CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE HISTOLOGIA

COLORAÇÃO

Alunos: Bruno Capato Bellançon

Lucas Leonardo F. de Oliveira
Weslei Correia Cabral
Yago Tsuboi

Professor: Fábio Goulart de Andrade

Disciplina: 5HIT017–Análises histológicas

Coloração

Corantes já são utilizados em áreas da anatomia desde meados do século XVI.

Acredita-se que Jacopo Berengario da Carpi foi um dos primeiros indivíduos a usar
corantes em estudo de tecidos, ao injetar tais substâncias na luz de vasos sanguíneos
de corpos entre 1521 e 1523. Em 1567 Antonius Mizaldus fez o primeiro relato da
coloração de tecidos através de rúbia. Daí em diante vários outros tipos de colorações
foram surgindo. Com o avanço da tecnologia e advento do microscópio óptico foi
então descoberta a possibilidade da utilização dessas substâncias para observação de
amostras teciduais extremamente finas. Em 1719, Antoni Van Leeuwenhoeck ao
colorir músculo estriado de vacas, peixes e outros animais com uma solução de
assafrão verdadeiro e observa-los em um microscópio simples foi a primeira pessoa a
utilizar essas substâncias com esse intuito.

Os cortes de tecido provenientes da microtomia são extremamente finos e

translúcidos, portanto não são visíveis em microscopia óptica. Para as estruturas
serem visualizadas de melhor forma é necessário o uso de determinadas substâncias
conhecidas como corantes. Para entender a coloração é preciso saber o que é um
corante. Basicamente um corante é um composto químico, orgânico, aromático e
ionizável, fundamentalmente baseado na estrutura do benzeno, porém esses são
incolores. Os corantes ganham cor pela adição de um grupamento de átomos à sua
estrutura, os cromóforos. A coloração em si que podemos visualizar se dá porque suas
moléculas absorvem quantidades definidas de energia eletromagnética e emitem
parte da energia em forma de luz visível. Tal fenômeno quântico é devido ao rearranjo
energético e posicional (ressonância) dos elétrons presentes na estrutura química do
cromóforo em associação com os anéis aromáticos da estrutura do corante. Os
cromóforos são átomos associados entre si, como a função cetona (C=O), o grupo
nitroso (-N=O) e o grupo nitro (-NO2), entre outros. Cabe ainda saber que cromógeno é
a designação dada à união entre o corante e o cromóforo, e quanto maior a
quantidade de cromóforos presentes em um corante maior a intensidade da cor. Para
que o cromógeno, se ligue especificadamente aos elementos é necessária sua
combinação com um grupo auxiliar chamado auxocromo. Esse auxocromo determina a
acidez ou basicidade do corante, e portanto, sua interação com os compostos
biológicos. Os corantes básicos possuem auxocromos com carga positiva e reagem
com moléculas com carga negativa (basófilas) como o núcleo celular. Os corantes
ácidos possuem carga negativa e reagem com moléculas positivas (acidófilas), como o
citoplasma e a matriz extracelular.

Os corantes podem ser vitais ou não vitais. No primeiro caso o tecido está vivo
e o corante não destrói as células nem altera seu metabolismo. Já os corantes não
vitais são usados em tecidos que foram previamente fixados, ou seja, em tecidos não
mais vivos. Os corantes podem ainda ser naturais, se forem derivados de plantas e
rochas (como a hematoxilina por exemplo), ou sintéticos, se são derivados do benzeno
(como a eosina).

As colorações podem ser classificadas segundo a ação do corante, o tempo de

coloração e sua cromatização. Duas definições são importantes para entender tal
caracterização, o mordente e a diferenciação. O mordente é um elemento ou íon
metálico, que se liga covalentemente ao corante facilitando a ação no tecido. Este é
empregado para reforçar a ação dos corantes e torna-los mais seletivas, podendo ser
usado antes da coloração, durante (adicionado junto ao corante), ou após. Um
exemplo de corante que necessita essencialmente de mordente para sua correta
utilização é a Hematoxilina. A diferenciação se refere a remoção do excesso de um
corante no tecido, removendo seletivamente a coloração de determinadas estruturas
e melhorando assim sua visualização.

Na classificação pela ação, a coloração é dita direta quando o corante penetra nos
tecidos sem auxílio do mordente, e indireta quando ocorre com o auxílio.

Na classificação relacionada ao tempo, a coloração é definida como regressiva quando

se utiliza a diferenciação, caso a utilização não ocorra esta é denominada progressiva.

Já a classificação relacionada a cromatização depende essencialmente da quantidade

de corante utilizado durante a execução da técnica. Sendo que a coloração pode ser
designada monocrômica (uma cor), bicrômica (duas cores), tricrômica (três cores) ou
policrômica (quatro ou mais cores).

Algumas considerações importantes estão no fato de determinadas estruturas

teciduais poderem ser visualizadas na mesma cor ou muito semelhante ao tom do
corante utilizado (fenômeno conhecido como ortocromasia), e em outros casos
visualizadas com coloração diferente do corante utilizado (fenômeno conhecido como
metacromasia).

Apesar das técnicas histológicas aplicadas aos diversos tecidos serem muitas,
existe um método geral que é base para praticamente todas essas. Esse método geral
é delineado pela seguinte sequência de eventos: inicialmente deve-se preparar a
solução corante seguindo um protocolo específico para cada tipo de corante. Um
exemplo é a coloração por Hematoxilina de Mayer, a solução corante é composta por:
1g de Hematoxilina; 1L de água; 0,2g de iodato de sódio; 50g de alúmen de amônia ou
potássio; 1g de ácido cítrico; 50g de hidrato de cloral. Após a preparação do corante,
dá-se início à desparafinização, que consiste na retirada da parafina dos cortes
realizados pela técnica de microtomia com auxílio de Xilol, um solvente orgânico. A
seguir vem a hidratação realizada por banhos em sequência de concentrações
decrescentes de álcool etílico (100%, 95%, 80% e 70%) até água destilada, com intuito
de possibilitar a solubilidade do corante ao meio, uma vez que praticamente toda água
 foi retirada no processo de inclusão em parafina. No caso de corantes alcoólicos deve-
se interromper a hidratação em álcool 70%.

Por conseguinte, inicia-se a coloração em si, através da imersão das amostras

nas soluções colorantes. Tal amostra deve então ser novamente desidratada, através
de banhos em sequência, desta vez de concentrações crescentes de álcool etílico
(70%,80%,95% e 100%) com intuito de retirar a água do tecido e possibilitar a
utilização dos meios de selagem, que são insolúveis em água. O passo seguinte é a
clarificação com a utilização de xilol, um líquido intermediário entre o álcool e o meio
de selagem. A etapa final é a montagem ou selagem das lâminas, a qual tem por
finalidade cobrir a amostra já corada por uma lamínula de vidro com uma substância
específica, como o bálsamo do Canadá, possibilitando a utilização dessa lâmina por
muito tempo.

Exemplos de corantes para a observação de determinados elementos são:

CORANTES EVIDENCIAM
Tricomática de Masson, Reticulina de Gomori,
Tecido conjuntivo
Goldner
Sudan Black Tecido adiposo
Giemsa, May-Grunwald (usados na prática),
Tecido linfoide e mieloide
Reticulina de Gomori
Colorações Tricromáticas, Azul de Toluidina Tecido muscular

HE, Fulgen, Papanicolau, Giemsa Núcleo e citoplasma