You are on page 1of 9

MATERI DAN METODE berukuran5,5 mm yang telah direndam

Persiapan Hewan Coba larutan 1 M NaOH selama 60 detik,

Tikus diadaptasi selama tujuh hari kemudian kornea tikus dibilas dengan

dengan pemberian pakan berupa ransum menggunakan BSS selama 2 menit. Sebelum

basal dan minum aquadest ad libitum di diletakkan pada sentral kornea mata kanan

Laboratorium Biomedik Kampus II hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus),

Universitas Muhammadiyah Malang dilakukan anastesi terlebih dahulu

sebelum diinduksi NaOH. Hewan coba yang menggunakan ketamine hydrochloride (50

digunakan berumur antara 10 – 12 minggu mg/KgBB) secara intraperitoneal.

dengan berat rata-rata 150 – 200 gram. Terapi Genistein Tetes Mata Topikal

Pembuatan Solutio Genistein Tetes Mata Terapi dilakukan dengan

Topikal memberikan genistein tetes mata topikal

Genistein murni dilarutkan ke dalam sebanyak 1mg/ml, 0,5mg/ml dan 0,25mg/ml

aquabidest, dimasukkan ke dalam wadah, pada masing-masing kelompok perlakuan

wadah ditutup dan disterilkan menggunakan hewan coba (K2, K3 dan K4) 4 kali 1 tetes

autoklaf pada suhu 115-116oC selama 30 per hari.

menit. Pengamatan Ekspresi TNF-α dengan

Induksi NaOH pada Hewan Coba Metode Immunohistokimia pada Kornea

Induksi NaOH dilakukan pada Pembuatan parafin blok dengan cara

kelompok perlakuan selama 60 detik tepat di dehidrasi jaringan kornea menggunakan

sentral kornea mata kanan hewan coba tikus alcohol bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%,

putih (Rattus norvegicus). Induksi NaOH 96% dan absolut) masing-masing 60 menit.

dilakukan dengan menggunakan kertas filer Kemudian dilakukan clearing menggunakan


xylol 2 kali masing-masing 60 menit. menggunakan 5% FBS yang mengandung

Infiltrasi dengan paraffin lunak selama 60 0,25% Triton X-100. Slide dicuci

menit pada suhu 49˚C. dilakukan blok dalam menggunakan PBS pH 7,4 tiga kali, selama

parafin keras pada cetakan dan didiamkan 5 menit. Slide diinkubasi menggunakan

selama sehari. Parafin ditempelkan pada antibody primer selama 60 menit pada suhu

holder dan dilakukan pemotongan setebal 4 ruang. Slide dicuci menggunakan PBS pH

µM dengan rotary microtome secara 7,4 tiga kali, selama 5 menit. Slide

melintang di daerah sekitar defek kornea. diinkubasi menggunakan polymer conjugate

Dilakukan mounting pada gelas obyek selama 40 menit pada suhu ruang. Slide

dengan gelatin 5 %. Untuk proses ditetesi dengan DAB (DiaminoBenzidine)

deparafinisasi dengan cara gelas obyek hasil dan inkubasi selama 10 menit. Slide dicuci

parafin blok direndam dalam xylol 2 kali menggunakan PBS pH 7,4 tiga kali, selama

masing-masing selama 5 menit. Dilakukan 5 menit. Selanjutnya cuci menggunakan

rehidrasi menggunakan alcohol berseri Gelatine 5% dH20, selama 5 menit.

(absolut, 96%, 80%, 70%, 50%, dan 30%) Counterstaining menggunakan Mayer

masing-masing selama 5 menit. Dibilas Hematoxilen yang diinkubasi selama 10

dengan Gelatine 5% dH2O selama 5 menit. menit dan cuci menggunakan tap water.

Slide dicuci dengan PBS pH 7,4 satu Slide dibilas menggunakan Gelatine 5%

kali selama 5 menit kemudian dibloking dH2O dan kering anginkan. Untuk mounting

endogenous peroksida menggunakan 3% digunakan entelan dan tutup dengan cover

H2O2 selama 20 menit. Slide dicuci glass. Distribusi TNF-α diamati pada

menggunakan PBS pH 7,4 tiga kali, selama mikroskop cahaya.

