Refractométricos, polarimétricos, evaporativos
(light-scattering).
Eléctricos: electroquímicos, conductimétricos.
Específicos: radiométricos, viscosimétricos.
De técnicas acopladas: espectroscopía de
masas, IRTF, AA, ICP.
DETECTORES FOTOMÉTRICOS
Región Longitud de onda (nm)
Ultravioleta lejano 10-200

El espectro
Ultravioleta cercano 200-380 electromagnético
está dividido en
Visible 380-780 diferentes
regiones
Infrarrojo cercano 780-3,000 espectrales,
definidas de
Infrarrojo medio 3,000-30,000 acuerdo a la
Infrarrojo lejano 30,000-300,000 longitud de onda.
Microondas 300,000-1,000,000,000
16
DETECTORES DE ABSORBANCIA UV/VIS
LA MAYORÍA DE LOS
COMPUESTOS ORGÁNICOS
ABSORBEN EN ALGUNA ADECUADO PARA TODOS
ZONA DEL ESPECTRO LOS MODOS
CROMATOGRÁFICOS
ADECUADO PARA TRABAJAR

SENSIBILIDAD
EN GRADIENTE
ALTA
DETECTORES DE ABSORBANCIA UV/VIS
AMPLIO RANGO
DE LINEALIDAD NO AFECTADOS
POR CAMBIOS DE
TEMPERATURA
17
DETECTOR DE ABSORBANCIA UV/VIS

Longitud de onda discreta
Identificación de los analitos en un detector de fotodiodos (PDA)

Absorbancia
λ
Tiempo de retención
18
DETECTORES DE FLUORESCENCIA
Ventajas:
Alta selectividad y sensibilidad (1 orden de magnitud
mayor que UV-VIS)
Aplicaciones típicas: Hidrocarburos aromáticos
policíclicos (legislación) y en técnicas con derivatización
Desventaja: Doble de precio que UV-VIS
19
DETECTORES DE ÍNDICE
general
Detector
DE REFRACCIÓN
En la celda de detección
se observa la variación en
la refracción de un haz de
luz cuando la fase móvil
lleva un compuesto
disuelto respecto a la fase
móvil pura.
PROPIEDADES DE UN DETECTOR DE
ÍNDICE DE REFRACCIÓN
Complementario a detectores UV-VIS

100-1000 veces menos sensible que UV-VIS
Sensible a pulsos de presión (ruido)
No permite gradientes
Aplicaciones típicas: carbohidratos, grasas,
polímeros, etc.
20
DETECTORES EVAPORATIVOS DE
DISPERSIÓN LUMINOSA Dete
ctor
(LIGHT-SCATTERING, ELSD) univ
ersa
l!!
Están basados en los efectos dispersivos que

toda partícula produce sobre una radiación.
Rayo incidente
Rayo dispersado
COMPONENTES DE UN ELSD
1. Un sistema de nebulización
neumática del líquido procedente de
la columna.
2. Un tubo evaporador caliente, donde

entra el eluyente y se produce la
evaporación de la fase móvil.
3. Un detector alejado del eje de la

radiación incidente, normalmente un
fotomultiplicador emplazado 90-120°
de la fuente de radiación.
21
PROPIEDADES DE UN DETECTOR ELSD
Fácil manejo
Mayor sensibilidad que índice de refracción
Compatibilidad con los gradientes de elución
Aplicaciones típicas: Azúcares, triglicéridos, ácidos
grasos, polímeros
DETECTORES ELECTROQUÍMICOS
En la célula de detección, equipada con

dos electrodos, se genera una diferencia de
potencial adecuada para provocar la
oxidación o reducción de los analitos. Se
mide la intensidad de corriente generada en
el proceso.
22
Ejemplos de compuestos detectables con detectores electroquímicos
Oxidación Reducción
Fenólicos Cetonas
Oximas Aldehídos
Dihidroxi Oximas
Mercaptanos Ácidos conjugados
Peróxidos Ésteres conjugados
Hidroperóxidos Nitrilos conjugados
Aminas aromáticas, diaminas Insaturaciones conjugadas
Purinas Halógenos activados
Anillos heterocíclicos Halógenos aromáticos
Carbohidratos Compuestos nitro
Anillos heterocíclicos
EL POTENCIAL ES CARACTERÍSTICO DE CADA SUSTANCIA
LA CORRIENTE DEPENDE DE LA CONCENTRACIÓN DE DICHA

