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Tabla I. Diferencias en la fisiología de los embriones de mamíferos desde el etsadio de cigoto al de blastocito (Lane y Gradner, 2007).
Cuando la mórula está formada, las que causan la lisis de la ZP, pero podrían y bioquímicamente activas bajo su propio
blastómeras empiezan a separarse en 2 estar involucrados fenómenos mecánicos, control genético en el estadio de blasto-
poblaciones distintas: las células internas enzimas embrionarias o factores uterinos. cisto (Lane y Gardner, 2007). Como resul-
y las externas. Las células de la posición Tras la eclosión (blastocisto eclosionado), tado de estos cambios, existen diferentes
interna desarrollan uniones que por un los blastocistos porcinos permanecen en demandas y requerimientos, para el desa-
lado permiten la comunicación intercelular la luz del útero hasta el día 13. Entre la rrollo y diferenciación embrionarios, el
y, por otro, van a mantener agrupado a eclosión y la implantación, el desarrollo cual requiere de una precisa regulación de
este conjunto celular. Las células externas embrionario es peor soportado por los la homeostasis, metabolismo y expresión
van a desarrollar uniones estrechas, que se sistemas in vitro que en estadios más génica. (Tabla 1).
producen para modificar las características tempranos. Por ejemplo, la elongación y
de permeabilidad. Después de que se hayan expansión de los blastocistos eclosionados,
formado las uniones estrechas, los fluidos al ser dependiente de factores uterinos, no
empiezan a acumularse en el interior del tiene lugar in vitro. Por tanto, el desarrollo k Diferencias fisiológicas
embrión. Este acúmulo de fluido se debe embrionario in vitro se da por concluido en el oviducto y útero
a la acción de la bomba de sodio, la cual tras la eclosión del blastocisto.
introduce iones al interior de la mórula;
al aumentar la concentración de éstos, el
agua difunde hacia el interior y comienza kFisiología dinámica en el Diversos estudios en embriones de
a formarse la cavidad o blastocele en la embrión pre-implantacional mamíferos han determinado que los cam-
masa de células. Esta etapa, en la que el bios morfológicos que ocurren durante
embrión aún se encuentra rodeado por la el desarrollo desde cigoto hasta estadio
zona pelúcida (ZP), recibe el nombre de de blastocisto ocurren concomitantemen-
blastocisto y en él se diferencian según su El embrión pre-implantacional es un te junto con cambios en el metabolismo
posición dos poblaciones de células: una periodo altamente dinámico durante el del embrión. Los nutrientes disponibles
interna (masa celular interna) que dará ori- cual el embrión en estadio pronuclear se en el tracto reproductivo de la hembra se
gen al embrión propiamente dicho, y otra, desarrolla desde una relativa quiescencia encuentran en estrecha relación con el
la situada periféricamente, que origina el ovocitaria bajo el control genético mater- estadio de desarrollo embrionario (Tabla 2).
trofoectodermo o trofoblasto, que intervie- no hasta un grupo de células metabólica Por ejemplo, en el estadio de precompac-
ne en la ingestión selectiva de nutrientes y
Figura 1. Blastocisto porcino de 6 días cultivado in Vitro, eclosionando.
formará posteriormente la placenta (Hafez,
2000). Las células del trofoblasto tienen
permeabilidad selectiva, lo cual favorece el
transporte de agua y sodio que contribuye
a la formación del blastocele (revisado por
García-Roselló 2005); momento a partir del
cual el embrión alcanza el estadio de blas-
tocisto. El estadio de blastocisto se alcanza
en el día 5-6 (Figura 1).