5 menit. Slide dibloking unspesific protein


Analisa Data HASIL PENELITIAN

Data dianalisis dengan menggunakan

uji one way Anova untuk membuktikan

adanya perbedaan antara kontrol, dosis

pemberian genistein topikal tetes mata

terhadap perubahan ekspresi TNF-

αberdasarkan waktu perlakuan pada kornea

tikus. Uji statistik dikatakan bermakna bila

p<0.05. Uji homegenitas sampel Gambar 5.1. Data Perubahan

menggunakan menggunakan lavene statistic Eskpresi TNF-α

dan normalitas sampel mengunakan uji Gambaran ekspresi TNF-α setelah 24

kolmogorof-smirnov. Jika didapatkan jam induksi NaOH 1 M menggunakan

perbedaan, dilanjutkan dengan uji rentang mikroskop cahaya pembesaran 400x. .(a)

ganda post hoc test (mutiple comparison, control positif, (b) dosis 0,25 mg/ml (c) 0,50

Tukey). Untuk mengetahui korelasi mg/ml dan (d) 1 mg/ml. Anak panah

pengaruh konsentrasi pemberian genistein menunjukkan ekspresi TNF-α berwarna

terhadap TNF-α digunakan uji korelasi- kecoklatan.

regresi. Proses perhitungan dilakukan


Tabel 5.1 Hasil Penelitian Ekspresi
dengan bantuan perangkat lunak komputer
TNF – α pada kornea mata Tikus (Rattus
program SPSS 16 for windows.
Novergicus Strain Wistar Jantan)

Ulangan sampel Stan


Rat dar
Perlak a- devi
uan 1 2 3 4 5 6 rata asi
K(-) 0 0 0 0 0 0 0 0 topikal dengan dosis 1 mg/ml, 0.5 mg/ml
2 2 2 2 2 2 20. 0.98
dan dosis 0.25 mg/ml menunjukkan efek
K(+) 2 0 0 1 0 2 83 3
atau pengaruh yang berbeda jika
1 1 1 1 1 1 15. 1.96
D1 7 3 7 4 5 8 67 6 dibandingkan dengan kontrol positif.
1 1.54 Adapun adanya perbedaan ekspresi
D2 9 6 9 7 7 0 8 9
TNF-α pada kornea mata tikus (Rattus
0.54
D3 2 3 2 3 2 3 2.5 8 Novergicus Strain Wistar Jantan) secara

keseluruhan pada setiap perlakuan di atas


Berdasarkan Tabel 5.1 di atas terlihat
juga dapat digambarkan dalam bentuk
bahwa adanya pengaruh pemberian genistein
grafik sebagai berikut:
topikal tersebut mulai terlihat dimana

ekspresi TNF-α pada kornea mata tikus

wistar menjadi lebih kecil setelah diberikan

perlakuan berupa genistein topikal mulai

pada dosis 1 mg/ml dibandingkan dengan

ekspresi TNF-α pada kelompok kontrol


Gambar 5.2 Grafik Ekspresi TNF alpha
positif. Kemudian ekspresi TNF-α pada
pada kornea mata Tikus (Rattus
kornea mata tikus wistar cenderung semakin
Novergicus Strain Wistar Jantan) pada
menurun ketika diberi dosis 0.5 mg/ml dan
setiap perlakuan
0.25 mg/ml. Dengan demikian, berdasarkan
5.2. Analisis Data
penilaian secara deskriptif menurut rata-rata

ekspresi TNF-α pada kornea mata tikus 5.2.1 Analisis data ekspresi TNF-α dengan

wistar tersebut, maka dapat dikatakan bahwa menggunakan Uji One Way Anova

pemberian perlakuan berupa genistein


Penelitian ini menggunakan pemberian signifikansi sebesar 0.000 (p<0,05),

genistein topikal dengan 3 variasi dosis sehingga Ho ditolak, dan dapat disimpulkan

genistein topikal yang diuji coba di bahwa pemberian genistein topikal

laboratorium (dosis 1 mg/ml, 0.5 mg/ml menunjukkan adanya perbedaan yang

dandosis 0.25 mg/ml). bermakna (signifikan) terhadap ekspresi

TNF-α pada kornea mata tikus (Rattus


Hipotesis ditentukan melalui H0
Novergicus Strain Wistar Jantan).
diterima bila nilai signifikansi yang

diperoleh > alpha 0,05, sedangkan H0 Adanya perbedaan ekspresi TNF-α

ditolak bila nilai signifikansi yang diperoleh pada kornea mata tikus wistar sebagai efek