SUSTANCIA
DETECTORES CONDUCTIMÉTRICOS
Muy útiles para cromatografía de intercambio iónico
La conductividad es proporcional a la fuerza iónica
Su sensibilidad disminuye a medida que aumenta la

conductividad de la fase móvil
Pequeño rango lineal
23
DETECTORES DE MASAS
Espectrómetro
HPLC + de masas
GRAN POTENCIAL
Separar
Caracterizar productos de
altos pesos moleculares
(pé
(péptidos, proteí
proteínas, etc.).
Identificar
Cuantificar componentes
de bajos pesos moleculares
DETECTORES DE MASAS:
MÉTODOS DE IONIZACIÓN
EI: IMPACTO ELECTRÓNICO (Therma-Beam). Es poco
eficaz
API: INTERFASES A PRESIÓN ATMOSFÉRICA:
Ionización mediante electrospray (ESI, electrospray

ionisation)
Ionización química a presión atmosférica (APCI, atmospheric
pressure chemical ionisation).
FAB (fast atom bombardment)
MALDI (matrix-assisted laser desorption)
24
RESOLUCIÓN (HPLC)
Disolventes más
usados en HPLC
Agua (grado MilliQ,
tampones)
Disolventes orgánicos:
Metanol
Acetonitrilo
Isopropanol
Diclorometano
Hexano
25
Características de los
eluyentes
Pureza
UV Cutoff
Miscibilidad
pH
Estabilidad
Propiedades físicas y toxicológicas
UV Cutoff de algunas fases móviles
26
Miscibilidad de disolventes
RESOLUCIÓN (HPLC)
27
Parámetro Fórmula Significado
Suma del tiempo que el analito permanece en la fase

Tiempo de
retención tR móvil y el tiempo que interacciona con la fase
estacionaria
t R − to Cociente del tiempo en que el analito está en interacción

Factor de
capacidad k= con la fase estacionaria (tR – to) y el que permanece en
to la fase móvil (to)
k2
Selectividad
(factor de α= Cociente del factor de capacidad de dos picos
adyacentes. Es una medida del potencial del sistema
separación)
k1 cromatográfico para separar dos compuestos.
Velocidad L
u=
Se calcula dividiendo la longitud de la columna (L)
lineal de la entre el tiempo que necesita la fase móvil para pasar a
fase móvil t0 través de la columna (to)
t 2 − t1 La resolución de dos picos adyacentes es el cociente

R = entre la distancia que hay entre los máximos de ambos
Resolución
1 (w + w ) picos y la media aritmética de sus anchuras respectivas
2 1 2 (w). Determina la calidad de la separación de dos picos
Parámetro Fórmula Significado
2 Este nombre refleja el origen del concepto de la

⎛t ⎞ teoría de destilación: una cierta longitud de la
Número de
N = 16 ⋅ ⎜ R ⎟ columna es ocupada por un plato teórico. Se
platos teóricos ⎝ w⎠ calcula, para un determinado pico, considerando el
tiempo de retención y su anchura.
Altura L
k=
t R − to
to
equivalente de HETP = Se calcula dividiendo la longitud de la columna
entre el número de platos teóricos.
platos teóricos N
Indica que para cada sistema cromatográfico existe

