Manual de Prácticas para el Curso de

Toxicología I

Rosa María García Nieto

UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO

Sergio Arias Negrete

UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO

Gustavo Cruz Jiménez

UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO

Modificado por
JORGE ALEJANDRO ALEGRÍA TORRES
UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO

1
Manual de Prácticas para el Curso de
Toxicología I

2
 INDICE

Presentación…………………………………………………………………… 4

Práctica 1. Manejo de la esterilidad…………………………………………... 6

Práctica 2. Efecto de metales pesados en Escherichia

coli…………................................................................................................ 12

Práctica 3. Toxicidad de Cromo (III) y (VI) en la germinación de

semillas………………………………………………………………………….. 16

Práctica 4. Detección de plomo en barro vidriado………………………….. 23

Práctica 5. Ensayo de micronúcleos………………………………………..... 28

Práctica 6. Ensayo ecotoxicológico con lombrices: evasión y

viabilidad…………………………………………………………………………. 33

Bibliografía…………………………………………………………………….. 48

3
 PRESENTACIÓN

En el último siglo ha habido un gran incremento en el uso de compuestos químicos

sintéticos, empleados para diferentes propósitos, como medicamentos (drogas),
conservadores de alimentos, pesticidas, químicos de uso agrícola o casero,
agentes para limpieza y compuestos utilizados en guerras.

Solamente una parte de esos compuestos han sido suficientemente examinados

para valorar adecuadamente su impacto potencial en la salud humana. Además,
estos estudios son limitados. Por ejemplo, con frecuencia sólo se evalúa una ruta
de aplicación y podría ser que ésta no sea la principal en la que el ser humano
pudiera estar expuesto, lo cual podría ser un factor que influenciara la toxicidad.
Además, muchas de las pruebas de toxicidad se realizan en sistemas modelo
(animales, plantas, microorganismos, etc.) y se ha visto que no es posible
extrapolar los resultados de los animales al hombre en forma concluyente. Todo
esto conduce a problemas para plantear procesos regulatorios y legislativos con
información experimental limitada y por otro lado el conflicto de intereses de las
industrias, grupos de consumidores y activistas ambientales. El público en general
no está dispuesto a perder las ventajas obtenidas con la industria química, pero
cada vez demanda más ser protegidos de cualquier efecto adverso que surja por
su uso.

La toxicología es la ciencia que estudia los tóxicos y las intoxicaciones. Lo cual

comprende el estudio del agente tóxico, su origen y propiedades, sus mecanismos
de acción, las consecuencias de sus efectos lesivos, los métodos analíticos,
cualitativos y cuantitativos para su determinación, los modos de evitar la
contaminación ambiental y de los lugares de trabajo, las medidas profilácticas de
la intoxicación y el tratamiento general. Vista de este modo constituye una vasta
ciencia que, aunque sigue siendo el hombre su principal objetivo, trasciende al
medio ambiente, la industria, los alimentos, los animales etc.

Es fundamental para el progreso de la toxicología el poder realizar la

determinación de los posibles riesgos que pudieran surgir de la exposición a una
substancia. La evaluación de la toxicidad busca determinar qué tan venenoso
podría ser una substancia. La evaluación de riesgo involucra la evaluación
cuantitativa del efecto deletéreo que podría ocurrir bajo condiciones particulares
de exposición. El riesgo viene de la unión entre toxicidad y exposición en un
sentido matemático.

En este manual se plantean algunas pruebas en modelos biológicos para la

evaluación de la toxicidad de algunos compuestos. No son las únicas que se
pueden realizar; sin embargo, se trata de introducir este tipo de pruebas como

4
ejemplo para el curso de Toxicología de la carrera de Químico Farmacéutico
Biólogo.

PRÁCTICA 1

MANEJO DE LA ESTERILIDAD

Objetivo

Que el alumno reconozca la importancia del manejo adecuado de la esterilidad y

verifique el manejo personal de ella realizando la manipulación de medios, pipetas
y tubos estériles.

Introducción

El control absoluto de bacterias por esterilización y su control por confinamiento y

desinfección son aspectos muy importantes del trabajo de laboratorio. El propósito
de los procedimientos de seguridad en el laboratorio es doble, por un lado es
proteger el experimento que se está realizando y por otro proteger al
experimentador.

Si se generalizara, se podría pensar que las bacterias que normalmente son

manejadas son residentes naturales en el ambiente y por lo tanto inocuas para el
hombre. Sin embargo, hay un amplio espectro de grados de virulencia en relación
a la susceptibilidad del humano. Por este motivo, la indicación es precaución hay
que manejar todas las bacterias como potencialmente dañinas para la salud
humana.

