MATERI DAN METODE berukuran5,5 mm yang telah direndam

Persiapan Hewan Coba larutan 1 M NaOH selama 60 detik,

Tikus diadaptasi selama tujuh hari kemudian kornea tikus dibilas dengan

dengan pemberian pakan berupa ransum menggunakan BSS selama 2 menit. Sebelum

basal dan minum aquadest ad libitum di diletakkan pada sentral kornea mata kanan

Laboratorium Biomedik Kampus II hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus),

Universitas Muhammadiyah Malang dilakukan anastesi terlebih dahulu

sebelum diinduksi NaOH. Hewan coba yang menggunakan ketamine hydrochloride (50

digunakan berumur antara 10 – 12 minggu mg/KgBB) secara intraperitoneal.

dengan berat rata-rata 150 – 200 gram. Terapi Genistein Tetes Mata Topikal

Pembuatan Solutio Genistein Tetes Mata Terapi dilakukan dengan

Topikal memberikan genistein tetes mata topikal

Genistein murni dilarutkan ke dalam sebanyak 1mg/ml, 0,5mg/ml dan 0,25mg/ml

aquabidest, dimasukkan ke dalam wadah, pada masing-masing kelompok perlakuan

wadah ditutup dan disterilkan menggunakan hewan coba (K2, K3 dan K4) 4 kali 1 tetes

autoklaf pada suhu 115-116oC selama 30 per hari.

menit. Pengamatan Ekspresi TNF-α dengan

Induksi NaOH pada Hewan Coba Metode Immunohistokimia pada Kornea

Induksi NaOH dilakukan pada Pembuatan parafin blok dengan cara

kelompok perlakuan selama 60 detik tepat di dehidrasi jaringan kornea menggunakan

sentral kornea mata kanan hewan coba tikus alcohol bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%,

putih (Rattus norvegicus). Induksi NaOH 96% dan absolut) masing-masing 60 menit.

dilakukan dengan menggunakan kertas filer Kemudian dilakukan clearing menggunakan

xylol 2 kali masing-masing 60 menit. menggunakan 5% FBS yang mengandung

Infiltrasi dengan paraffin lunak selama 60 0,25% Triton X-100. Slide dicuci

menit pada suhu 49˚C. dilakukan blok dalam menggunakan PBS pH 7,4 tiga kali, selama

parafin keras pada cetakan dan didiamkan 5 menit. Slide diinkubasi menggunakan

selama sehari. Parafin ditempelkan pada antibody primer selama 60 menit pada suhu

holder dan dilakukan pemotongan setebal 4 ruang. Slide dicuci menggunakan PBS pH

µM dengan rotary microtome secara 7,4 tiga kali, selama 5 menit. Slide

melintang di daerah sekitar defek kornea. diinkubasi menggunakan polymer conjugate

Dilakukan mounting pada gelas obyek selama 40 menit pada suhu ruang. Slide

dengan gelatin 5 %. Untuk proses ditetesi dengan DAB (DiaminoBenzidine)

deparafinisasi dengan cara gelas obyek hasil dan inkubasi selama 10 menit. Slide dicuci

parafin blok direndam dalam xylol 2 kali menggunakan PBS pH 7,4 tiga kali, selama

masing-masing selama 5 menit. Dilakukan 5 menit. Selanjutnya cuci menggunakan

rehidrasi menggunakan alcohol berseri Gelatine 5% dH20, selama 5 menit.

(absolut, 96%, 80%, 70%, 50%, dan 30%) Counterstaining menggunakan Mayer

masing-masing selama 5 menit. Dibilas Hematoxilen yang diinkubasi selama 10

dengan Gelatine 5% dH2O selama 5 menit. menit dan cuci menggunakan tap water.

Slide dicuci dengan PBS pH 7,4 satu Slide dibilas menggunakan Gelatine 5%

kali selama 5 menit kemudian dibloking dH2O dan kering anginkan. Untuk mounting

endogenous peroksida menggunakan 3% digunakan entelan dan tutup dengan cover

H2O2 selama 20 menit. Slide dicuci glass. Distribusi TNF-α diamati pada

menggunakan PBS pH 7,4 tiga kali, selama mikroskop cahaya.

