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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

CURSO PRÁCTICO DE
BIOINGENIERÍA I

BIOCINÉTICA

ACADEMIA DE FERMENTACIONES

Cd. de México 2018


CURSO PRÁCTICO DE BIOINGENIERÍA I

CONTENIDO
Título de la práctica Pág.

Inversión continua de sacarosa en un reactor enzimático de lecho fijo 1

Obtención de modelos cinéticos de crecimiento y consumo 10

Oxidación biológica de etanol en un reactor de lecho fijo 17

Validación experimental de un sistema de fermentación FED-BATCH con 23

alimentación exponencial

Tratamiento biológico de aguas residuales 31

PROFESORES PARTICIPANTES

Dra. Deifilia Ahuatzi Chacón


Dra. Cleotilde Juárez Ramírez
Dra. Nora Ruiz Ordaz
Dra. Angélica María Salmerón Alcocer
M.C. María Elena Mondragón Parada
I.B.Q. Raúl Chávez Alvircio
Dr. Juvencio Galíndez Mayer
Dr. Hugo Velasco Bedrán
M.C. Alejandro Hernández Estévez
M.C. Carlos Alberto Sandoval Carrasco
INVERSIÓN CONTINUA DE SACAROSA EN UN
REACTOR ENZIMÁTICO DE LECHO FIJO

Introducción

Los sistemas biológicos con células inmovilizadas pueden darse en forma


natural o por técnicas creadas artificialmente y se emplean en procesos tales
como la bioconversión de etanol a ácido acético utilizando bacterias del
género Acetobacter, en la producción de antibióticos, de ácidos orgánicos o
en el tratamiento de aguas residuales empleando filtros percoladores o
rotatorios. Las investigaciones realizadas en esta área han cristalizado en
varias aplicaciones industriales como la isomerización de glucosa a fructuosa
utilizando Streptomyces sp., la producción de aminoácidos como L-aspártico
y L-alanina, empleando células de Escherichia coli y Pseudomonas
dacunhae, respectivamente.

Cuando en un proceso se requiere solamente una enzima, como en el caso de


la hidrólisis de algunos carbohidratos, su inmovilización implica una etapa
previa de recuperación y purificación. Este proceso puede evitarse si la
localización celular de la enzima permite la difusión del sustrato y de los
productos de reacción, como ocurre con algunas enzimas hidrolíticas
extracelulares de levaduras que se encuentran retenidas en la pared celular.
Las células constituyen, de forma natural un sistema de enzimas inmovilizas
accesibles al sustrato y están más protegidas de las alteraciones ambientales
en comparación con las enzimas aisladas.

La manera en que pueden emplearse las células inmovilizadas es muy


variada, se pueden utilizar células viables, como en los casos de la producción
de ácido acético a etanol y de cerveza, donde se involucra todo un sistema
multienzimático para obtener esos productos, o bien se pueden inmovilizar
células no viables como ocurre en la hidrólisis de sacarosa, donde interviene
una sola actividad enzimática correspondiente a la invertasa.

Inmovilización de células

Con el propósito de emplear el concepto más ampliamente aceptado por los


investigadores que trabajan en el área de sistemas con células inmovilizadas,
definiremos a éstas como “las células que están físicamente confinadas o

1
localizadas en una región y que retienen sus actividades catalíticas, para uso
continuo o repetido”.

Se han utilizado distintos tipos de soportes dependiendo del método de


inmovilización. Algunas de las propiedades fundamentales que debe poseer
cualquier soporte son:

✓ No reducir la actividad catalítica de la célula


✓ No reaccionar con el sustrato, producto o célula
✓ Mantener su integridad física y ser insoluble bajo las condiciones del
bioproceso
✓ Ser permeable a reactivos y productos, con un alto coeficiente de
difusión para ambos
✓ Ser resistente a la degradación microbiana
✓ Encontrarse disponible con calidad constante y precio aceptable

Los principales métodos de inmovilización se basan en la adsorción, el


atrapamiento físico y la unión química por enlace covalente.

Inmovilización por adsorción


Se basa en un fenómeno de adsorción en el que se mantienen las
interacciones electrostáticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de
hidrógeno, interacciones hidrófobas) entre las cargas de la célula y la carga
del soporte. Una variedad de células de levadura tales como Saccharomyces
cerevisiae, S. carlsbergensis, Candida tropicalis, se han inmovilizado por
adsorción en diferentes soportes como gomas, vidrio, cerámica, plástico, etc.

Inmovilización por atrapamiento


Está basado en el atrapamiento físico de las células dentro de una matriz,
como es el caso del atrapamiento en un gel o membrana. Los geles que se han
utilizado para inmovilizar células son: agar-agar, alginato, carragenina,
acrilamida.
También existe atrapamiento por medio de membranas de celofán o
cualquier membrana permeable al sustrato o producto pero no a la célula.

2
Existe en la literatura un gran número de microorganismos y soportes, con
los que se puede utilizar esta técnica de inmovilización.

Inmovilización por enlace covalente


El mecanismo de inmovilización está basado en la formación de uniones
covalentes entre el soporte activado y la superficie celular. Un soporte
activado se obtiene al modificar químicamente la superficie inerte del soporte
por medio de agentes multifuncionales; algunos de los más utilizados es el
glutaraldehído, bromuro de cianógeno e isocianato.
Algunos de los soportes usados en la inmovilización por enlace covalente son:
celulosa, CMC, DEAE, celulosa, agarosa, poliacrilamida, vidrio poroso, etc.

Biorreactores
Una de las características principales de un reactor que opere con células
inmovilizadas es su reducido esfuerzo cortante, debido a la facilidad de
ruptura del soporte, particularmente cuando se trata de material
inmovilizado en geles. Existe una gran variedad de reactores para trabajar
con células inmovilizadas, de éstos los más utilizados son:
✓ Columnas de lecho fijo que operan con flujo pistón
✓ Columnas de lecho fluidizado
✓ Reactores air-lift

MODELOS MATEMATICOS DESCRIPTIVOS

Modelo de formación de gradientes de concentración axial en reactores de


lecho fijo conteniendo células no viables, inmovilizadas en gel.

Los modelos describen la variación en la concentración de reactantes y


productos a lo largo del reactor, cuando éste opera en condiciones de
equilibrio dinámico. Algunas consideraciones realizadas para obtener el
modelo mencionado son:

✓ El reactor está empacado uniformemente


✓ El frente del flujo avanza uniformemente (se mantiene un flujo pistón)
✓ No hay flujo reverso en el reactor

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✓ No existen gradientes de temperatura o pH que alteren la velocidad de
reacción
✓ La velocidad de reacción sólo depende de la concentración de
reactantes, pudiendo estar inhibida por el propio sustrato o por sus
productos de reacción.

Primera aproximación.

Si se considera que en las condiciones de trabajo no se presenta inhibición de


la actividad enzimática por sustrato o por productos de reacción, pero pueden
presentarse problemas difusionales para el sustrato, la velocidad volumétrica
de reacción estará dada por:

1. Modelo de Powell

v = vmax s / (kap + s) , donde kap= (ks + Kd)

La constante kd representa limitaciones difusionales en el soporte de las


células y vmax = ke x , en donde ke es la velocidad específica de reacción de la
enzima contenida en el material celular y (x) es la concentración celular en el
gel soporte.

La actividad enzimática contenida en las células inmovilizadas puede


disminuir de acuerdo a la ecuación: x = xo e – ki t (inactivación de las enzimas
presentes en las células inmovilizadas). Durante la operación no se observó
una pérdida importante de la actividad enzimática, por lo que no se consideró
este fenómeno.

Cuando un reactor opera con flujo pistón y se mantiene en estado de


equilibrio dinámico, se consigue un gradiente estable de sustrato y
productos.

Si se considera además, que en el reactor prácticamente no se presenta


limitación por reactantes, del balance de materiales efectuado y bajo el
supuesto de que s >> kap y v vmax se obtiene que:

v = vmax s / (kap + s)= F (Si – s)/Vr

4
La función s=φ(F) estará dada por la solución de la cuadrática resultante:

s2 + [(vmax Vr/F)+ kap- Si]s - [kap Si] = 0 [1]

Para determinar la dependencia de (s) respecto al espesor del lecho fijo (Lr)
y a la velocidad de flujo (F) puede extenderse el modelo [1] a una
funcionalidad s=φ(Lr, F) sustituyendo el volumen de reacción: Vr =Ar Lr

s2 + [(vmax Ar Lr/F)+ kap- Si]s - [kap Si] = 0 [2]

Segunda aproximación.

