Efectul modificarii oxidative asupra proprietatilor structurale si

de spumare ale proteinei de albus

Oxidarea proteinei rezulta in modificarea structurala care ii afecteaza

functionalitatile. In acest studiu, a fost selectat 2,2'- azobis (2-amidino-propan)

dihidroclorid (AAPH) ca reprezentant al peroxidarii lipidelor pentru a investiga efectul

modificarii oxidative asupra proprietatilor structurale si de spumare a proteinei de albus.

Incubarea proteinei de albus cu AAPH a rezultat in modificari structurale, privind

schimbul de reactie intre sulfidril-disulfid si o crestere in formarea di-tirozinei.

Oxigenarea moderata a dus la expunerea grupurilor hidrofobice de proteina de albus, in

vreme ce, oxigenarea excesiva a indus o scadere in hidrofobicitatea de suprafata.

Distributia moleculara a greutatii si scanarea microscopiei electronilor a aratat ca proteina

de albus a suferit o agregare dupa oxidarea excesiva. De asemenea, dupa tratarea cu

AAPH la 0.2 mM, abilitatea de spumare a proteinei de albus a crescut de la 80.6% la

85.3%. Tratamentul de oxidare excesiva (5 si 25 mmol/L AAPH) a rezultat in abilitate de

spumare intensificata, in vreme ce si-a redus stabilitatea de spumare. Acest studio a

sugerat ca tratamentul cu oxidare are potentialul de a fi implementat pentru a modifica

proprietatile de spumare ale proteinei de albus.

Introducere

Datorita proprietatilor sale puternice de spumare, proteina de albus este folosita pe

scara larga ca si agent porofor in industria alimentara pentru a imbunatati si mentine

calitatea (textura si volumul) alimentelor aerate, cum ar fi torturile, prajiturile, cojile de

desert sau spumele de ciocolata. Spumele si bulele joaca un rol foarte important in aceste

produse alimentare in termeni de structura si textura. In timpul procesarii acestor produse,

proteina de albus poate incapsula si retine aer, astfel creand volumul spumei. Prin urmare,

imbunatatirea abilitatii de spumare a proteinei de albus este semnificativa pentru

ameliorarea calitatii produselor alimentare ce au la baza proteina de albus.

Adsorbtia proteinei la interfata aer-apa este cunoscuta pentru rolul esential pe care

il joaca in formarea si stabilizarea alimentelor sisteme disperse ca spuma. Cand aerul vine

in contact cu solutia din ou, proteina de ou poate adsorbi la interfata aer-apa si suferi

modificari conformationale rapide pentru a forma pelicule coezive vascoelastice. Starea

conformationala a proteinei a afectat puternic adsorbtia si reorganizarea stratului de

proteina de la interfata aer-apa. Pentru unele proteine, moleculele dezvelite pot adsorbi cu

mai multa usurinta la suprafata de bule de aer, si astfel au prezentat functionalitate de

spumare sporita. Cercetari anterioare au demonstrate ca ovalbumina denaturata a posedat

o putere de spumare mai puternica decat ovalbumina native datorita flexibilitatii crescute

si hidrofobicitatii de suprafata. Astfel, o oarecare masura de schimbare structurala ar

putea avea un impact benefic asupra formarii si stabilizarii de spuma in proteina de albus.

Materiale si metode

Materiale

Au fost achizitionate oua de gaina de la piata locala. AAPH, 1-anilino-8-naftalen-

sulfonat(ANS), 5,5’ ditiobis (2-nitrobenzoat) (DTNB), standardele de proteine pentru

studierea distributiei masei moleculare (MW), incluzand ser bovin albumin (66,000 Da),

anhidraza carbonica (29,000 Da) si aprotinina (6500 Da) au fost achizitionate de la

Sigma-Aldrich Co. LLC. (Shanghai, China). Toate celelalte chimicale au fost de grad de

agent reactiv.

Oxidarea proteinei de albus

Albusul a fost separate de galbenus si amestecat usor folosind un amestecator

magnetic, pentru a nu produce spuma pentru o ora la 4 grade Celsius, producand albus

omogen. Dupa aceasta, albusul a fost liofilizat si mentinut la -20 grade Celsius pana la

folosire (Kakalis & Regenstein, 1986). Modificarea oxidative a proteinei de albus a fost

procesata in conformitate cu metoda descrisa de Wu et al. (2009). Pentru o scurta durata,

dispersarea albusului (10 mg/mL, suspendata in 0.01 mol/l, tampon de fosfat de sodium,

pH 7.4) a fost amestecata cu o serie de concentratii de AAPH, iar apoi incubate prin

agitarea continua in aer la 37 grade Celsius in intuneric pentru 24 de ore. Concentratia

finala a AAPH a fost zero (control), 0.04, 0.2, 1, 5, si 25 mM. Reactia a fost oprita prin

racirea imediata a dispersiilor la 0-4 grade Celsius prin bai cu gheata. Dupa centrifugarea

la 5000 g pentru o ora la 4 grade Celsius pentru a indeparta mici cantitati de substante

insolubile care au fost formate in timpul racirii substantei, dispersiile de proteine au fost

dializate in apa deionizata la 4 grade Celsius pentru 72 de ore, pentru a indeparta AAPH

residual iar apoi au fost uscate prin congelare si au fost stocate la -20 grade Celsius.