5 menit. Slide dibloking unspesific protein

Analisa Data HASIL PENELITIAN

Data dianalisis dengan menggunakan

uji one way Anova untuk membuktikan

adanya perbedaan antara kontrol, dosis

pemberian genistein topikal tetes mata

terhadap perubahan ekspresi TNF-

αberdasarkan waktu perlakuan pada kornea

tikus. Uji statistik dikatakan bermakna bila

p<0.05. Uji homegenitas sampel Gambar 5.1. Data Perubahan

menggunakan menggunakan lavene statistic Eskpresi TNF-α

dan normalitas sampel mengunakan uji

Gambaran ekspresi TNF-α setelah 24
kolmogorof-smirnov. Jika didapatkan
jam induksi NaOH 1 M menggunakan
perbedaan, dilanjutkan dengan uji rentang
mikroskop cahaya pembesaran 400x. .(a)
ganda post hoc test (mutiple comparison,
control positif, (b) dosis 0,25 mg/ml (c) 0,50
Tukey). Untuk mengetahui korelasi
mg/ml dan (d) 1 mg/ml. Anak panah
pengaruh konsentrasi pemberian genistein
menunjukkan ekspresi TNF-α berwarna
terhadap TNF-α digunakan uji korelasi-
kecoklatan.
regresi. Proses perhitungan dilakukan
Tabel 5.1 Hasil Penelitian Ekspresi
dengan bantuan perangkat lunak komputer
TNF – α pada kornea mata Tikus (Rattus
program SPSS 16 for windows.
Novergicus Strain Wistar Jantan)

Perlak Ulangan sampel  Ra Stan

uan ta- dar
rata devi
asi 
 1 2 3 4 5 6 topikal dengan dosis 1 mg/ml, 0.5 mg/ml
K(-) 0 0 0 0 0 0 0 0
2 2 2 2 2 2 20. 0.98 dan dosis 0.25 mg/ml menunjukkan efek
K(+) 2 0 0 1 0 2 83 3 atau pengaruh yang berbeda jika
1 1 1 1 1 1 15. 1.96
D1 7 3 7 4 5 8 67 6 dibandingkan dengan kontrol positif.
1 1.54
Adapun adanya perbedaan ekspresi
D2 9 6 9 7 7 0 8 9
0.54 TNF-α pada kornea mata tikus (Rattus
D3 2 3 2 3 2 3 2.5 8
Novergicus Strain Wistar Jantan) secara

Berdasarkan Tabel 5.1 di atas terlihat keseluruhan pada setiap perlakuan di atas

bahwa adanya pengaruh pemberian genistein juga dapat digambarkan dalam bentuk

topikal tersebut mulai terlihat dimana grafik sebagai berikut:

ekspresi TNF-α pada kornea mata tikus

wistar menjadi lebih kecil setelah diberikan

perlakuan berupa genistein topikal mulai

pada dosis 1 mg/ml dibandingkan dengan

ekspresi TNF-α pada kelompok kontrol

Gambar 5.2 Grafik Ekspresi TNF alpha
positif. Kemudian ekspresi TNF-α pada
pada kornea mata Tikus (Rattus
kornea mata tikus wistar cenderung semakin
Novergicus Strain Wistar Jantan) pada
menurun ketika diberi dosis 0.5 mg/ml dan
setiap perlakuan
0.25 mg/ml. Dengan demikian, berdasarkan

penilaian secara deskriptif menurut rata-rata 5.2. Analisis Data

ekspresi TNF-α pada kornea mata tikus
5.2.1 Analisis data ekspresi TNF-α dengan
wistar tersebut, maka dapat dikatakan bahwa
menggunakan Uji One Way Anova
pemberian perlakuan berupa genistein
 Penelitian ini menggunakan pemberian sehingga Ho ditolak, dan dapat disimpulkan

genistein topikal dengan 3 variasi dosis bahwa pemberian genistein topikal

genistein topikal yang diuji coba di menunjukkan adanya perbedaan yang

laboratorium (dosis 1 mg/ml, 0.5 mg/ml bermakna (signifikan) terhadap ekspresi

dandosis 0.25 mg/ml). TNF-α pada kornea mata tikus (Rattus

Novergicus Strain Wistar Jantan).