Con el fin de considerar la inhibición de la velocidad de reacción a causa de


la acumulación de productos (p), puede plantearse otro modelo:

2. Modelo de Powell-Ghose-Tyagi (inhibición por producto)

v = [vmax s / (kap + s)] [1- (p/Pm)]

Haciendo un balance global de materiales en estado de equilibrio dinámico,


se tiene que el balance de sustrato:

v = [vmax s / (kap + s) ] [1- (p/Pm)]= F (Si – s)/Vr [3]

De acuerdo con la estequiometría de reacción para la inversión de sacarosa:


Yps= [2*180/(360-18)]; si en el flujo de entrada, la concentración de producto
es cero, se tiene que:

p= Yps (Si-s) y sustituyendo éste en la ecuación [3], se tiene que:

[vmax s / (kap + s) ] [1- (Yps {Si-s}/Pm)]= F (Si – s)/Vr

Resolviendo la ecuación para (s) y sustituyendo Vr= Ar Lr se obtiene la


cuadrática:

s2 [F Pm + vmax Ar Lr Yps] + s [F kapPm- F Pm Si+ vmax Ar Lr Pm-vmax ArLrYps Si] – F


kap Pm Si= 0

5
Tercera aproximación.

Con el fin de considerar la inhibición de la velocidad de reacción por sustrato


(s), se plantea un modelo lineal similar al anterior:

3. Modelo de Powell-Ghose-Tyagi (inhibición por sustrat0)

v = [vmax s / (kap + s)] [1- (s/Sm)]

Haciendo las mismas consideraciones que en el caso anterior, el balance


global de materiales en estado de equilibrio dinámico nos genera la ecuación:
v = [vmax s / (kap + s) ] [1- (s/Sm)]= F (Si – s)/Vr

Al resolver la ecuación para (s), se obtiene la cuadrática:

s2 [FSm - vmax Ar Lr] + s[F kap Sm- F Sm Si+ vmax Sm Ar Lr] – F kap Sm Si= 0

Objetivo
Obtención de simuladores que describan el comportamiento del reactor de
lecho fijo con células inmovilizadas en gel de agar, empleado para la hidrólisis
continua de sacarosa, así como su validación experimental.

Desarrollo experimental
Preparación de las células

Las células se cultivan por lote en un medio de sacarosa de 10 g/L con un


tiempo de incubación de 24 h a 28°C y con agitación constante.
Transcurrido ese tiempo, se obtendrá el paquete celular por centrifugación
a 3500 rpm durante 10 minutos.

Reducción de la viabilidad celular

Para reducir el crecimiento celular en el soporte, las células se inactivan


manteniéndolas en etanol de 96 °G.L. durante 24 h en refrigeración,
posteriormente se recuperan por centrifugación.

6
Inmovilización por atrapamiento en gel

La suspensión celular inactivada se lavará por lo menos dos veces y se


resuspenderá en 30 mL de agua destilada estéril. Cada 2 mL de suspensión
celular se adicionarán a 20 mL de una solución estéril de agar-agar al 4% a
45°C. La formación de las perlas se hace por extrusión de la mezcla utilizando
una micropipeta de 1 mL, las gotas se reciben en una probeta de 250 mL
sumergida en un baño de hielo que contiene tolueno frío. Se decanta el
tolueno y se lavan las esferas de agar-agar con agua destilada estéril para
eliminar los residuos del disolvente orgánico.

Hidrólisis continua utilizando una columna empacada

El reactor consiste de un soporte metálico que sostiene la columna de vidrio,


en su extremo inferior se alimenta la sacarosa y en la parte superior se
recupera el producto, contando con tomas de muestras a diferentes espesores
del lecho fijo (Lr). Para empacar la columna se alterna una capa de perlas de
agar-agar (células inmovilizadas) con una capa de perlas de vidrio, éstas
tienen la función de evitar la compactación de las perlas de gel dentro de la
columna.
Se alimenta una solución de sacarosa de 150 g/L, a diferentes flujos
utilizando una bomba peristáltica, una vez estabilizado el cultivo, se toman
muestras a diferentes alturas del reactor (Lr = 10, 20 y 30 cm), las muestras
se emplean para analizar la concentración de glucosa por el método de la
glucosa-oxidasa-peroxidasa.

Métodos analíticos

Determinación de glucosa

A una muestra de 100 μL diluida 1:100, se le adicionan a tiempos exactos 2


mL de una solución reguladora de fosfatos pH 7.0 conteniendo 2 μg de
glucosa oxidasa, 100 μg de peroxidasa y 300 μg de o-dianisidina.

Después de 7 minutos de incubación a temperatura ambiente, se detiene la


reacción por la adición de 2 mL de HCl 6 N. El color desarrollado se lee a 540
nm. Paralelamente se preparan dos controles con 100 μL de una solución de
glucosa 0.1 g/L en lugar de la solución problema y un blanco de reactivos con
100 μL de agua destilada.

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HOJA DE RESULTADOS

Si= 150 g/L Vr=_______ vmax=______________


Kap= ________ Pm= _______ Sm= __________

Flujo: _______ Grupo:_______ Equipo:________

Lr (cm) Dilución [glucosa] [s] exp [s] mod 1 [s] mod 2 [s] mod 3
10
20
30

Flujo: _______ Grupo:_______ Equipo:______

Lr (cm) Dilución [glucosa] [s] exp [s] mod 1 [s] mod 2 [s] mod 3
10
20
30

Flujo: _______ Grupo:_______ Equipo:______

Lr (cm) Dilución [glucosa] [s] exp [s] mod 1 [s] mod 2 [s] mod 3
10
20
30

Flujo: _______ Grupo:_______ Equipo:______

Lr (cm) Dilución [glucosa] [s] exp [s] mod 1 [s] mod 2 [s] mod 3
10
20
30

Flujo: _______ Grupo:_______ Equipo:______

Lr (cm) Dilución [glucosa] [s] exp [s] mod 1 [s] mod 2 [s] mod 3
10
20
30

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Informe

✓ Tabular los valores de la concentración de glucosa en el efluente de la


columna en función del flujo.
✓ Trazar la gráfica de eficiencia de hidrólisis ε = (Si-s)/Si, en función del
flujo de alimentación y del espesor del lecho fijo.
✓ Trazar la gráfica de productividad Rp=p D, donde D es la velocidad de
dilución; en función del flujo de alimentación y del espesor del lecho
fijo.
✓ Comparar los valores experimentales con los teóricos descritos por
cada uno de los modelos propuestos para las condiciones de operación
empleadas en la experimentación.
✓ Determinar el modelo más adecuado para describir el comportamiento
del reactor.
✓ Discusión y conclusiones.

Obras de consulta.

1. Akin, C. 1987.Biocatalys with immobilized cells. Biotechnol. Gen. Eng. Rev. 5:319-367.
2. Bajpai, P y A. Margaritis. 1985. Improvement of inulinase stability of calcium alginate
immobilized Kluyveromyces marxianus cells by treatment with hardening agents.
Enzyme Microb. Technol. 7:34-36.
3. Bernath, F. y K. Venkatasubramanian. 1986. Methods of enzyme inmmobilization. En:
Manual of industrial microbiology and biotechnology. Demain, A.y N. Solomon (eds.)
American Society for Microbiology. Washinton, D.C.
4. Cárdenas-Sánchez, Y. 1987. Establecimiento de las condiciones de operación para el
proceso de hidrólisis de jarabe de sacarosa utilizando la inulinasa de células de
Kluyveromyces fragilis inmovilizadas por atrapamiento. Tesis de licenciatura. ENCB.
IPN.
5. Dunnill, P. 1980. Immobilized cell and enzyme technology. En: New Horizons in
Industrial Microbiology. Royal Society London.
6. Klibanov, A. 1983. Immobilized enzymes and cells as practical catalysts. Science
219:722-727.
7. Medina-Muñoz, E. 1987. Utilización de la invertasa de céllas inmovilizadas de Candida
utilis para la hidrólisis de sacarosa. Tesis de licenciatura. ENCB. IPN.

9
OBTENCIÓN DE LAS CONSTANTES DE MODELOS
CINÉTICOS DE CRECIMIENTO Y CONSUMO DE
SUSTRATO

Introducción

La investigación del comportamiento cinético de un microorganismo en un


biorreactor se puede llevar a cabo de forma meramente empírica. Con este
enfoque, el comportamiento del reactor debería estudiarse bajo
prácticamente todas las combinaciones posibles de variables de operación y
los resultados expresarse como una serie de correlaciones, que podrían ser
de utilidad para estimar el comportamiento cuando se prueben nuevas
condiciones de operación. Este procedimiento empírico requiere de gran
cantidad de trabajo y pocos conocimientos acerca de los detalles del proceso
y consecuentemente aporta una limitada comprensión del comportamiento
fisiológico del microorganismo.

Otro enfoque para abordar, comprender y en su caso simular el proceso en


condiciones diferentes a las experimentales, es el empleo de modelos. Estos
deben derivarse de teorías bien establecidas y describirse en términos
matemáticos, de tal forma que se expresen como ecuaciones de trabajo para
el proceso. Para modelar es necesario considerar la naturaleza de todas las
variables importantes del proceso y sus efectos, así como definir cada
parámetro en términos cuantitativos. De esta forma, cada acción para afinar
el modelo lleva a una mejor comprensión del proceso y a definir con más
claridad los conceptos básicos.

Una vez que se formula un modelo se puede resolver y el comportamiento


predicho por éste se puede comparar con los resultados experimentales.
Cualquier diferencia observada se puede utilizar para redefinir o refinar el
modelo hasta tener una buena aproximación.

Una etapa esencial en el desarrollo de cualquier modelo es la formulación


adecuada de las ecuaciones de balance de masa y energía. A éstas deben
agregarse las ecuaciones cinéticas de velocidad de crecimiento celular, de
consumo de sustrato y de formación de producto, las ecuaciones que
representan velocidades de transferencia de calor y masa y ecuaciones que
representan a los cambios propios del sistema. La combinación de todas estas
relaciones proporciona una base para la descripción cuantitativa del proceso
y comprende el modelo matemático básico. El modelo resultante puede ser

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desde muy simple, con relativamente pocas ecuaciones, hasta un modelo de
gran complejidad.