< alpha 0,05. dari setiap perlakuan tersebut dapat dilihat

pada gambar 5.3 sebagai berikut:


Selanjutnya, di bawah ini adalah hasil

uji ANOVA dari ekspresi TNF-α pada 25


Rerata Ekspresi TNF alpha

kornea mata tikus (Rattus Novergicus Strain 20 20.83

15 15.67
Wistar Jantan) pada setiap perlakuan.
10

Tabel 5.2 Tabel Hasil Uji ANOVA 5


8.00

2.50 0.00
0

Keterangan p-value K (+) Dosis 1 mg/ml Dosis 0.5 mg/ml Dosis 0.25 mg/ml K (-)
Kelompok Perlakuan

ekspresi TNF alpha 0.000


Gambar 5.3 Grafik Ekspresi TNF alpha
Berdasarkan hasil analisis ragam pada
pada kornea mata Tikus (Rattus
Tabel 5.2, menunjukkan bahwa pada setiap
Novergicus Strain Wistar Jantan)
perlakuan yang diberikan (kontrol negatif,
Berdasarkan plot respon tersebut dapat
kontrol positif, dosis 1 mg/ml, 0.5 mg/ml
dibentuk urutan dari efek perlakuan terhadap
dandosis 0.25 mg/ml) menunjukkan nilai
ekspresi TNF-α pada kornea mata tikus mg/ml

wistar dari urutan yang paling tinggi sampai


Dosis 1
dengan ekspresi TNF-α pada kornea mata 4
mg/ml 15.67±1.97
tikus wistar yang paling rendah, sebagai

5 K (+) 20.83±0.98
berikut :

Tabel 5.3. Tabel Urutan Ekspresi

TNF alpha pada kornea mata Tikus Pemberian genistein topikal pada
Sebagai Efek Dari Pemberian genistein dosis 0.25 mg/ml dapat menyebabkan
topikal ekspresi TNF-α pada kornea mata tikus

No Ekspresi TNF wistar menurun hingga mempunyai rata-rata

alpha pada yang paling rendah (mean 2.5) daripada

Perlakuan kornea mata pemberian genistein topikal pada dosis yang

tikus lebih rendah yaitu dosis 0.5 mg/ml, sehingga

(mean±std.dev.) dosis 0.25 mg/ml lebih efektif daripada

dosis 0.5 mg/ml. Pemberian genistein


Kontrol
topikal pada dosis 0.5 mg/ml, dapat
1 Negatif
menyebabkan rata-rata ekspresi TNF-α pada
(KN) 0±0
kornea mata tikus wistar lebih menurun
Dosis
dibandingkan dengan pada dosis 1 mg/ml,
2 0.25
sehingga dosis 0.5 mg/ml lebih efektif
mg/ml 2.50±0.55
daripada dosis 1 mg/ml. Namun pemberian

3 8.00±1.55 genistein topikal pada dosis 1 mg/ml dapat


Dosis 0.5
menyebabkan rata-rata ekspresi TNF alpha
pada kornea mata tikus wistar yang lebih Berdasarkan hasil analisis pada Tabel

rendah daripada kontrol positif (KP), 5.5 di atas dapat diketahui bahwa pemberian

sehingga dosis 1 mg/ml lebih efektif genistein topikal dengan ekspresi TNF-α

daripada KP. pada kornea mata tikus (Rattus Novergicus

Strain Wistar Jantan) (r= -0.978, p=0.000)


5.2.3 Pengujian Korelasi dan Regresi
mempunyai hubungan (korelasi) yang
Untuk mengetahui besarnya hubungan
signifikan (p<0.05) dengan arah korelasi
dan pengaruh dari pemberian genistein
yang negatif (karena koefisien korelasi
topikal dengan ekspresi TNF alpha pada
bernilai negatif). Artinya peningkatan
kornea mata tikus (Rattus Novergicus Strain
perlakuan berupa dosis genistein topikal
Wistar Jantan), maka digunakan uji korelasi
cenderung akan menurunkan ekspresi TNF-
dan regresi linier, dengan hasil pengujian
α pada kornea mata tikus (Rattus Novergicus
pada lampiran.
Strain Wistar Jantan), dibandingkan dengan
Tabel 5.4. Uji Korelasi ekspresi TNF-α pada kornea mata pada

Kesimpula kelompok kontrol.