Tabla II. Diferencias fisiológicas entre el oviducto y el útero durante el desarrollo embrionario de los mamíferos (Lane y Gradner, 2007).
tación, es decir cuando el embrión reside Pero el mantenimiento de bajos nive- el desarrollo a blastocisto, así como el
en el oviducto, el fluido se caracteriza por les de oxígeno en un incubador grande número de células de los blastocistos en
una alta concentración de piruvato y de es costoso ya que hay que usar grandes varias especies (murina, humana, bovina
lactato, y una relativa baja concentración niveles de N2 que desplacen el oxígeno. y ovina) (revisado por Martínez, 2002).
de glucosa. Por el contrario, el fluido ute- Por ello, se han diseñado alternativas Según Stokes et al. (2005), los embrio-
rino está caracterizado por unos relativa- como el uso de mini-incubadores (Karja nes porcinos deben cultivarse en grupos
mente bajos niveles de piruvato y lactato, et al. 2004), que también han sido exi- 10-20 embriones/20 μl de medio. Otros
y una alta concentración de glucosa. tosamente usados en FIV y en clonación. autores en cambio han obtenido bue-
mulando su propio desarrollo y el de los • La higiene en el laboratorio es también lizando volúmenes de 400 μl de medio.
embriones vecinos. Según esto, el cultivo importante en la producción embrio- Beneficios similares también han sido
en volúmenes grandes daría lugar a la naria (Schiewe, 1998). La producción demostrados en otras especies como la
dilución de los factores beneficiosos pro- de embriones in vitro debe tener lugar especie porcina, humana y murina (Taka
ducidos por el embrión, de tal modo que en un ambiente limpio. Comer y beber et al. 2005; Vajta et al. 2008).
la concentración presente en el medio de está totalmente prohibido, las manos
cultivo no sería suficiente para ejercer deben lavarse periódicamente con • Tubos
dicho efecto (Gardner, 1994). agua y jabón, y enjuagarse con alcohol
(por ejemplo, etanol), pero teniendo Recientemente, Roh et al. (2008), cultiva-
El desarrollo embrionario también se en cuenta que los vapores del alcohol ron embriones de ratón en microtubos
encuentra influenciado por la distancia a pueden perjudicar el desarrollo embrio- normalmente usados en PCR. Como ya
la cual se encuentren los embriones entre nario. hemos descrito anteriormente, el aceite
si al ser cultivados. Recientemente, Stokes que se usa en cultivos embrionarios
et al. (2005) publicaron un estudio donde puede ser perjudicial, con este siste-
cultivaban los embriones porcinos con Métodos de cultivo embrionario ma se pretende reducir o eliminar por
una distancia determinada entre ellos. En completo el contacto entre el aceite y
este estudio los embriones no se movían Históricamente el cultivo embrio- el medio de cultivo. Además, otra de
ya que la placa de petri estaba cubierta nario se ha realizado en placas de cultivo (de las ventajas de usar estos microtubos
con extractos de proteína polifenólicas. 4 pocillos, placas de 20 mm de diámetro…), es que los embriones van a estar unos
Concluyeron que la distancia óptima de en diferentes condiciones de volumen de más cerca de otros que en una placa o
cultivo entre embriones se encontraba medio y densidad embrionaria, como ya microgota; y aunque según otros estu-
entre 60 y 180 μm. En los embrio- hemos mencionado anteriormente. Pero dios, tienen que tener cierta separación
nes cultivados en distancias más cortas
posiblemente dichos efectos beneficiosos
se neutralicen debido a concentraciones
altas y localizadas de metabolitos tóxicos
como el amonio. Y con distancias supe-
riores a 180 μm los factores beneficiosos
quedan diluidos.
sistema se quedó en el olvido hasta el imitara, en la medida de lo posible, las de ósmosis reversa. En estos equipos, el
año 2003, donde Thouas et al. cultivaron condiciones ambientales a las que está grado de pureza del agua puede ser con-
embriones de ratón en microcapilares de sometido el embrión in vivo. De esta mane- trolado mediante la determinación de su
vidrio (también denominados oviductos ra vamos a promover una actividad meta- resistencia al paso de la corriente eléctrica
de vidrio), cultivados verticalmente en bólica normal y un desarrollo máximo del (cuanto mayor sea ésta, mayor será su
Figura 3. Esquema de los movimientos del embrión in vivo en el aparato reproductor femenino y sistema de microcanales in vitro del
cultivo embrionario (Kim et al. 2009).