La información necesaria para el desarrollo de modelos se puede obtener de


diferentes sistemas de reacción: cultivo intermitente (lote) y cultivo continuo.
Cada uno de ellos tiene sus particularidades y limitaciones.

En una fermentación por lote ocurre una progresión de eventos


perfectamente conocidos; inicialmente el microorganismo modifica su
estado fisiológico adecuando su aparato de biosíntesis a las condiciones
ambientales existentes (no limitación por nutrientes). En este período se
produce un incremento en la masa celular del microorganismo comenzando
éste a dividirse a una determinada velocidad, consumiendo los nutrientes del
medio y secretando productos al mismo.

El metabolismo microbiano modifica generalmente el valor del pH y en


cultivos aeróbicos, la velocidad de disolución de oxígeno en el medio puede
ser insuficiente para satisfacer la demanda bioquímica de O2. Eventualmente
termina por disminuir la velocidad de crecimiento de la población por el
agotamiento de alguno(s) de los nutrientes o bien por inhibición por algún
producto secretado, finalmente el cultivo entra en lo que se denomina como
fase estacionaria.

Al incrementarse la población celular se producen cambios en el medio, que


afectan el estado fisiológico celular, de tal manera que en el transcurso de una
fermentación la población presenta una infinidad de estados fisiológicos
transitorios.

En un cultivo por lote siempre se presenta algún estado particular del


microorganismo en el cual la velocidad de producción de algún metabolito de
interés o bien de la célula misma es máxima, sólo que dicho estado es
temporal. En un proceso continuo se pretende la creación de ambientes
constantes que permitan mantener indefinidamente un determinado estado
fisiológico.

Se asume que en un cultivo continuo en donde se trabajan diferentes


velocidades de suministro de nutrientes y diversas clases de substratos
limitantes, es posible obtener diferentes propiedades del cultivo (, Y, qp, qs,
qO2, qCo2) para cada estado de equilibrio logrado. Todas las anteriores y
algunas más nos sirven para evaluar cuantitativamente un estado fisiológico.

11
A todas las propiedades mencionadas se les denomina genéricamente como
parámetros de estado.

De acuerdo a lo anterior, el cultivo continuo se ha convertido en una


herramienta de gran utilidad para la determinación de las constantes
cinéticas de los modelos matemáticos descriptivos del crecimiento
microbiano, del consumo de substrato y de la producción de metabolitos.

Balance de materia en un quimiostato:


BALANCE DE BIOMASA:

V(dx/dt)ac = V(dx/dt)crec – Fx

(dx/dt)crec =x

V(dx/dt)ac = V(x) – Fx

Dividiendo entre (V) y dado que (F/V) = D

(dx/dt) ac = x (μ - D)

En estado de equilibrio dinámico la acumulación de materia es cero, por lo que μ = D

BALANCE DE SUBSTRATO (se considera que un solo compuesto limita al crecimiento)

V(ds/dt)ac = FSr –Fs- V(ds/dt)cons

Dividiendo entre (V) y dado que (ds/dt)cons = qsx

(ds/dt)ac = (FSr/V) – (Fs/V) – (qsx)

(ds/dt)ac = (F/V)(Sr-s) – (qsx)

Dado que (F/V) = D

(ds/dt)ac = D(Sr-s) – qsx

En estado de equilibrio dinámico la acumulación de materiales es cero, por lo que:

qs = D(Sr -s)/x

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Desarrollo de la práctica

Cultivo continuo:

En el desarrollo de esta práctica se obtendrán las constantes cinéticas de los


modelos de crecimiento y de consumo de sustrato de la levadura Candida
utilis Y-900. El medio de cultivo utilizado es semisintético donde la glucosa,
que es la fuente de carbono y energía, es el sustrato limitante. Una vez que ha
crecido el microorganismo en cultivo por lote, se procede a establecer la
velocidad de dilución con que operará el cultivo continuo (D1).

Se deja estabilizar el cultivo durante un tiempo programado en función de la


velocidad de dilución con que se trabaja (aproximadamente 3 recambios del
volumen de operación del reactor). Una vez obtenido el estado de equilibrio
dinámico, se cosecha un volumen de 25 mL e inmediatamente se separan las
células del medio de cultivo por microfiltración. En el filtrado se determina
la concentración de glucosa residual en forma inmediata o se congela para su
posterior análisis. También se determina la concentración de glucosa en el
medio de suministro (Sr).

Se establecerán tantas velocidades de dilución como lo permita el tiempo


disponible, aunque nunca serán menos de cuatro.

Métodos analíticos

Determinación de peso seco

Para cada velocidad de dilución se utilizan dos membranas de fibra de vidrio


(Whatman GF/A) a peso constante. A través de cada una de ellas se filtran 10
mL del medio de cultivo con ayuda de una bomba de vacío. Las membranas
con biomasa se secan a 98º C hasta peso constante (aproximadamente 24 h)
y posteriormente por diferencia de peso se obtiene la concentración celular
en g/L.

Determinación de glucosa

A una muestra de 200 L del filtrado y/o del medio de suministro, esta última
diluida 1:10, se le adicionan 2 mL de una solución reguladora de fosfatos pH
7 conteniendo 1 UI de glucosa oxidasa, 10 g de peroxidasa y 600 μg de o-

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dianisidina. Después de 10 a 20 minutos de incubación, a temperatura
ambiente, se detiene la reacción por la adición de 2 mL de HCl 6N. El color
desarrollado se lee a 540 nm. Paralelamente se preparan dos testigos de
concentración, con 200 L de una solución de glucosa de 0.2 g/L en lugar de
la solución problema y un testigo de reactivos para ajustar el
espectrofotómetro.

Informe

Fermentación continua:

a) Tabular los valores de concentración celular (x), concentración de


glucosa (s), velocidad específica de consumo de glucosa (q s), así como el
rendimiento (Yxs) y la productividad celular (Rc), en función de la
velocidad de dilución con que se operó el quimiostato.

b) Elaborar gráficos de x y s en función de la velocidad de dilución.

c) Determinar el valor de la velocidad de dilución a la cual se obtiene la


máxima productividad celular en cultivo continuo (Rc máx).

d) Determinar el valor de la energía de mantenimiento, así como el valor de


Yg para Candida utilis Y900 utilizando la curva qs = f(D).

e) Determinar los valores de máx y de Ks a partir de la relación de  = f(s).

f) Discusión y conclusiones de la práctica.

Nomenclatura y unidades

x = concentración celular (g cel/L).

s = concentración de sustrato (g gluc/L).



= (dx/dt)(1/x), velocidad específica de crecimiento (h-1).

D =F/V, velocidad específica de dilución (h -1); D =  en condiciones de


equilibrio dinámico en cultivo continuo estabilizado.

14
F = velocidad de flujo de medio fresco al quimiostato (L/h).

V = volumen de operación del quimiostato (L).

qs = velocidad específica de consumo de sustrato (g sus/g cel h). En cultivo por


lote qs = -(ds/dt)(1/x) y en cultivo continuo, en condiciones de equilibrio
dinámico qs = D(Sr-s)/x.

Yxs = x/s, rendimiento celular global en un cultivo por lote (g cel /g sus). En
cultivo continuo en condiciones de equilibrio dinámico Yxs = x/(Sr-s).

Sr = concentración de substrato en el medio que entra al quimiostato (g sus/L).

Rc = D(x), productividad celular en cultivo continbuo (gcel/L h).

m = energía de mantenimiento (gsus/gcel h).

Yg = rendimiento celular máximo (gcel/gsus).

Obras de consulta

1. Abott, F.J. y Clamen, A., 1973. Biotechnol. Bioeng. 15: 117-127


2. Aiba, S., Humprey, A.E. y Millis, N.F., 1972. Biochemical Engineering. Academic
Press. N.Y.
3. Bailey, J.E., y Ollis, D.F., 1989. Biochemical Engineering Fundamentals. McGraw Hill
Book Co. USA.
4. Calcott, P.H., 1981. Continuous Culture of Cells. CRC. Press Fla. USA
5. Dobre T.G. y Sánchez-Marcano J.G., 2007. Why Modelling? En: Chemical
Engineering. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, Alemania.
6. Dunn, I.J., Heinzle, E., Ingham, J y Prenosil, J.E., 1992. Biological Reaction
Engineering. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim. Alemania
7. Flickinger, M.C. y Drew, S.W., 1999. Encyclopedia of Bioprocess Technology:
Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation. Volumes:1-5. John Wiley & Sons, Inc.
USA.
8. Galíndez-Mayer, J. y Ruiz-Ordaz N., 1994. Bioingeniería: fundamentos biocinéticos
para el diseño de procesos fermentativos. Informes técnicos 21. Serie: Investigación y
Desarrollo Tecnológico. Instituto Politécnico Nacional. Mex.
9. Luedeking, R. y Piret, E.L., 1959. J. Biochem. Microbiol. Tech. Eng. 1: 393-412

15
10. Luedeking, R. y Piret, E.L., 1959. J. Biochem. Microbiol. Tech. Eng. 1:341-349
11. Luedeking, R., 1967. Fermentation process kinetics. En: Biochemical and Biological
Engineering Science., N. Blakebrough (ed), Vol 1. Academic Press, N.Y.
12. Moser, A., 1985. Continuous cultivation. En: Biotechnology: Fundamentals of
Biochemical Engineering. 2. Rhem, H.J. & Reed, G. (eds). Verlag Chemie. RFA.
13. Okpokwasili, G.C. y Nweke C.O., 2005. Microbial growth and substrate utilization
kinetics. African J. Biotechnology 5(4): 305-317
14. Panikov N.S., 1995. Microbial Growth Kinetics. Chapman & Hall. London, G.B.
15. Pirt, S.J., 1975. Principles of Microbe and Cell Cultivation. Blackwell Scientific. Publ.
G.B.