Keterangan R P
n Berdasarkan hasil pengujian dengan

Pemberian menggunakan analisis regresi linier, dengan


genistein hasil persamaan regresi pada setiap
Ada
topikal dengan -
.00 konsentrasi sebagai berikut.
korelasi
ekspresi TNF 0.97
0 yang
8 Persamaan regresi R Square
alpha pada
signifikan
kornea mata Y = 25.85 – 5.483 X 95,7%
tikus
Keterangan:
Y = ekspresi TNF-α pada kornea untuk setiap peningkatan dosis genistein

mata tikus wistar topikal.

X = Dosis genistein Berdasarkan hasil uji regresi juga

menunjukkan nilai koefisien determinasi (R


Adapun model regresi dari pengaruh
Square=r2) yang menyatakan besarnya
pemberian genistein topikal dengan ekspresi
pengaruh dari pemberian genistein topikal
TNF alpha pada kornea mata tikus (Rattus
terhadap ekspresi TNF-α pada kornea mata
Novergicus Strain Wistar Jantan) yaitu Y =
tikus (Rattus Novergicus Strain Wistar
25.85 – 5.483 X, dimana Y adalah ekspresi
Jantan), dalam bentuk persentase, dan
TNF alpha pada kornea mata tikus (Rattus
persentase sisanya (1-R Square) ditentukan
Novergicus Strain Wistar Jantan),
oleh faktor lain. Jadi dapat dikatakan bahwa
sedangkan X adalah perlakuan pemberian
pemberian genistein topikal sangat
genistein topikal. Hal ini dapat diartikan
berpengaruh terhadap ekspresi TNF-α pada
bahwa tanpa dipengaruhi oleh pemberian
kornea mata tikus (Rattus Novergicus Strain
genistein topikal, maka ekspresi TNF alpha
Wistar Jantan) hingga 95.7%. Sedangkan
pada kornea mata tikus (Rattus Novergicus
4.3% keragaman ekspresi TNF-α pada
Strain Wistar Jantan) secara konstan akan
kornea mata tikus (Rattus Novergicus Strain
cenderung tetap tinggi 25.85 satuan (karena
Wistar Jantan) tersebut dipengaruhi oleh
koefisien konstanta bernilai positif). Namun
faktor lain selain dari pemberian genistein
apabila dipengaruhi oleh perlakuan dosis
topikal. Sehingga semakin tinggi dosis
genistein topikal justru akan menyebabkan
pemberian genistein topikal yang
ekspresi TNF alpha pada kornea mata tikus
dipergunakan, maka berpengaruh signifikan
(Rattus Novergicus Strain Wistar Jantan)
dalam menurunkan ekspresi TNF-α pada
mengalami penurunan hingga 5.483 satuan
kornea mata tikus (Rattus Novergicus Strain ke kanan bawah. Hal ini membuktikan

Wistar Jantan). adanya linieritas dari pemberian genistein

topikal dengan ekspresi TNF-α pada kornea


Adanya pengaruh yang signifikan dari
mata tikus (Rattus Novergicus Strain Wistar
pemberian genistein topikal dalam
Jantan). Artinya peningkatan perlakuan
menurunkan ekspresi TNF-α pada kornea
berupa pemberian dosis genistein topikal
mata tikus (Rattus Novergicus Strain Wistar
cenderung akan menurunkan ekspresi TNF-
Jantan), berdasarkan hasil penelitian dapat

ditunjukkan dalam bentuk grafik linieritas α pada kornea mata tikus (Rattus Novergicus

Strain Wistar Jantan), dibandingkan dengan


sebagai berikut:
ekspresi TNF-α pada kornea mata pada
Linear Regression

kelompok kontrol.


20.00



Ekspresi TNF alpha


15.00

10.00 



5.00


0.00 
Ekspresi TNF alpha = 25.85 + -5.48 * Pe rlakuan
R-Square = 0.96
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00

Kelompok

Gambar 5.4 Grafik linieritas

Berdasarkan grafik linieritas di atas

terlihat bahwa garis regresi antara

pemberian genistein topikal dengan ekspresi

TNF-α pada kornea mata tikus (Rattus

Novergicus Strain Wistar Jantan) mengarah