IN VIVO
Aceite mineral Entrada Reserva aceite
Lámina cristal
1 μl de medio, obteniendo blastocistos embrión in vitro. En términos generales, pureza). La mayor resistencia ofrecida es
con un mayor número de células en un medio de cultivo embrionario debe de 18,3 megaohms-cm a 25°C.
comparación con el cultivo en micro- estar compuesto por agua, sales inorgá-
gotas. Hasta el momento este sistema nicas, compuestos energéticos, proteínas, • Sales inorgánicas:
no ha sido desarrollado en la especie aminoácidos, quelantes, hormonas del cre-
porcina, aunque podría proporcionar cimiento o vitaminas, antibióticos, etc. Una Normalmente la composición de
una buena herramienta y alternativa a vez preparados, los medios de cultivo se sales inorgánicas de un medio de cultivo
los métodos tradicionales. esterilizan por filtración, haciéndolos pasar pretende imitar los componentes analiza-
a través de una membrana con un diáme- dos in vivo. Se ha determinado que el flui-
• Microfluidos y microcanales tro de poro de 0’22 μm. Debemos de tener do oviductal bovino y ovino se caracteriza
en cuenta que algunos de los componentes por tener por bajos niveles de Na+ y altos
Otra alternativa para el desarrollo embrio- se pueden degradar espontáneamente por niveles de K+ si se comparan con los nive-
nario es el uso de microfluidos en lo que se adicionan inmediatamente antes les plasmáticos, por ello, estos dos ele-
microcanales donde se sitúan los de su utilización. mentos son cuidadosamente balanceados
embriones. El éxito inicial del uso de al formular los medios de cultivo. Entre
microcanales en el cultivo embrionario En cualquier medio de cultivo hay que otros elementos inorgánicos importantes
en ratones (Raty et al. 2001) ha dado tener presente la osmolaridad que necesi- en la composición de los medios encon-
lugar al cultivo de embriones de otras tan las células a cultivar y el mantenimien- tramos: magnesio, calcio, bicarbonato,
especies incluida el cerdo. Walters et al. to del pH. En cuanto a la osmolaridad, se sulfatos y fosfatos. Son muchas las fun-
(2003) cultivaron embriones de 4 célu- ha determinado que los valores observados ciones de estas sales, a modo de ejemplo
las hasta el estadio de blastocisto en en las secreciones uterinas oscilan entre podemos citar el papel del cloruro sódico
microcanales dando lugar finalmente a los 280 ± 20 mOsm/Kg. Sin embargo, exis- que participa en la regulación osmótica o
la producción de lechones vivos. Kim et ten evidencias que indican que valores de el calcio y el potasio que son esenciales
al. (2009), desarrollaron un novedoso alrededor de 245 mOsm/Kg favorecen el para un desarrollo embrionario adecuado
sistema de microfluidos basado en la desarrollo embrionario (Duque y col 2003). (Palasz, 1996). No obstante, en cualquier
estimulación mecánica derivada de la En lo referente al pH, la mayoría de los medio de cultivo embrionario hay dos ele-
peristalsis. Para investigar los efec- embriones de mamíferos cultivados in vitro mentos constantes: una fuente energética
tos de la estimulación mecánica en el se desarrollan en pH neutro o ligeramente y una fuente proteica.