16
OXIDACIÓN BIOLÓGICA DE ETANOL EN UN REACTOR
DE LECHO FIJO

Introducción

Aunque hace miles de años que se conoce el vinagre, hace sólo 170 años
que se determinó la naturaleza biológica de su producción, cuando Kützing
publicó que la oxidación del etanol a ácido acético era realizada por
organismos vivos. Ya en 1793 Lavoisier había observado la importancia del
oxígeno en la fermentación acética. En 1822 Peerson había designado como
Mycoderma a la película que se forma sobre la superficie de líquidos
alcohólicos con producción de ácido acético. En 1986 Pasteur confirmó el
hallazgo de Kützing y afirmó que la oxidación se debía a una bacteria a la que
llamó Mycoderma aceti.

En 1878 Hansen clasificó las bacterias acéticas, distinguiendo


Bacterium aceti, Bacterium kutzingianum y Bacterium pasteurianum.
Brown (1886) aisló a Bacterium xylinum, capaz de producir celulosa. A fin
de ese siglo M. Beijerinck (1898) describe la familia Acetobacter. Durante
decenios se clasificó a esa familia en dos géneros: Acetobacter y
Gluconobacter. En la década de los noventa del siglo pasado se han
identificado bacterias acéticas con otras capacidades metabólicas (fijación de
nitrógeno, oxidación del metanol a ácido fórmico, síntesis de polisacáridos)
y se proponen los géneros Asai, Kozakia, Methanolica y Gluconacetobacter,
además de los dos anteriores.

El vinagre es un producto “commodity” de consumo amplio en todos


los estratos sociales.

Bioquímica

La “madre” del vinagre, como se conoce popularmente al cultivo que se


forma sobre líquidos estacionarios que contengan etanol o sacarosa, está
compuesta por células de diversas cepas de Gluconacetobacter y por cadenas
de celulosa y de polímeros acídicos hidrofílicos, formando una bio-película.
Domésticamente se utilizó esta forma para la producción de vinagre. Éste es
un condimento hecho a partir de sustancias con etanol, azucaradas o
feculentas con producción de ácido acético; el producto final no debe
contener menos de 4º g/L de ácido acético a 20 °C.

17
El género Gluconacetobacter muestra características comunes en su
bioquímica: oxidación parcial de polialcoholes por quinoproteínas en el
periplasma, requiere la presencia de ácido acético en el medio para crecer, el
ciclo de los ácidos tricarboxílicos por la desviación del glioxilato,
incorporación de hexosas por fosforilación, incapacidad de fermentar la
glucosa y por ello aerobiosis estricta, gluconeogenesis a partir del piruvato,
metabolización de la glucosa por la vía de la pentosa fosfato y por la ruta de
las fosfocetolasas y capacidad de síntesis de celulosa y otros polísacáridos.
(Ver Figura 1).
Etanol
Sacarosa
PQQ
PQQH2

Acetal
dehido fructosa glucosa
PQQ
PEP
PQQH2
Ácido
Acetato
acético Pyr ATP
ATP

Acil-fosfato fructosa 6 P* Glucosa 6 P*


NAD
PK
ácido 3 fosfo NADH
Acetil- Co glicérico *
Enzima A* ATP
Gco6P

CAT* ATP Celulosa


Acetán CO2
Oxalo gliceraldehido
NADH
acetato* 3 fosfato* R5P*

CO2
ácido fosfoenol Acetato
pirúvico* piruvato*
ATP

Figura 1. Esquema del metabolismo integral de Gluconacetobacter spp.

18
Bioproceso

Para la fabricación del vinagre hay que considerar varios factores: la


selección del microorganismo, la naturaleza de la materia prima, las
concentraciones del etanol empleado y del vinagre que se añade al principio,
la concentración del oxígeno en el medio, la composición del medio de
cultivo, la temperatura de fermentación, la maduración del producto, su
clarificación, envasado y pasteurización, así como el carácter y composición
de los recipientes y materiales con los que el vinagre entra en contacto
durante su elaboración.

Los procesos de producción son de dos tipos: por lote simple


(tradicional) o con recirculación del medio en un reactor empacado, o por
lote alimentado con extracción periódica del medio fermentado. La masa de
ácido acético que se produce por unidad de volumen del medio por unidad
de tiempo, se concibe como la velocidad volumétrica de reacción (rA).

Objetivo

Producir vinagre de vino blanco, por un método industrial a escala de


laboratorio, utilizando un biorreactor con células inmovilizadas,
determinando parámetros importantes del proceso.

Desarrollo Experimental

i) El biorreactor

1ra. Opción:

Reactor tipo Frings, el cuerpo del biorreactor es cilíndrico y está


dividido en tres secciones:

Sección superior.- Se recibe la alimentación de la mezcla ácido-


alcohólica a través de un difusor alimentado por la recirculación. Esta sección
permite la salida del venteo y la entrada del sensor de temperatura. Su parte
inferior tiene una sección circular sólida con perforaciones que alimentan la
mezcla hacia la siguiente sección, o sección media, donde se realiza la
biorreacción.

19
Sección media.- Es la sección de mayor volumen y está empacada con
viruta de madera sobre cuyo soporte crece la biopelícula con el
microorganismo. A su vez la viruta está soportada por otra sección circular
perforada a través de la cual circula en ascenso el aire que proviene de la
sección inferior.

Sección inferior.- También llamada cámara de recogida, sirve para


contener la mezcla ácido-alcohol que está recirculando para su oxidación
hasta alcanzar la acidez deseada. Para ello se emplea una bomba que alimenta
el circuito externo al que se le sirve con un sistema de enfriamiento para el
control de la temperatura. Esta sección recibe la aireación a través de una
línea dotada de un rotámetro y un filtro de aire.

2ª. Opción:

Columna de burbujeo con un difusor de placa porosa en la base del


reactor para la aireación, donde el diámetro del difusor corresponde al
diámetro interno del cilindro.

ii) Acondicionamiento e inóculo del biorreactor

El material de soporte (la viruta) se lava con agua caliente y se deja


remojar en vinagre para eliminar los olores o sabores extraños que se
pudieran impartir al vinagre.

Posteriormente, el soporte debe ser colonizado por Gluconacetobacter,


mediante su inoculación y recirculación en el soporte con vinagre fresco, en
condiciones aerobias durante doce horas. El vinagre se vacía y se carga el
biorreactor con una mezcla de 6% de alcohol y 3% de ácido, con extracto de
levadura (1.5 g/L) y glucosa (2.0 g/L), la cual se recirculará doce horas más.

El biorreactor es aireado a flujos crecientes hasta percibir una


colonización total, entonces se inicia la producción de vinagre.

iii) Producción de vinagre

1. Preparación de la mezcla vino-vinagre (6% - 3%).

20
2. Cálculo de la aireación necesaria y regulación del flujo de aire.

3. Control de la temperatura en el intervalo de (20- 34 °C).

4. Cosecha del vinagre al 4 % de acidez. El volumen cosechado debe ser


reemplazado por adición de vino de modo de conservar las
concentraciones de 6% de etanol y 3% de ácido acético. Se conserva la
recirculación.

5. Envasado del producto en recipientes que queden completamente


llenos.

6. Añejamiento en el recipiente, durante el cual los compuestos


aromáticos cogenéricos se esterifican, impartiendo un sabor más suave
y clarificado al producto por sedimentación del material coloidal.

7. Envasado en los recipientes adecuados para su comercialización. Se


requiere que el envasado sea hermético. El producto es pasteurizado a
60 – 66 °C durante 30 min.

iv) Monitoreo de la producción de acidez

Se toman muestras del biorreactor cada 24 horas, y a estas se les


determina la concentración de acidez total, utilizando fenoltaleína como
indicador e NaOH 0.1N como agente titulante.

Para la utilización de esta técnica se hace la consideración que la


concentración de acidez total, se refiere a acidez por ácido acético, ya que la
producción de algún otro ácido orgánico por las bacterias acéticas es
despreciable (de Ory y col., 2004).

21
Informe

a) Los cálculos para el ajuste de la concentración de la mezcla de


reacción.

b) El cálculo de la velocidad volumétrica media de reacción (rA).

c) Trazar la gráfica que describa la producción de acidez con respecto al


tiempo.

d) Suponiendo que la velocidad de reacción es de primer orden, calcule


el valor de la constante de reacción k y deduzca sus unidades.

e) Determinar el tiempo óptimo de cosecha.

f) Consultar la NOM para vinagre y clasificar el producto resultante de


la práctica de acuerdo a la misma.

g) Investiga que otras operaciones son necesarias para comercializar el


vinagre obtenido en la práctica.

h) Proponga las condiciones necesarias para diseñar un biorreactor tipo


Frings para producir 500 L diarios de vinagre.

Obras de consulta
1. Amerine, M. A. (1974) “Análisis de vinos y de mostos” Acribia. Barcelona.