un flujo (definido por la velocidad lineal) para el
Ecuación de B
HETP = A + + C ⋅ u cual la altura equivalente de un plato teórico es
mínima. En la ecuación, A es la contribución de la
van Deemter u
difusión de Eddy, B corresponde a la difusión
longitudinal y C a la transferencia de masa
28
COMPARACIÓN GC-HPLC
NÚMERO TÍPICO DE POR COLUMNA POR METRO
PLATOS TEÓRICOS
GC con columnas 2000 1000
empaquetadas
GC con columnas 50000 3000
capilares
Cromatografía líquida clásica 100 200
HPLC 5000 50000
COMPARACIÓN GC‐HPLC
GC HPLC
Separaciones difíciles Posible Posible
Rapidez Sí Sí
Automatización Posible Posible
Forma típica de solucionar Cambio de fase estacionaria Cambio de fase estacionaria o
los problemas de fase móvil
No aplicable a... Compuestos poco volátiles, Compuestos muy volátiles
compuestos inestables
térmicamente
29
RESOLUCIÓN (HPLC)
CLASIFICACIÓN DE LOS PROCESOS

CROMATOGRÁFICOS EN HPLC
Los distintos tipos de fuerzas entre fase estacionaria y analitos
definen los distintos tipos de cromatografía HPLC
Proceso Abreviatura
Tipos
cromatográfico (inglés)
Adsorción LSC (líquido-sólido) ⎯

Fase reversa
Partición BPC (fase ligada)
Interacción hidrofílica
Intercambio aniónico
Intercambio iónico IEC
Intercambio catiónico
⎯
Exclusión por tamaño SEC/GPC
30
CROMATOGRAFÍA HPLC
DE ADSORCIÓN
Líquido-Sólido
CROMATOGRAFÍA HPLC DE
ADSORCIÓN
Es el método cromatográfico más antiguo
La interacción, de tipo electrostático, se

produce entre la parte polar del analito y los
grupos OH de la sílice.
Esta interacción compite con la que tiene

lugar entre la fase móvil y los grupos
funcionales de la sílice.
Está basada en el mismo principio que la

cromatografía en capa fina (TLC) y la
cromatografía de columna en gel de sílice
31
FASES ESTACIONARIAS:
SÍLICE
ALÚMINA
HIDROXIAPATITO
FASES MÓVILES:
HEXANO
ISOOCTANO
CLOROFORMO
ACETATO DE ETILO
COMPUESTOS QUE PUEDEN SER SEPARADOS
• OLEFINAS
• HIDROCARBUROS AROMÁTICOS Listados en
• HALUROS, SULFUROS
orden creciente
• ETERES
• NITRO- DERIVADOS de tiempo de
• ÉSTERES, ALDEHIDOS, CETONAS retenció
retención: de
• ALCOHOLES, AMINAS
• SULFONAS menor a mayor
• SULFÓXIDOS interacció
interacción con
• AMIDAS
• ÁCIDOS CARBOXÍLICOS
la fase
estacionaria
32
CROMATOGRAFÍA HPLC
DE PARTICIÓN
33
SÍLICE: MODIFICACIÓN QUÍMICA
OH OH OH OH OH
O O O
Si Si Si Si Si
CH3 CH3
Si OH + Cl Si R Si O Si R
CH3 CH3
Se obtiene una fase

ligada estable
térmicamente y
resistente a la
hidrólisis
34
COMPARACIÓN ADSORCIÓN-PARTICIÓN
A) CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN EN FASE

REVERSA
FASES ESTACIONARIAS:
OCTADECIL- C18
OCTIL- C8
BUTIL- C4
FENIL- C6H5
FASES MÓVILES:
ACETONITRILO
METANOL
THF
con agua como componente de la fase móvil
35
FASE REVERSA
“La fase estacionaria es menos polar que la fase móvil”
FASE ESTACIONARIA:
APOLAR
FASE MÓVIL:
POLAR
FASE REVERSA
La retención está basada en la

interacción, de tipo hidrófobo,
entre la fase estacionaria y la
región no polar del analito
36
Más del 90% de las

aplicaciones HPLC de
compuestos de bajo
peso molecular se
hacen en cromatografía
de partición en fase
reversa
37
CONTROL DE LA RETENCIÓN
EN FASE REVERSA
Para aumentar el tiempo de retención de

los analitos, AUMENTAR la POLARIDAD
de la fase móvil.
Esto suele conseguirse incrementando el
porcentaje de agua
Campo de aplicación Ejemplos