desarrollo embrionario en canales de alcalino, encontrándose los mejores resul-
microfluidos, los embriones de bovino tados entre 7,2 y 7,6. • Fuente energética:
fueron cultivados en canales rectos en
comparación con canales con aéreas • Agua: La glucosa es el principal substrato
de estrechez. Además se acopló un energético que consumen las células; sin
maquina agitadora para crear un flujo El componente que participa en embargo para embriones de porcino pare-
por gravedad. Este trabajo representa mayor proporción en la formulación de ce ser perjudicial en los primeros estadios
un intento de mimetizar la constricción cualquier medio de cultivo es el agua, por de desarrollo preimplantacional (Bavister,
peristáltica que ocurre in vivo en el ello su grado de pureza está fuertemente 1995). Durante esta etapa del desarrollo
útero (Figura 3). relacionado con el desarrollo embrionario se presenta una falta de utilización de
(Marquant-Leguienne y Humblot 1998). glucosa debido a la falta de actividad de la
Composición medios CE El agua que se utiliza para la elaboración enzima fosfofructoquinasa cuya función
de los medios de cultivo debe ser ultra- es acelerar la glucólisis catalizando la for-
El diseño del medio de cultivo ópti- pura y libre de pirógenos. Los sistemas de mación de fructosa 1-6 bifosfato a partir
mo debería ser, en principio, aquél que purificación del agua utilizan el principio de fructosa 6 fosfato, lo que se encuentra
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Cultivo embrionario in vitro en la especie porcina (I)
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controlada alostéricamente por el cociente inclusión de aminoácidos en el medio de fisiológico en que se encuentre el animal
ATP-ADP, siendo particularmente alto en cultivo aumenta el desarrollo embrionario del cual proceda (Palasz, 1996). Por otro
este período (Gardner, 1998). Además, la y aumenta la viabilidad del blastocisto. lado, también habría que determinar en
presencia de glucosa puede inhibir la fos- Además, estos elementos son utilizados que momento del cultivo embrionario se
forilación oxidativa cuando en este estadio como fuente de energía, como buffer intra- debería suplementar el medio. Se ha deter-
los embriones dependen de esta vía para celular (Edwars et al. 1998) y para la sín- minado que la adición de suero inhibe los
generar energía (Thompson, 2000). El piru- tesis de proteínas. Su incorporación a las primeros estadios de desarrollo aunque
vato y el lactato son las principales fuentes células se ve facilitada por transportadores estimula el desarrollo de mórulas y blas-
de energía en el embrión temprano durante de membrana específicos los cuales están tocistos (Pinyopummintr y Bavister, 1994;
el desarrollo in vitro (Pinyopummintr y regulados en función del grado de desarro- Thompson et al. 1998), acelera el desarrollo
Bavister, 1996). Sin embargo, tras la com- llo o en respuesta a señales externas (Van embrionario (Gómez y Diez, 2000; Holm et
pactación (estadio 8-16 células) el embrión Winkle, 2001). Otras funciones propuestas al. 2002) incrementa el número de células
utiliza la glucosa como fuente energética y son reguladores de presión osmótica, de embrionarias (Fouladi-Nashta et al. 2005)
es metabolizada principalmente a lactato pH, precursores biosintéticos, antioxidan- y favorece la eclosión (Wang et al. 1997;
(Sinclair et al. 2003). La explicación a este tes, quelantes… (Gardner, 2008). Gómez y Diez, 2000).
hecho se basa en que en el embrión en este
estadio y en respuesta a una alta demanda Con el fin de evitar la variabilidad
de energía necesaria para la compactación Macromoléculas debida a la diferente composición de
y la formación y expansión del blastoce- estas dos sustancias, suero y BSA, se ha
le (Gardner, 1998), el cociente ATP-ADP Varios son los sustratos que se han estudiado el uso de polímeros sintéticos
podría disminuir, y con ello, la inhibición utilizado como fuente de proteínas en los como sustitutos de ellas en la producción
ejercida sobre la enzima mencionada, con medios de cultivo embrionario entre los de embriones in vitro. Entre los polímeros
lo cual aumentaría el consumo de glucosa. que destacan el suero fetal bovino (SFB) y más estudiados se encuentra el alcohol
Este metabolito también participa en la la albúmina sérica bovina (BSA) (Wang et polivinílico y la polivinilpirrolidona (Ectors
síntesis de precursores de ácidos nucleicos al. 1997). et al. 1992; Gardner y Lane, 1998). Estos
y de lípidos (Gardner y Lane, 1998) y su compuestos han demostrado proveer una
disponibilidad sería importante durante la El suero constituye la fracción líquida buena actividad surfactante y previenen la
eclosión fuera de la zona pelúcida (Menezo resultante del proceso de coagulación san- adhesión entre gametos o con las super-
y Khatchadourian, 1990). Por esta razón, guínea y su composición presenta peque- ficies de contacto. No obstante, algunos
aunque se ha logrado cultivar embriones ñas variaciones dependiendo del animal. autores han encontrado una menor tasa
hasta el estado de blastocisto en medios Una molécula que siempre encontramos de producción de embriones así como
sin glucosa, éstos son de menor calidad y en el suero es la albúmina. Esta proteína diferencias metabólicas importantes entre
viabilidad cuando se comparan con los cul- tiene carácter ácido, es soluble en agua y embriones cultivados con o sin estos
tivados en medios con glucosa. Por tanto tiene un peso molecular aproximado de componentes (Thompson, 2000; Orsi y
la propuesta de Kikuchi (2004) en cuanto 69.000 kDa. La albúmina además de ser Leese, 2004).