2. De Ory, I., Romero, L. E., Cantero, D. (2004) “Optimization of immobilization


conditions for vinegar production. Siran, wood chips and polyurethane foam as
carriers for Acetobacter aceti.” Process Biochemistry. 39: 547-555.

3. Parés, R. y Juárez, A., (1997) “Bioquímica de los Microorganismos” Reverté.


Barcelona.

4. Schüller, G., Hertel, C. y Hammes, W. P., (2000) “Gluconacetobacter entanii sp.


nov., isolated from submerged high-acid industrial vinegar fermentations” Int. J.
Syst. Evol. Microbiol. 50: 2013-2020.

5. Velasco-Bedrán, H., López-Isunza, F. (2007) “The unified metabolism of


Gluconacetobacter etanii in continuous and batch processes” Process
Biochemistry.

22
VALIDACIÓN EXPERIMENTAL DE UN SISTEMA DE
FERMENTACIÓN “FED-BATCH” CON ALIMENTACIÓN
EXPONENCIAL

Introducción

El suministro de nutrientes a cultivos por lote se ha utilizado empíricamente


desde el siglo pasado para el cultivo de microorganismos con aplicaciones
industriales, como por ejemplo, para la producción de penicilina y levadura
de panificación.

Este tipo de cultivos han recibido diversas denominaciones, siendo el


término “Fed-batch” introducido por Yoshida en 1973, el de uso más
generalizado. Existen otras denominaciones para casos particulares, como
son los de “Cultivo Extendido” y el de “Fed-batch Exponencial”, que se
aplican para describir un cultivo alimentado en donde la concentración de
sustrato limitante del crecimiento es mantenida constante por manipulación
de la velocidad del suministro de nutrientes.

Es hasta la década de los setenta del pasado siglo, en que coinciden el


desarrollo de modelos matemáticos para este tipo de cultivos con el auge de
la aplicación de los microprocesadores en la tecnología de fermentaciones,
coincidiendo además con el desarrollo de nuevos sensores y
servomecanismos para el seguimiento y control de procesos.

Para que un cultivo alimentado sea realmente productivo y se obtengan


valores elevados de conversión de nutrientes a productos, se requiere de una
exacta predicción de los eventos que ocurrirán en el cultivo, tales como
variación en los indicadores cuantitativos de: crecimiento, producción de
metabolitos y consumo de nutrientes y de oxígeno, del microorganismo, así
como de un estricto control de las variables ambientales que afectan al
proceso fermentativo. Una inadecuada predicción de eventos puede resultar
en alteraciones ambientales que modifiquen de forma imprevista la fisiología
del microorganismo, provocando una desviación en la fermentación hacia la
producción de metabolitos indeseables, abatiéndose la productividad, el
rendimiento o ambos.

23
Dependiendo del objetivo de una fermentación, la estrategia de alimentación
de nutrientes a un cultivo puede ser de dos tipos: velocidad de suministro
constante o variable. En este último caso, la velocidad de suministro se
incrementa paulatinamente con el fin de sostener un nivel constante del
sustrato limitante en el cultivo. La variación en este suministro puede
programarse previamente para satisfacer la demanda creciente del cultivo
por nutrientes o bien, puede introducirse un sistema de control capaz de
estimar y satisfacer dicha demanda. Tal sistema tendría una serie de sensores
que suministrarían información a una unidad de procesamiento de datos, la
cual enviaría a servomecanismos periféricos específicos (válvulas, bombas,
etc.) para modificar velocidades de suministro de nutrientes o de oxígeno,
cuando esto fuera necesario.

BASES TEÓRICAS DEL CULTIVO EXTENDIDO

a) Ecuaciones de balance

Consideremos un reactor con un volumen inicial [V o] de medio de cultivo


con una concentración de sustrato limitante [s] y una densidad de
población celular [x] que se incrementa con una velocidad específica de
crecimiento []. A un tiempo dado se comienza a suministrar al cultivo un
flujo [F] de medio fresco que contiene al sustrato limitante del crecimiento
a una concentración [Sr]. No habiendo salida del mosto del reactor
durante el proceso, el volumen de medio en el fermentador variará
continuamente, a menos que la alimentación se haga con sustrato puro
(sólido o líquido), en cuyo caso el volumen se mantendrá constante.

Se consideran las siguientes restricciones para el sistema:


1. La suspensión celular es homogénea.
2. Aun cuando la población consiste de un número de partículas discretas,
su concentración es lo suficientemente alta y el tamaño de partícula lo
suficientemente pequeño para considerar como una variable continua
a la densidad de población [x]. Por otra parte, el volumen ocupado por
las partículas representa sólo una fracción del volumen total del
sistema y se considera despreciable.
3. Tan pronto como los nutrientes entran al cultivo son instantáneamente
dispersados en él.
4. Toda la población celular permanece viable.

24
5. La velocidad específica de crecimiento [] es una función de la
concentración de un sólo sustrato limitante [s] y se asume la
funcionalidad de Monod.
 = máx s/ (Ks + s) …………….(1)

6. Si el sustrato que limita al crecimiento es la fuente de energía, la


cantidad de biomasa producida por unidad de sustrato limitante
utilizado no será constante. Este rendimiento celular [Y] será una
función de la velocidad específica de crecimiento y está dado por la
ecuación:

Yxs = Yg/( + mYg) ……….(2)

Donde:
Yg = Rendimiento celular máximo para crecimiento.
m = Coeficiente de mantenimiento celular.
Si el sustrato que limita al crecimiento no es la fuente de energía,
el valor de [Yxs] se asume constante.

7. Durante el proceso no existe inhibición del crecimiento por los


metabolitos producidos por el mismo microorganismo.

Con base en las anteriores consideraciones, las ecuaciones de balance en


el reactor serán las siguientes:

Balance de biomasa:

Acumulación global = Entrada – Salida + Crecimiento global


[d(Vx)/dt]ac = 0 – 0 + [d(Vx)/dt]crec = (Vx)

Haciendo (Vx = X):


V(dx/dt)ac + x(dV/dt) = dX/dt = X……..(3)

Pero (dV/dt = F); despejando de la ecuación anterior a (dx/dt)ac y


haciendo (F/V = D), se obtiene la velocidad de acumulación volumétrica
de biomasa:
(dx/dt)ac = x( – D) ………..(4)

Siendo [D] la velocidad de dilución del cultivo.

25
Balance de sustrato:

Acumulación global = Entrada – Salida – Consumo global.


[d(Vs)/dt]ac = F(Sr) – 0 – qs(Vx) = F(Sr) – (/Yxs)(Vx)……..(5)

Siendo (qs = /Yxs), donde [qs] es la velocidad específica de consumo de


sustrato.

S(dV/dt) + V(ds/dt) = F(Sr) – (/Yxs)(Vx)

Por lo tanto la velocidad volumétrica de acumulación de sustrato estará dada


por:

(ds/dt)ac = D(Sr-s) – ·x/Yxs………………..(6)

Cuando interesa describir la acumulación de algún producto en el reactor, se


hace a partir de la ecuación de balance de producto.
Las ecuaciones de balance anteriores pueden considerarse como las
fundamentales para el cultivo alimentado.

b) Comportamiento de un cultivo extendido

Partiendo de la base de que el suministro de nutrientes se mantendrá igual a


la demanda del cultivo, se tendrá un valor constante de la concentración de
sustrato limitante [s], y por lo tanto una velocidad específica de crecimiento
[] constante. En estas condiciones tendremos que en la ecuación de balance
(6), el valor de la acumulación volumétrica de sustrato será cero.
Por tanto:
(F/V)(Sr – s) = (·x/Yxs)
De donde:
F = [(xV)/Y(Sr-S)]…………………(7)

Sustituyendo el valor (xV = X) en la ecuación de balance (3) e integrando


entre los límites (to = 0  t):

X = Xo*e(t) = xV …………………(8)

Sustituyendo esta expresión en la ecuación (7), tendremos:

F = [Xo/Yxs(Sr – s)] e(t)……………..(9)

26
Con base en las consideraciones iniciales planteadas (s = cte,  = cte.)
tendremos que de acuerdo a la ecuación (2); el valor de [Y] será también
constante. Por lo tanto tendremos que el flujo variará exponencialmente de
acuerdo a la ecuación:

F = a e(t) ………………..(10)
Donde:
a = [Xo/Yxs(Sr – s)] = Constante

La variación en volumen se obtiene sustituyendo el valor de [F] en la


diferencial:
dV/dt = F = ae(t)
integrando entre los límites (to=0 t), obtendremos:

V = Vo + [Xo/Yxs(Sr – s)][e(t) – 1] …………………(11)

Por sustitución de las ecuaciones (2) y (11) en la ecuación (8), obtendremos


la trayectoria de la concentración celular en un cultivo alimentado
exponencialmente:

x = [(xoVo)e(t)]/{Vo + [xoVo( + mYg)/(Yg)(Sr – s)][e(t) – 1]}……(12)

Para poder alimentar exponencialmente a un cultivo, manteniendo un nivel


constante del sustrato limitante, se requiere de un control muy preciso de la
velocidad de operación de la bomba de suministro de nutrientes. Para
efectuar tal control puede recurrirse al uso de equipo relativamente
sofisticado; bombas acopladas a un trazador automático de curvas, con el
objeto de alimentar nutrientes de acuerdo a un perfil gráfico predeterminado
o bien, alimentar bajo el control de una computadora. Cuando no se dispone
de tal equipo, es posible hacer una aproximación al suministro exponencial
mediante la adición (manual o automática) de volúmenes discretos de medio
de suministro a intervalos de tiempo programados, para mantener los niveles
de sustrato limitante dentro de un intervalo de valores preestablecidos.