Hipotesis ditentukan melalui H0

diterima bila nilai signifikansi yang Adanya perbedaan ekspresi TNF-α

diperoleh > alpha 0,05, sedangkan H0 pada kornea mata tikus wistar sebagai efek

ditolak bila nilai signifikansi yang diperoleh dari setiap perlakuan tersebut dapat dilihat

< alpha 0,05. pada gambar 5.3 sebagai berikut:

Selanjutnya, di bawah ini adalah hasil 25

uji ANOVA dari ekspresi TNF-α pada 20 20.83

Rerata Ekspresi TNFalpha

15 15.67
kornea mata tikus (Rattus Novergicus Strain
10

Wistar Jantan) pada setiap perlakuan. 8.00

5

2.50 0.00
Tabel 5.2 Tabel Hasil Uji ANOVA 0
K (+) Dosis 1 mg/ml Dosis 0.5 mg/ml Dosis 0.25 mg/ml K (-)
Kelompok Perlakuan

Keterangan p-value

ekspresi TNF alpha 0.000 Gambar 5.3 Grafik Ekspresi TNF alpha
Berdasarkan hasil analisis ragam pada pada kornea mata Tikus (Rattus
Tabel 5.2, menunjukkan bahwa pada setiap Novergicus Strain Wistar Jantan)
perlakuan yang diberikan (kontrol negatif,
Berdasarkan plot respon tersebut dapat
kontrol positif, dosis 1 mg/ml, 0.5 mg/ml
dibentuk urutan dari efek perlakuan terhadap
dandosis 0.25 mg/ml) menunjukkan nilai
ekspresi TNF-α pada kornea mata tikus
signifikansi sebesar 0.000 (p<0,05),
wistar dari urutan yang paling tinggi sampai 0.25

dengan ekspresi TNF-α pada kornea mata mg/

tikus wistar yang paling rendah, sebagai ml 5

berikut : Dosis

0.5
Tabel 5.3. Tabel Urutan Ekspresi
3
mg/ 8.00±1.5
TNF alpha pada kornea mata Tikus
ml 5
Sebagai Efek Dari Pemberian genistein
Dosis
topikal
1
N Ekspresi 4
mg/ 15.67±1.
o TNF
ml 97
alpha 20.83±0.
pada 5
K (+) 98
Perla
kornea
kuan
mata
Pemberian genistein topikal pada
tikus
dosis 0.25 mg/ml dapat menyebabkan
(mean±st
ekspresi TNF-α pada kornea mata tikus
d.dev.)
wistar menurun hingga mempunyai rata-rata
Kont
yang paling rendah (mean 2.5) daripada
rol
pemberian genistein topikal pada dosis yang
1 Nega
lebih rendah yaitu dosis 0.5 mg/ml, sehingga
tif
dosis 0.25 mg/ml lebih efektif daripada
(KN) 0±0
dosis 0.5 mg/ml. Pemberian genistein
2 Dosis 2.50±0.5
topikal pada dosis 0.5 mg/ml, dapat
menyebabkan rata-rata ekspresi TNF-α pada genistein

kornea mata tikus wistar lebih menurun topikal

dibandingkan dengan pada dosis 1 mg/ml, dengan korelasi

sehingga dosis 0.5 mg/ml lebih efektif ekspresi 0.9 00 yang

daripada dosis 1 mg/ml. Namun pemberian TNF alpha 78 0 signifika

genistein topikal pada dosis 1 mg/ml dapat pada n

menyebabkan rata-rata ekspresi TNF alpha kornea

pada kornea mata tikus wistar yang lebih mata tikus

Berdasarkan hasil analisis pada Tabel
rendah daripada kontrol positif (KP),
5.5 di atas dapat diketahui bahwa pemberian
sehingga dosis 1 mg/ml lebih efektif
genistein topikal dengan ekspresi TNF-α
daripada KP.
pada kornea mata tikus (Rattus Novergicus
5.2.3 Pengujian Korelasi dan Regresi
Strain Wistar Jantan) (r= -0.978, p=0.000)
Untuk mengetahui besarnya hubungan mempunyai hubungan (korelasi) yang
dan pengaruh dari pemberian genistein signifikan (p<0.05) dengan arah korelasi
topikal dengan ekspresi TNF alpha pada yang negatif (karena koefisien korelasi
kornea mata tikus (Rattus Novergicus Strain bernilai negatif). Artinya peningkatan
Wistar Jantan), maka digunakan uji korelasi perlakuan berupa dosis genistein topikal
dan regresi linier, dengan hasil pengujian cenderung akan menurunkan ekspresi TNF-
pada lampiran. α pada kornea mata tikus (Rattus