Farmacia Antibióticos, analgésicos, esteroides
Medio ambiente Pesticidas, Herbicidas, Fenoles, PCBs
Industria química Detergentes, Polímeros
Alimentación Edulcorantes, emulgentes, antioxidantes
Bioquímica Proteínas, Hidratos de carbono, Lípidos
Clínica y Diagnóstico Análisis de orina y sangre, Dopaje, Hormonas
38
B) CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN POR

INTERACCIÓN HIDROFÍLICA (HILIC)
SEPARACIÓN DE COMPUESTOS
MUY HIDRÓFILOS
NO RETENIDOS EN
HPLC EN FASE
REVERSA: MUY RETENIDOS EN
Coelución HPLC DE ADSORCIÓN:
Pero no se pueden
disolver en fase móvil
apolar
EJEMPLOS DE CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN

HIDROFÍLICA (HILIC)
SEPARACIÓN DE 30
CARBOHIDRATOS Glucose
25 Maltose
Columna Lichrospher-NH2
250 x 4.6 mm
Signal (mVolts)
20
CH3CN:H2O 70:30 v/v Maltotriose
0.7 mL/min 15
10
0 5 10 15 20 25 30
Retention time (min)
ORDEN DE ELUCIÓN: DE MENOS POLAR A MÁS POLAR
39
EJEMPLOS DE CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN

HIDROFÍLICA (HILIC)
SEPARACIÓN DE
VITAMINAS
HIDROSOLUBLES
CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÍLICA (HILIC)
FASES ESTACIONARIAS
(naturaleza de R)
CIANO -C2H4CN
DIOL -C3H6OCH2CHOHCH2OH
AMINO -C3H6NH2
DIMETILAMINO -C3H6N(CH3)2
NITRO -C2H4NO2
40
CROMATOGRAFÍA
DE INTERCAMBIO
IÓNICO
• Grupos cargados como SO3-, COO-, NH3+ o NR3+ son

incorporados en una resina o en un gel.
• Las moléculas cargadas de analito compiten con los iones

de la fase móvil por los sitios de unión de la fase
estacionaria.
41
Intercambiador aniónico
+
Atrae aniones
Intercambiador catiónico
-
Atrae cationes
ABREVIATURAS EN COLUMNAS DE INTERCAMBIO IÓNICO
42
SEPARACIÓN DE
LANTÁNIDOS
Columna de intercambio catiónico Partisil SCX (25 cm x 4 mm)

Fase móvil A: ácido 2-hidroxi-isobutírico en agua
Gradiente de 0.03 a 0.07 M
Detección VIS a 520 nm tras derivatización con 4-(piridilazo-resorcinol)
APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA
IÓNICA
9 Determinación de aniones en el agua de bebida

9 Determinación de nitratos en vegetales
9 Determinación de fluoruros en pasta de dientes
9 Determinación de ácidos orgánicos en bebidas
9 Determinación de amonio, potasio, nitrato y
fosfatos en fertilizantes
9 Determinación de sodio y potasio en muestras
clínicas (transfusiones)
43
Análisis de una mezcla de aniones inorgánicos mediante cromatografía HPLC de

intercambio iónico. Columna IonPac AG17-C AS17-C Dionex (250 x 4 mm).
Fase móvil: hidróxido potásico (1 mM de 0 a 3 min, 1-12 mM de 3 a 10 min, 12-
35 mM de 10 a 14 min). Flujo: 1.5 ml/min. Temperatura: 30 °C. Detección de
conductividad con columna supresora. Fuente: catálogo de Dionex.
CROMATOGRAFO IÓNICO
44
EXCLUSIÓN
POR TAMAÑO
GPC/SEC
Fundamento de la separación
45
Aspecto importantes de la separación