Objetivo

Realizar un cultivo por lote alimentado exponencialmente para la obtención


de proteína unicelular, validando el sistema de alimentación comparando los
resultados experimentales obtenidos con los teóricos.

27
Desarrollo experimental

1. Se realizará un cultivo por lote en donde se estimarán los siguientes


valores: [máx ] y [Yxs]. Estos, junto con otros valores obtenidos
anteriormente (, Yg y Ks), para Candida utilis Y-900 en cultivo
continuo a 35 ºC, serán utilizados para establecer el programa de
alimentación del cultivo.

2. El suministro de medio fresco será exponencial y se iniciará cuando la


concentración de sustrato llegue a un valor máximo preestablecido. La
alimentación programada a partir de la simulación del
comportamiento del cultivo, se hará por medio de una bomba
peristáltica de velocidad variable para mantener un valor de [s]
constante.

3. Durante el cultivo por lote y el cultivo extendido se tomarán muestras,


a las que se les determinará inmediatamente la concentración celular y
la concentración de glucosa. La concentración celular se estimará por
peso seco y turbiedad, y la glucosa por ensayo enzimático con glucosa
oxidasa.

Métodos analíticos

Determinación de glucosa

A una muestra de 100 a 500 l, se le adicionan 2 ml de solución reguladora


de fosfatos pH 7.0 conteniendo 2 mg de glucosa oxidasa, 100 mg de
peroxidasa y 300 mg de o-dianisidina.

Después de 10 min de incubación a 30ºC, se para la reacción por la adición


de 2.5 ml de HCL 6N. El color desarrollado se lee a 540 nm. Paralelamente
se preparan dos controles con 500 l, de una solución de glucosa 0.1 g/l en
lugar de la solución problema y un testigo del reactivo.

Determinación de la concentración celular por turbiedad.

Se mide la densidad óptica a 600 nm de cada muestra, realizando la dilución


apropiada, se utiliza agua destilada para ajustar a cero el espectrofotómetro
y por medio de una curva tipo se obtiene la concentración celular en g/l.

28
HOJA DE DATOS Y RESULTADOS

FECHA: SR= g/l


EQUIPOS: TEMPERATURA: ºC
GRUPO: pH=
MICROORGANISMO: Conc.control glucosa= g/l

CULTIVO POR LOTE

CONCENTRACIÓN CELULAR CONC. DE SUSTRATO


Muestra Hora Edad As600nm x Vol Dil Control Muestra s
Nº (h) (h) (gcel/h) (ml) As540nm As540nm (g/l)

FEDBATCH

CONCENTRACIÓN CELULAR CONC. DE SUSTRATO


Muestra Hora Edad As600nm x Vol Dil Control Muestra s
Nº (h) (h) (gcel/h) (ml) As540nm As540nm (g/l)

29
Informe

✓ Calcular [máx], y los valores de rendimiento y productividad celular


media de Candida utilis Y-900 en el cultivo por lote.

✓ Para el cultivo extendido, construir curvas comparativas (teóricas y


experimentales) de:
x = f(t)
X = f(t)
μ = f(t)
s = f(t)

✓ Estimar los valores de productividad media y los de rendimiento


celular medio en el cultivo extendido (teóricos y experimentales).

✓ Discusión de resultados y conclusiones.

Obras de consulta

1. Araujo, M.D. 1980. Producción de proteína unicelular a partir de desechos de


plátano mediante un proceso fermentativo de volumen variable con alimentación
programada. Tesis profesional. ENCB.
2. Duna, I. J., y J. R. Mor. 1975. Variable-volume continuous cultivation. Biotechnol.
Bioeng. 17: 1805-1822.
3. Edwards, V. H. 1970. Extended culture: the growth of Candida utilis controlled
acetate concentrations. Biotechnol. Bioeng. 15: 975-999.
4. Lim, H. C., S. J. Che, y C. C. Creagan. 1977. An análisis of extenden and
exponentially fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 19: 425-433.
5. Matin, A. 1981. Regulation of enzyme synthesis as studied in continuous culture en
Continuous Culture of Cells. P. H. Calcott (Ed.), CRC Press, Vol. II:69-97.
6. Ohno, H., E. Nakanishi, y T. Takematus. 1978. Optimun operating mode of a class
of fermentation. Biotechnol. Bioeng. 20:625-633.
7. Pirt, S. J. 1975. “Principles of Microbial and Cell Cultivation”. Blackwell Scientific
Publications, London.
8. Reed, G., y H. J. Peppler. 1973. Yeast Technology. AVI Publishing, Co., New York.
9. Wang, H. Y., C.L. Cooney, e I. Wang. 1977. Computer aided Baker’s yeast
fermentations. Biotechnol. Bioeng. 19:69-86.
10. Whitaker, A. 1980. Fed-batch culture. Process. Biochem. 15:10-15.
11. Yamané, T., y S. Hirano. 1977. Semibatch culture of microorganism with constant
feed of substrate: A mathematical simulation. J. Ferment. Technol. 55:156-165.

30
TRATAMIENTO BIOLÓGICO DE AGUAS RESIDUALES
PROCESO DE LODOS ACTIVADOS

Introducción

Cualquier comunidad o asentamiento humano produce desechos sólidos y


líquidos aunados a sus actividades. El agua residual es un líquido que
contiene una combinación de sólidos solubles e insolubles de diferentes
características, fluidos miscibles e inmiscibles y microorganismos que
pueden ser patógenos o no. Si el agua residual no es tratada y se acumula en
algún lugar, la descomposición de la materia orgánica presente genera
grandes cantidades de gases malolientes que además pueden ser
combustibles. Además, altas concentraciones de materia orgánica en el agua
provoca su desoxigenación y por consiguiente la muerte y extinción de peces
y otras formas de vida acuática (Metcalf y Eddy, 1991).

En estas condiciones se favorece el crecimiento acelerado de los


microorganismos antes mencionados, lo cual puede ocasionar problemas de
salud en las especies animales y vegetales del sitio, incluyendo al hombre.
Algunos nutrientes pueden estimular el crecimiento desmedido de plantas
acuáticas, y en el peor de los casos, el agua puede contener sustancias tóxicas
que pueden dañar irreversiblemente los ecosistemas involucrados (Metcalf y
Eddy, 1991). Todos estos factores hacen inevitable que las aguas residuales
tengan que ser tratadas para su eventual disposición en cuerpos de agua o en
tierras agrícolas de riego.

En México, la descarga de contaminantes a efluentes y cuerpos de agua es


muy frecuente. Las estadísticas muestran que cerca del 90% de las aguas
superficiales se encuentran contaminadas a diferentes niveles y de esas un
12% están altamente contaminadas, lo que las hace inaceptables para
sostener la vida acuática o ser utilizadas con cualquier otro fin (Informe de la
situación del medio ambiente en México, 2005). La región que comprende la
cuenca del Valle de México y el sistema Cutzamala tiene los niveles más altos

31
de contaminación, coincidiendo con una gran cantidad de poblaciones
existentes y una creciente actividad industrial. Las medidas correctivas y
preventivas no han sido del todo efectivas, ya que las plantas de tratamiento
en operación a nivel nacional tratan solamente 23.6% del agua residual
municipal antes de ser vertida a los cuerpos de agua (Informe de la situación
del medio ambiente en México, 2005). La mayor parte de esa agua residual
recibe tratamiento secundario mediante lodos activados y lagunas de
estabilización, procesos que tienen una eficiencia de entre 80 y 90% para la
remoción de materia orgánica (Informe de la situación del medio ambiente
en México, 2005).

El tratamiento de aguas residuales depende principalmente de la


concentración y clase de contaminantes presentes, aunque hay que tomar en
cuenta varios factores que, en conjunto, afectan significativamente el diseño
del proceso. Éste generalmente consiste en tres tipos de tratamiento:
primario, secundario y avanzado o terciario. El tratamiento primario consiste
en operaciones físicas como el cribado y la sedimentación, utilizados para
remover los sólidos flotantes y sedimentables encontrados en esta agua. En
el tratamiento secundario se utilizan los procesos biológicos o químicos
para remover la materia orgánica (Metcalf y Eddy, 1991). En los tratamientos
avanzados, las combinaciones adicionales de operaciones unitarias y
operaciones de proceso son usados para remover otros constituyentes como
el nitrógeno (N2) y el fósforo (P), que no son reducidos significativamente en
el tratamiento secundario (Metcalf y Eddy, 1991).

En 1914, E. Ardern y W. T. Lockett, descubrieron en Manchester, Inglaterra


el proceso de lodos activos o activados. Observaron que la aireación de las
aguas residuales conducía a la formación de flóculos de partículas en
suspensión. Descubrieron que el tiempo para eliminar contaminantes
orgánicos se reducía de días a horas cuando esos flóculos de partículas se
hacían permanecer en el sistema y se refirieron a las partículas en
suspensión, más específicamente al lodo que resultaba de la recogida de las
partículas del tanque de sedimentación, como “activo”, de ahí su nombre
(Sawyer, 1965). Al principio no se comprendía el fundamento del proceso,

32
aunque eso no impidió que funcionara y se generalizara su uso en muchas
partes. Muchas plantas eran construidas en base a la experiencia previa y se
hacían modificaciones de manera empírica. Hasta las décadas de 1950 y
1960, la Ingeniería Bioquímica sentó las bases para desarrollar una teoría
convincente y funcional como para conseguir diseños racionales basados en
las características de las aguas residuales a tratar, entre otros están: filtros
biológicos, lagunas de oxidación, reactores de contacto de fases y digestores
anaerobios, principalmente.
Debido a la amplia formación en las operaciones unitarias y el área
microbiológica, los ingenieros bioquímicos son los profesionales con
mayor capacidad de comprender y diseñar a micro y a macro-escala el
proceso de lodos activados en el tratamiento de aguas residuales, siempre
considerando los aspectos técnicos y económicos de manera conjunta.