Tabel 5.4. Uji Korelasi Novergicus Strain Wistar Jantan),

dibandingkan dengan ekspresi TNF-α pada

Kesimpu
Keterangan R P kornea mata pada kelompok kontrol.
lan
Pemberian - . Ada
 Berdasarkan hasil pengujian dengan Strain Wistar Jantan) secara konstan akan

menggunakan analisis regresi linier, dengan cenderung tetap tinggi 25.85 satuan (karena

hasil persamaan regresi pada setiap koefisien konstanta bernilai positif). Namun

konsentrasi sebagai berikut. apabila dipengaruhi oleh perlakuan dosis

genistein topikal justru akan menyebabkan

Persamaan regresi R Square
ekspresi TNF alpha pada kornea mata tikus
Y = 25.85 – 5.483 X 95,7%
(Rattus Novergicus Strain Wistar Jantan)
Keterangan:
mengalami penurunan hingga 5.483 satuan
Y = ekspresi TNF-α pada kornea
untuk setiap peningkatan dosis genistein
mata tikus wistar
topikal.

X = Dosis genistein
Berdasarkan hasil uji regresi juga

Adapun model regresi dari pengaruh menunjukkan nilai koefisien determinasi (R

pemberian genistein topikal dengan ekspresi Square=r2) yang menyatakan besarnya

TNF alpha pada kornea mata tikus (Rattus pengaruh dari pemberian genistein topikal

Novergicus Strain Wistar Jantan) yaitu Y = terhadap ekspresi TNF-α pada kornea mata

25.85 – 5.483 X, dimana Y adalah ekspresi tikus (Rattus Novergicus Strain Wistar

TNF alpha pada kornea mata tikus (Rattus Jantan), dalam bentuk persentase, dan

Novergicus Strain Wistar Jantan), persentase sisanya (1-R Square) ditentukan

sedangkan X adalah perlakuan pemberian oleh faktor lain. Jadi dapat dikatakan bahwa

genistein topikal. Hal ini dapat diartikan pemberian genistein topikal sangat

bahwa tanpa dipengaruhi oleh pemberian berpengaruh terhadap ekspresi TNF-α pada

genistein topikal, maka ekspresi TNF alpha kornea mata tikus (Rattus Novergicus Strain

pada kornea mata tikus (Rattus Novergicus Wistar Jantan) hingga 95.7%. Sedangkan
4.3% keragaman ekspresi TNF-α pada
Linear Regression


kornea mata tikus (Rattus Novergicus Strain 20.00







Wistar Jantan) tersebut dipengaruhi oleh

Ekspresi TNF alpha


15.00



faktor lain selain dari pemberian genistein 10.00 



topikal. Sehingga semakin tinggi dosis 5.00






pemberian genistein topikal yang 0.00 

Ekspresi TNF alpha = 25.85 + -5.48 * Perlakuan
R-Square = 0.96

dipergunakan, maka berpengaruh signifikan 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00

Kelompok

dalam menurunkan ekspresi TNF-α pada

kornea mata tikus (Rattus Novergicus Strain Gambar 5.4 Grafik linieritas

Wistar Jantan).
Berdasarkan grafik linieritas di atas
Adanya pengaruh yang signifikan dari terlihat bahwa garis regresi antara
pemberian genistein topikal dalam pemberian genistein topikal dengan ekspresi
menurunkan ekspresi TNF-α pada kornea TNF-α pada kornea mata tikus (Rattus
mata tikus (Rattus Novergicus Strain Wistar Novergicus Strain Wistar Jantan) mengarah
Jantan), berdasarkan hasil penelitian dapat ke kanan bawah. Hal ini membuktikan
ditunjukkan dalam bentuk grafik linieritas adanya linieritas dari pemberian genistein
sebagai berikut: topikal dengan ekspresi TNF-α pada kornea

mata tikus (Rattus Novergicus Strain Wistar

Jantan). Artinya peningkatan perlakuan

berupa pemberian dosis genistein topikal

cenderung akan menurunkan ekspresi TNF-

α pada kornea mata tikus (Rattus

Novergicus Strain Wistar Jantan),

dibandingkan dengan ekspresi TNF-α pada

kornea mata pada kelompok kontrol.