La separación tiene lugar en el volumen total de
líquido en la columna. Se puede predecir el
tiempo total de análisis. Los volúmenes de
elución son bajos.
DESVENTAJAS
Baja resolución (picos anchos)
Posible interacción entre la fase estacionaria y la muestra.
APLICACIONES
Polímeros (GPC, gel permeation chromatography)
Proteínas y otros compuestos biológicos (SEC, size exclusion
chromatography)
46
APLICACIONES: POLÍMEROS
Análisis de una mezcla de patrones de poliestireno mediante cromatografía HPLC

de exclusión molecular (GPC). Condiciones: columna Chrompack Microgel 3 Mix
(Varian) 250 x 7.7 mm, fase móvil tetrahidrofurano, 1.0 ml/min, detector de índice de
refracción.
CROMATOGRAFÍA QUIRAL
47
CROMATOGRAFÍA QUIRAL
Distribución de fármacos aprobados en el

mundo de acuerdo a su quiralidad en el
periodo 1983-2002
Los enantiómeros se pueden separar por

cromatografía líquida, siempre y cuando el
sistema sea asimétrico (quiral)
POSIBILIDADES EN CROMATOGRAFÍA QUIRAL
1) La fase móvil es quiral, la fase

estacionaria no es quiral
2) La fase estacionaria es sólida y además

quiral. La fase móvil no es quiral.
48
RESOLUCIÓN (HPLC)
RIESGOS DE TRABAJO EN HPLC
Empleo de disolventes tóxicos
Riesgos derivados del empleo de altas

presiones
49
DESGASIFICACIÓN DE LA FASE MÓVIL
Elimina los gases disueltos para prevenir la

formación de burbujas. Especialmente importante en
bombas de mezcla de baja presión.
Sistemas de desgasificación:
Helio
Vacío
Ultrasonidos
Desgasificadores on‐line
PRESIÓN
La presión es proporcional al caudal
La presión máxima de trabajo suele venir

especificada en la columna:
Columnas de acero con material base de sílice:

aprox. 4000-5000 psi
Columnas poliméricas (estireno-divinilbenceno):
aprox. 600-1000 psi
50
CAUDAL
El tamaño de partícula, el tipo de relleno, la
viscosidad de la fase móvil, la temperatura y las
dimensiones de la columna condicionan el
caudal.
Para columnas analíticas con base de acero:

Material base de sílice: aprox. 0.5-2 mL/min
Columnas poliméricas: aprox. 0.3-1 mL/min
VOLUMEN DE INYECCIÓN
Volumen de inyección:
En columnas analíticas, 5-25 µL
51
TROUBLESHOOTING
LO MÁS IMPORTANTE: LOCALIZAR EL PROBLEMA
FASE MÓVIL
INYECTOR
FILTROS DEL SISTEMA
COLUMNA
BOMBA
PRECOLUMNA
TUBOS/CONECTORES
DETECTOR
OPERADOR
Preparación de muestras
Preparar la muestra para que pueda

analizarse en cualquier técnica analítica
9 HPLC 9 GC
9 LC – MS 9 GC – MS
9 Espectrofotometría
52
Objetivos de la preparación de muestras
Eliminar los compuestos que coeluyen con el

analito de interés.
Eliminar impurezas o residuos que puedan
producir interferencias
Concentrar muestras para mayor sensibilidad
Eliminar las sales de una muestra
Proteger la columna analítica
Tipos de preparación de
muestras
Filtración
Extracción fase sólida
Extracción líquido – líquido
Precipitación de proteínas
Otros
53
FILTRACIÓN DE MUESTRAS Y
DISOLVENTES
Eliminación de partículas insolubles a través de su
paso por una membrana.
9 Las partículas pueden dañar el equipo, dañar la
columna, influir en los resultados
Utilizar los filtros de membrana adecuados: muestras

acuosas - Acetato de celulosa; muestras orgánicas - Nylon,
PTFE, PVDF. No utilizar filtros de acetato de celulosa con
acetonitrilo
Filtros de las líneas de los disolventes: suelen ser de Titanio,