Fundamentos del proceso


El principio básico consiste en que las aguas residuales se pongan en contacto
con una población microbiana mixta, en forma de suspensión floculenta en
un sistema aireado y agitado. La materia en suspensión y la coloidal se
eliminan rápidamente de las aguas residuales por adsorción y aglomeración
en los flóculos microbianos.

Agua residual
Q0+r (Q0) Agua tratada
Q0, DQO0 Aireador
Sedimentador
primario Va SSVa, Qs, DQOa
DQOa Sedimentador
secundario

Aire

Recirculación de lodos
r (Q0), c (SSVa), DQOa Qex, c ( SSVa),
Lodos DQOa
residuales

Figura 1. Esquema de operación de la planta de tratamiento con lodos activados.

33
El proceso de lodos activados consta comúnmente de tres etapas (figura 1):

a) Un sedimentador primario en el que las grasas y los sólidos inertes


gruesos pueden separarse por flotación y sedimentación,
respectivamente.
b) Un aireador donde se desarrolla un “tratamiento secundario” u
oxidación biológica de la materia orgánica en suspensión, que
constituye los nutrientes y que es la parte central del tratamiento.
c) Un sedimentador secundario donde los microorganismos que han
crecido en el aireador a expensas de la materia orgánica, sedimentan al
fondo y en la parte superior fluye el agua tratada libre de sólidos en
suspensión. Del fondo, los lodos sedimentados pueden ser recirculados
para realimentar al aireador.

La terminología de este proceso se describe a continuación:

El agua a tratar, que es efluente de un proceso o de una comunidad, se


convierte en el “influente” al proceso biológico de tratamiento. Su caudal es
Q0 y contiene una concentración de material orgánico o inorgánico
susceptible de oxidación. Si este material se mide con una cantidad conocida
de oxidante fuerte, se conoce como “Demanda Química de Oxígeno”
(DQO) o si se mide por su consumo mediante la oxidación de una población
de una población mixta de microorganismos, se conoce como “Demanda
Bioquímica de Oxígeno” (DBO). El conjunto de nutrientes se define, no
por su naturaleza química (que en la mayor parte de los casos se desconoce),
sino por el método empleado en su medición.

El influente, con su carga de DQO (o DBO), es acondicionado en el primer


sedimentador, también llamado “desarenador”, donde se elimina material
inorgánico inerte por sedimentación y las grasas, aceites o cualquier otro
material menos denso que el agua, por flotación. El efluente que egresa del
“desarenador” se mezcla con una corriente que egresa del fondo del segundo
sedimentador y que contiene los lodos activados concentrados en ese equipo.
La corriente mezclada se alimenta al biorreactor o aireador.

34
El aireador recibe la mezcla del influente con nutrientes frescos (DQO0) y de
la recirculación del sedimentador con nutrientes residuales del aireador, así
como los “Sólidos Suspendidos Volátiles (SSV)” concentrados en el
segundo sedimentador (c · SSVa). El oxígeno es consumido junto con los
nutrientes (DQO) para producir más células las cuales se miden
analíticamente como SSV. El agua, con la DQO residual (DQO a) y los
microorganismos generados (SSVa), fluye al segundo sedimentador.

En el segundo sedimentador se considera que no se realiza ningún proceso


bioquímico, sólo la separación por sedimentación de la masa de
microorganismos. La corriente de agua se separa en dos: una corriente
superior de agua tratada, idealmente sin ningún microorganismo en
suspensión a un flujo Qa y con una concentración final de DQOa y una
corriente inferior en la cual se encuentran los microorganismos concentrados
(c · SSVa) a un flujo ((r · Q0) + Qex). La recirculación de r · Q0 tiene por objeto
aumentar la concentración de microorganismos en el aireador y por ende, la
velocidad de remoción de DQO en el sistema. La otra parte de la corriente
que sale del segundo sedimentador (Qex) contiene a los lodos concentrados
que se desechan del sistema (c · SSVa).

Un balance de masa en todo el sistema nos indica la relación que se establece


entre la tasa de recirculación de los lodos concentrados (r) y el factor de
concentración de los mismos en el segundo sedimentador (c).

Microbiología de los lodos

La unidad ecológica de los lodos es el flóculo. Los flóculos son cúmulos de


varios millones de células bacterianas, junto con otros organismos como
algas, protozoarios, rotíferos, metazoos, hongos, levaduras y material inerte
(orgánica e inorgánica). Esta relación entre las bacterias y sus predadores es
necesaria para el buen funcionamiento de una planta de tratamiento de este
tipo.

35
Ameba

Flagelado
Euglenia viridis Rotífero Paramecio
Euchlanis dilatata
Ciliado
campanella
Figura 2. Algunos microorganismos presentes en una planta de lodos activados.

Estas especies microbianas son muy útiles pues su mayor volumen promueve
una más rápida sedimentación en la siguiente operación. Las especies más
útiles son en primer lugar las bacterias (con un pH de crecimiento de 6.5 –
7.5 y temperaturas no mayores de 38°C) por la versatilidad de su
metabolismo y sus rápidas velocidades de crecimiento. A un pH inferior
crecen los hongos, pero si su micelio es muy abundante, produce lodos con
baja velocidad de floculación. Las algas fotosintéticas y autótrofas son un
buen componente por su mayor tamaño y capacidad de generar oxígeno. Un
cuarto grupo positivo lo constituyen los protozoarios y rotíferos, ciliados y
flagelados, que se alimentan de las especies anteriores, promueven una masa
microbiana de mayor tamaño y mejores características de sedimentación.

En resumen, son numerosos los compuestos que integran la DQO y


numerosos los géneros y especies de microorganismos en el sistema, sin
embargo, las grandes rutas del metabolismo son pocas y la bioquímica de la
desasimilación de las fuentes de carbono presenta rasgos fundamentalmente
comunes en los microorganismos. Tal es la suposición conceptual sobre la
que se basa el diseño racional del equipo y proceso de “lodos activados”.

36
Aspectos cinéticos

En el diseño y operación de un sistema eficiente de lodos activados es


necesario comprender la importancia de los microorganismos en el sistema.
En el tanque de aireación (figura 1), parte del material nutriente se oxida
hasta CO2 y H2O (mineralización) y parte se utiliza para la creación de nuevas
células microbianas (asimilación). Además, se sabe que la biomasa activa
tiene una demanda de energía de mantenimiento para funciones celulares
como motilidad, reparación y síntesis repetida, regulación osmótica,
transporte y pérdida de calor.

Este flujo requerido de energía y electrones se denomina respiración


endógena. O sea, las células se oxidan ellas mismas para satisfacer las
necesidades de energía de mantenimiento. Sin embargo, no toda la biomasa
activa que se pierde por respiración endógena se oxida realmente en la
generación de energía de mantenimiento, ya que una pequeña fracción se
acumula como biomasa inerte.

La velocidad de remoción de nutrientes es la base sobre la cual descansa el


funcionamiento óptimo de la planta de tratamiento. Ésta a su vez depende de
la velocidad de crecimiento de los microorganismos o “lodos activados”.
Esto es:
Ecuación 1
Suponemos que la velocidad de crecimiento de la población microbiana se
expresa mediante la expresión cinética de Monod:
rSSV  μ  SSV Ecuación 2
y
μ m a x DQO
μ Ecuación 3
DQO  K DQO
Pero la masa microbiana no sólo crece, sino que decae y muere. La velocidad
de desaparición se expresa mediante una cinética de primer orden:
rSSV  K d  SSV ,

37
Suponiendo que el sistema de la figura 1 se encuentra en régimen estable,
haremos un balance de los sólidos en todo el sistema:

Tasa de cambio de SSV = Entrada de SSV + crecimiento – Muerte – Salida = 0;


dMSSV
 0  Va  rSSV   Va  rSSV   Qex  c  SSVa   0
dt
Qex  c  SSVa   Va  rSSV  Va  rSSV   Va  SSVa  μ  K d 

Esta expresión indica que la velocidad de generación de sólidos suspendidos


volátiles (SSV) en el sistema, iguala a la velocidad de salida de ellos del propio
sistema. Además:
Va  SSVa 1
 ts  Ecuación 4
Q ex  c  SSVa μ  Kd

Por otro lado, el balance de biomasa en el reactor es el siguiente:


Tasas de cambio de SSV = Entrada + Generación – Muerte – Salida = 0
dMSSV
 r  Q0  c  SSVa   Va  rSSV   Va  rSSV   Q0  r  Q0   SSVa   0
dt
Va  rSSV   Va  rSSV   Q0  r  Q0   SSVa   r  Q0  c  SSVa 

Las expresiones rSSV y r-SSV las sustituimos por sus equivalentes cinéticos y
factorizamos el primer miembro de la ecuación:
Va  SSVa  μ  K d   Q0  SSVa  1  r  r  c 

μ  Kd 
1  r  r  c   1
Ecuación 5
th ts

μ
1  r  r  c   K Ecuación 6
d
th
De la definición de r-DQO (Ecuación 1) tenemos:
r 
μ  Yx  DQO  Ecuación 7
s SSV
 a 

Igualando las ecuaciones 6 y 7:


rDQO 1  1  r  r  c   K d
    ;
SSVa Yx  th  Yx
s s

38
despejando el término 1  r  r  c  y sustituyendo por su equivalencia en la
th
ecuación 5:
1  D  ΔDQO 
 K d  Yx   Ecuación 8
ts s
 SSV a 

El primer término de la ecuación representa la inversa de la relación de los


SSV presentes en el reactor entre la velocidad de salida de SSV del sistema,
esto es, la inversa del tiempo real de retención de sólidos en el reactor o “edad
de los lodos” (1/ts), que es un factor importante para la operación de la planta
de tratamiento. Este término está en relación con el tiempo de retención
hidráulica del proceso (Va/(Q0 + Qr)) o th, que es la inversa de la Tasa de
Dilución (D).