Determinarea formarii di-tirozinei

Formarea ditirozinei a fost estimata prin metoda Morzel, Gatellier, Sayd, Renerre

si Laville (2006). Cantitati cantarite de probe uscare prin congelare (10 mg) au fost
dizolvate in 5 mL de solutie-tampon ionica puternica ) (20 mM de solutie-tampon de

fosfat la pH6 continand 0.6 M KCI). Concentratia proteinei a fost estimata prin metoda

Biuret (Kakalis & Regenstein, 1986). Continutul ditirozinei a fost estimat prin masurarea

fluorescenta la 420 nm dupa excitarea la 325 nm, folosind un spectrometru de

fluorescenta Hitachi F4500. Fluorescenta corectata a fost obtinuta prin divizarea

fluorescentei masurate prin concentrarea proteinelor. Rezultatele au fost exprimate in

unitati arbitrare.

Hidrofobicitatea de suprafata

Hidrofobicitatea proteinelor a fost determinata prin urmarea metodei Wang, Chen,

et. al, (2014), Wang, Tao, et al. (2014), cu mici modificari. Fiecare mostra a fost diluata

in cinci concentratii intre proteina de 0.0% si 0.1% (wt/wt) in 10 mM de solutie tampon

de fosfat (pH 7.0). Apoi, au fost adaugate alicote (20 uL) ale ANS (8.0 mM in aceeasi

solutie tampon) in 4 mL de solutii proteice. Solutiile au fost lasate in intuneric pentru 3

minute si plasate in celula unui spectrometru de fluorescenta Hitachi F4500 (Tokyo,

Japonia), iar intensitatea fluorescentei a fost masurata la 470 nm, folosind excitatie la 390

nm, latimea fantei 5nm. Solutii de calibrare corespunzatoare solutiei tampon au fost

substrase pentru a corecta fluorescenta de fundal. Hidrofobicitatea a fost determinate

conform metodei de panta a lui Alizadeh-Pasdar si Li-Chan (2000).

Structurile secundare
 Schimbarile in structurile secundare ale proteinei de albus au fost determinate

folosind spectrofotometrul cu transformare in infrarosu Fourier (FTIR, Bruker,

Germania). Mostrele de proteina au fost amestecate manual cu KBr in raport de 1:200 si

macinate intr-un mojar cu pistil. Pudrele au fost presate in straturi subtiri sub o presiune

de 4 tone. Scanarile cu infrarosu ale capacitatii de absorbtie a radiatiilor au fost analizate

intr-o gama de 4000-400 cm pentru schimbari in intensitate in esantioanele

representative, cu aerul ca si mediu. Spectrele au fost analizate cu pachetul software

Omnic (versiunea 6.1a, Thermo Nicolet Corp) si Peakfit v4.12 (SYSTAT Software inc.)

Distributia moleculara

Distributia moleculara a profilelor de proteina de albus a fost estimate conform

metodei descries de Liu et al. (2012). Pentru acest experiment s-a folosit un sistem de

cromatografie lichida Waters 600 (Waters Co., Milford, MA, USA), echipat cu un

detector de raze UV 2487. Detectorul de UV a fost setat la 215 nm. Coloana folosita a

fost un ape baza de silice (TSK G3000SWXL, 300 x 6.5 mm, Tosoh Co., Tokyo,

Japonia), in vreme ce faza mobile consistand in soluție tamponată cu fosfat a fost

distribuita la o viteza de curgere de o.5 mL/min si 20 uL de mostre au fost injectate in

sistemul de cromatografie de performanta ridicata. A fost obtinuta o curba de calibrare a

masei moleculare urmand standardele: ser bovin de albumina (66.000 Da), anhidraza

carbonica (29.000 Da) si aprotinina (6500 Da).

Concluzie

In aceasta lucrare au fost investigate proprietatile structurale si de spumare ale

proteinei de albus supuse tratamentului de oxidare. Rezultatele au indicat ca tratamentul

de oxidare ar putea modifica aranjamentul molecular si interactiunea proteinei de albus

prin schimbarea formatului de ditorizina, schimbului sulfhidril-disulfit, hidrofobicitatii de

suprafata si structurilor secundare. In paralel, tratamentul de oxidare moderata (tratat cu

0.2 mmol/L AAPH) ar putea spori proprietatile de spumare ale proteinei de albus. Intre

timp, tratamentul de oxidare excesiva (25 mmol/L AAPH) a rezultat intr-o agregare mai

mare, oxidarea proteica in acest stadiu ar creste abilitatea de spumare a proteinei de albus,

in vreme ce i-ar scadea stabilitatea spumarii. Aceste rezultate au sugerat ca tratamentul de

oxidare ar putea fi o abordare utila pentru a modifica abilitatile de spumare ale proteinei

de albus.