10 μm poro. Se limpian en sonicador, o pasando NO3H al 1%
Aumenta la vida de la columna
Extracción en fase sólida

(SPE)
Partición selectiva de uno o varios
compuestos entre dos fases, donde una de
ellas es fase sólida.
54
Diferencias entre HPLC y SPE
HPLC SPE
Tamaño de partícula ∼ 5 μm 40-80 μm
Eficacia de
Alta Baja
empaquetamiento
Vol. extra columna Bajo Alto
Longitud columna 5 – 30 cm ∼ 1 cm
No. Platos ∼ 10 000 < 50

- Tema 3 -
Herramientas para SPE

Cartuchos
Placas
Discos
55
- Tema 3 -
Tipo de fuerza a utilizar

Gravedad
Presión positiva
56
Estrategias para la SPE

• Retener las impurezas e interferencias en la
matriz y dejar que los compuestos de interés
pasen a través del cartucho con la fase.
Retener los compuestos de interés y eluir las

impurezas.
57

HPLC 2011

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Gas De gases (GC) Columna Líquida Gas-líquido GLC

Líquida Planar Superficie Sólida En capa fina TLC

Líquida De líquidos Columna Sólida Adsorción LSC

ESQUEMA DE UN EQUIPO HPLC

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

PRECAUCIONES A SEGUIR CON LA FASE MÓVIL

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

La función del inyector es introducir la muestra en

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

VIALES para INYECTORES AUTOMÁTICOS

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

REQUERIMIENTOS DEL SISTEMA DE BOMBEO

 Debe proporcionar flujos en el rango 0.1 a 10 mL/min,

 Control de flujo y reproducibilidad < 0.5%

9 Las bombas HPLC son casi exclusivamente

9 Un dispositivo eléctrico actúa sobre el

9 El flujo deseado se mide y alcanza en

9 Incorporan un dispositivo electrónico de medida y control de la

9 El principal inconveniente de estas bombas es la aparición de

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Tiempo Fase Móvil Flujo

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

¿Por qué utilizar gradientes?

2. Para reducir el tiempo total de análisis y

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Una válvula situada

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

COMPARACIÓN BOMBAS DE GRADIENTE

FEP (fluoroetilenpropileno). También de la familia de los

PEEK (polieteretercetona). Es el polímero inerte y biocompatible

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

1/16 in = 0.06´´ = 1.59 mm

DIÁMETROS INTERNOS TÍPICOS DE LOS TUBOS HPLC

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

ACERO: Férula, cono

PLÁSTICO (PEEK) Integrados

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

RUIDO DEL DETECTOR

Frecuencia baja: Fase móvil con

LOD: Cantidad mínima detectable de un analito

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

donde: y = Re spuesta de la muestr a

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

 Generales: Responden a las

 Específicos: Responden a alguna

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Región Longitud de onda (nm)

Ultravioleta lejano 10-200

DETECTORES DE ABSORBANCIA UV/VIS

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

ADECUADO PARA TRABAJAR

DETECTORES DE ABSORBANCIA UV/VIS

DETECTOR DE ABSORBANCIA UV/VIS

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Identificación de los analitos en un detector de fotodiodos (PDA)

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Desventaja: Doble de precio que UV-VIS

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Complementario a detectores UV-VIS

Están basados en los efectos dispersivos que

Debe proporcionar flujos en el rango 0.1 a 10 mL/min,

Control de flujo y reproducibilidad < 0.5%

Generales: Responden a las

Específicos: Responden a alguna

En la célula de detección, equipada con

EL POTENCIAL ES CARACTERÍSTICO DE CADA SUSTANCIA

LA CORRIENTE DEPENDE DE LA CONCENTRACIÓN DE DICHA