Así, la gráfica del inverso de la edad de los lodos (1/ts) en función de


(D·DQO/SSVa), que representa la velocidad específica de remoción de DQO
(r-DQO), (valores que pueden ser medidos experimentalmente), nos dará una
recta con pendiente YSSV/DQO e intersección al origen con valor de Kd.

Objetivo

El alumno determinará experimentalmente la velocidad y la eficiencia de


remoción de contaminantes para evaluar el desempeño de una planta de
lodos activados de escala laboratorio, así como algunas constantes
estequiométricas características del proceso.

Materiales y métodos

Reactivos y material:

 Medio sintético que simula agua residual municipal.


 Tiras reactivas para determinar pH.
 Dicromato de potasio (K2Cr2O7).
 Sulfato de plata (AgSO4)

39
 Ácido sulfúrico (H2SO4)
 Sulfato mercuroso (HgSO4)
 Biftalato ácido de potasio (KHC8H4O4)
 Arena.
 Recipientes para tomar muestra
 Celdas para leer en espectrofotómetro.
 Crisol.
 Pipetas
 Propipeta
 Guantes
 Cubrebocas
 Lentes de protección
 Tubería de látex

Equipo:

 Aireador rectangular de acrílico.


 Sedimentador de acrílico.
 Filtro de diferentes gravas y piedras.
 Espectrofotómetro.
 Estufa.
 Mufla.
 Balanza analítica.
 Bomba peristáltica.

Desarrollo de la práctica

1. En el aireador rectangular operado a régimen estable, alimentado


continuamente con medio sintético que simule un agua residual
doméstica, se controla el gasto para tener tantos tiempos de retención
hidráulica como equipos de alumnos (a cada equipo de laboratorio le
corresponderá hacer las mediciones para un tiempo de retención
hidráulica cuando se encuentre en régimen estable).

40
2. Se estabiliza la operación del reactor en cada uno de los tiempos de
retención manteniendo constantes el caudal, la concentración de
nutrientes en la alimentación y la velocidad de aireación, entre otros
factores que no es posible controlar, como la temperatura. Esto se
realiza durante 2.5 a 3 veces el tiempo de retención hidráulica antes de
cada sesión.

3. Cada equipo tomará una muestra de la alimentación al sistema


(muestra 1), del aireador (muestra 2), de la salida inferior
(recirculación) del sedimentador (muestra 3) y de la salida del sistema
(muestra 4).

 

4. A la muestra 1 se le determinará pH y DQO; a la muestra 2 se le


determinará pH, DQO y SSV; a la muestra 3 se le determinará SSV y a
la muestra 4 se le determinarán SSV y DQO.

41
Métodos analíticos

Medición de la demanda química de oxígeno. (Método de reflujo cerrado)

La solución digestora se prepara al mezclar 10.2 g de K2Cr2O7, 167 mL de


H2SO4 concentrado y 33.3 g de HgSO4 con 500 mL de agua desionizada.
Posteriormente la solución se enfría y se afora a un litro de agua desionizada.
La solución catalítica se prepara al disolver 9.51 g de AgSO4 en 1 litro de
H2SO4.

a) Se disuelven 8.5 g de KHC8H4O4 en agua desionizada y se afora a 1 litro.


(Esta solución demanda 10,000 mg de O2/litro para su oxidación, ya
que la demanda química de oxígeno de este compuesto es de 1.175 mg
de O2/mg. A partir de esta solución se preparan los testigos de
concentración conocida necesarios para elaborar la curva de
calibración correspondiente).
b) Se agitan cuidadosamente durante 10 segundos (reacción
exotérmica) y posteriormente se incuban a 150 °C durante dos horas.
c) A continuación se dejan enfriar a temperatura ambiente y se lee la
absorbancia a 600 nm en un espectrofotómetro (cuidar que el residuo
blanco no se resuspenda al verter el contenido a la celda). El blanco se
elabora sustituyendo la muestra con agua desionizada. Los ensayos de
los testigos, del blanco y de las muestras se llevan a cabo
simultáneamente.

Medición de los sólidos suspendidos volátiles

a) Tomar una muestra de 5 ml por duplicado y verterla en un crisol


previamente a peso constante.
b) Evapore en una estufa a 105°C hasta peso constante. Anote la
diferencia en peso como sólidos suspendidos.
c) Calcine la muestra a 600°C hasta peso constante. Anote la diferencia
en peso como sólidos suspendidos fijos.

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d) La diferencia en peso entre sólidos suspendidos y sólidos suspendidos
fijos representa los sólidos suspendidos volátiles (SSV). Refiera los SSV
al volumen de muestra original y exprese como mg/l.

HOJA DE RESULTADOS

Grupo: _______ Equipo: ______

SSV
Muestra pH CV (g) CMS (g) CMC (g) SS (g) SSF (g) SSV (g)
(mg/l)
1
2
3
4
CV = peso de crisol vacío; CMS = peso de crisol con muestra seca; CMC =peso de crisol con muestra
calcinada; SS = sólidos suspendidos; SSF = sólidos suspendidos fijos; SSV = sólidos suspendidos volátiles.

Condiciones del proceso y


Valores Unidades
datos obtenidos
Q0
Qr
D
Muestra 1 (DQO0) As600 nm =
Muestra 2 (DQOa) As600 nm =
Muestra 4 (DQOa) As600 nm =
SSVa
ΔDQO
rDQO
1/ts

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Equipos Q0 Qr D (h-1) DQO0 DQOa SSVa ΔDQO rDQO 1/ts
1
2
3
4
5
6

Informe

✓ Calcule la eficiencia de remoción de DQO, así como la velocidad


volumétrica de remoción de DQO.
✓ Trazar la gráfica 1/ts en función de ΔDQO y por regresión lineal
encuentre la pendiente (YSSV/DQO) y la intersección al origen (Kd).
Calcule el coeficiente de correlación.
✓ Discutir y comparar los resultados obtenidos por los demás equipos,
viendo el desempeño de la planta de lodos activados cuando es operada
a diferentes tiempos de retención hidráulica.
✓ Discuta la diferencia entre suponer una cinética de biorreacción de
primer orden y la cinética de Monod.
✓ Comente cuál es el significado fisiológico del factor K d. Explique la
importancia de este valor en la operación de una planta de tratamiento
biológico.

Nomenclatura y unidades
rDQO = velocidad volumétrica de consumo de DQO  mgDQO .
 l  día 

rSSV = velocidad volumétrica de crecimiento  mgSSV  .


 l  día 
r-SSV= velocidad volumétrica de muerte de los microorganismos  mgSSV  .
 l  día 
YSSV/DQO = relación estequiométrica de generación de SSV por unidad de DQO consumida.
μ = velocidad específica de crecimiento microbiano según Monod (h -1).

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μmax = constante de velocidad de crecimiento microbiano según Monod (h -1).
Ks = constante de concentración según Monod  mgDQO  .
 l 
Kd = constante de muerte de los microorganismos.
Q0 = gasto volumétrico de entrada del influente a la planta (l/día).
Va = volumen del reactor biológico o “aireador” (l).
c = factor de concentración de los microorganismos (“lodos activados”) en el segundo
sedimentador.
r = factor de recirculación de la salida del segundo sedimentador a reactor.
Qex = gasto volumétrico de salida de lodos activados del proceso (l/día)

Obras de consulta

1. Bailey, J.E. and Ollas, D.F. “Biochemical Engineering Fundamentals”. Mc Graw-


Hill. New York. 1986.
2. Eckenfelder, W.W. and Ford, D.L. “Water pollution Control”. Pemberton Press.
New York. 1970.
3. Gaudy, A. and Gaudy, E. “Microbiology for Environmental Scientists and
Engineers” Mc Graw-Hill. 1981.
4. Informe de la situación del medio ambiente en México. Compendio de Estadísticas
Ambientales. Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales. 2005.
5. James, A. (Ed) “Mathematical Models in water Pollution Control” John Wiley and
Sons. New York. 1978.
6. Metcalf and Eddy Co. “Wastewater Engineering” Mc Graw-Hill. Third Edition. New
York. 1991.
7. Rittmann, B. E. y McCarty, P.L. “Biotecnología del Medio Ambiente”. Principios y
aplicaciones. Ed. McGraw-Hill. 2001.

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