a la utilización de un cultivo secuencial, uno de los componentes más importantes
piruvato y lactato como sustratos energé- del suero sanguíneo también es la proteí- • Otros componentes:
ticos durante las primeras 72 h de cultivo y na más abundante en el fluido oviductal
glucosa a partir de ese momento, sería una (Leese, 1988). Otros componentes que se utilizan
opción de mejora. para suplementar el medio de cultivo son
Algunos de los efectos benéficos que factores de crecimiento y hormonas como
Con respecto a los lípidos, poco se justifican la utilización del suero y la albú- la insulina que ayudan al transporte de
sabe acerca de la importancia que ten- mina son (revisado por Mucci et al. 2006): glucosa al blastocisto (Gardner y Kaye,
drían en la producción de energía duran- 1991), o agentes quelantes como el EDTA
te el desarrollo embrionario temprano i Proteger a los embriones en cultivo de que mejora el desarrollo en los primeros
(Thompson, 2000), aunque podría tener sustancias tóxicas (ej. metales pesa- estadios del embrión (revisado por Lane y
cierto papel en relación al grado de fluidez dos). Gardner, 2007).
de la membrana plasmática (Imai et al. i Aportar factores de crecimiento y ciertas
1997; Hochi et al. 1999). hormonas. En porcino se han utilizado gran
i Reducir la tensión superficial del medio cantidad de medios de cultivo para el
• Fuente proteica: (lo que evita que los embriones se desarrollo embrionario in vitro desde el
adhieran al instrumental como placas estadio de cigoto hasta el de blastocisto.
Aminoácidos de cultivo, pipetas, tubos, etc.). Entre ellos destacan el medio Whitten
(Beckmann y Day, 1993), NCSU 23 (Petters
Se ha determinado que tanto el fluido Tanto el suero como la BSA tienen un y Wells, 1993), Bavister (Polard et al.
oviductal como el uterino contienen altos papel similar como suplemento proteico. 1995), BECM-3 (Dobrinsky et al. 1996) o
niveles de aminoácidos libres. Por otro Sin embargo, la posible presencia de ele- PZM 5 (Yoshioka et al. 2008). De todos
lado, los ovocitos y embriones poseen mentos no identificados formando parte ellos, tal vez el más utilizado por los
transportes específicos de aminoácidos de su composición determinan que algunos buenos resultados obtenidos, ha sido el
para mantener un pool endógeno. Hasta aspectos de su función aún no sean com- NCSU 23. Yoshioka et al., (2002) realizó
el estadio de 8 células, aquellos aminoáci- pletamente conocidos (Mucci et al. 2006). un estudio sobre medios basado en la
dos presentes en niveles altos en el fluido En los últimos años, el suero ha sido objeto composición del fluido oviductal porcino
oviductal (aminoácidos no esenciales y de numerosos estudios para determinar en el que no suplementaba con glucosa
glutamina) incrementan la división celu- si su adición es definitivamente necesaria y lo comparó con el NCSU23. Aunque
lar y viabilidad. Tras la compactación, los para mejorar los resultados de producción los resultados obtenidos fueron simila-
aminoácidos no esenciales y la glutamina in vitro, en función de la cantidad y calidad res en cuanto a calidad embrionaria, lo
favorecen la formación del blastocele y de los embriones obtenidos. Los resulta- novedoso de este medio fue que estaba
los aminoácidos esenciales son requeri- dos de estos trabajos son muy variables e químicamente definido, lo cual permite
dos para el desarrollo y viabilidad de la incluso contradictorios y el motivo podría la reproducibilidad de las experiencias al
masa celular interna. Estudios sobre cul- encontrarse en la diferente composición eliminar los preparados proteicos de los
tivo de embriones han demostrado que la del suero, ya que éste depende del estado protocolos.
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