Aunque las definiciones de esterilización, desinfección y antisepsis son aceptadas

en forma general, es muy común que estos términos se confundan. La distinción
exacta entre estos términos y el conocimiento básico de cómo realizarlos y
vigilarlos son importantes para su aplicación efectiva.

La esterilización es definida como el uso de un procedimiento físico o químico para

destruir toda la vida microbiana, incluyendo grandes cantidades de endosporas
bacterianas altamente resistentes, los cuales pueden estar en objetos inanimados.
Generalmente en el laboratorio microbiológico, el vapor es usado para la
esterilización de medios de cultivo, equipo y material de vidrio, el calor seco es
usado para material de vidrio y equipo metálico, el gas es usado para
instrumentos, la filtración para soluciones y la radiación es usada con propósitos
limitados.

5
La desinfección es un proceso menos letal que la esterilización. Elimina
virtualmente todos los microorganismos patógenos reconocidos, pero no
necesariamente todas las formas microbianas (p. ej. Endosporas bacterianas) en
objetos inanimados. Como puede verse en esta definición, la desinfección no
asegura la muerte de todas las formas microbianas, y por lo tanto el proceso de
desinfección pierde el margen de seguridad que se obtiene mediante la
esterilización, por lo que es un proceso que disminuye el nivel de contaminación
microbiana.
Descontaminación es un término usado para describir un proceso o tratamiento
que proporciona un utensilio médico, instrumento o superficie seguros para su
manejo. En el caso de instrumentos o utensilios médicos el uso de tratamientos o
proceso de desinfección no necesariamente asegura que el objeto sea seguro
para reuso en pacientes. Un proceso de descontaminación puede ir desde un
proceso de esterilización o desinfección hasta una limpieza simple con agua y
jabón.

Un antiséptico es definido como un germicida que es usado en la piel o tejido vivo

con el propósito de inhibir o destruir microorganismos. Si embargo, la distinción
entre un antiséptico y un desinfectante frecuentemente no se hace. Un
desinfectante es un germicida que es usado únicamente para destruir
microorganismos en objetos inanimados tales como utensilios médicos o
superficies, mientras que un antiséptico germicida es usado en tejidos vivos.
Aunque algunos germicidas contienen químicos activos que son usados para
ambos propósitos (por ejemplo: Iodóforos o alcoholes), el ser útil para un propósito
no asegura utilidad para el otro. La clasificación de los germicidas químicos en
sus respectivas concentraciones de acuerdo al nivel de potencia microbicida es
importante pero arbitraria. Se han propuesto tres niveles de actividad, alta,
intermedia y baja, basándose en que los microorganismos pueden generalmente
ser categorizados en varios grupos generales de acuerdo a sus niveles de
resistencia inatos al espectro de agentes germicidas químicos o físicos. Estos
grupos son mostrados en orden descendente de resistencia en el siguiente
esquema:
ESPORAS BACTERIANAS
Bacillus subtilis
Clostridium sporogenes

MICOBACTERIAS
Mycobacterium tuberculosis var. Bovis

VIRUS PEQUEÑOS
Poliovirus
Coxsackievirus
Rinovirus

HONGOS
Trichophyton sp.
Cryptococcus sp.
Candida sp.

BACTERIAS VEGETATIVAS
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Salmonella choleraesuis

6
 VIRUS TAMAÑO MEDIO
Virus del herpes simple
Citomegalovirus
Virus Sincitial respiratorio
Virus de la hepatitis B
Virus de la Inmunodeficiencia humana (HIV)

Orden descendente de resistencia a germicidas químicos

Las relaciones de estos niveles generales de resistencia microbiana a los niveles

de actividad germicida se muestran en la siguiente tabla:

Niveles de la acción desinfectante de acuerdo al tipo de microorganismo.

Efecto mortal
Bacterias hongos Virus
Nivel Esporas Bacilo Células pequeños Medianos
desinfectante tuberculoso vegetativas
Alto + + + + + +
Intermedio - + + + + +
Bajo - - + + + +

En la siguiente tabla se muestran los métodos de esterilización y desinfección más

comunes:

Métodos de esterilización o desinfección: niveles de actividad de germicidas líquidos selectos. a

Método Concentración o nivelb Actividad desinfectante

Esterilización
Calor
Calor húmedo (vapor a presión) 121 ºC o 132 ºC por varios intervalos de
tiempo (15 min)
Calor seco 171 ºC por 1 h; 160 ºC por 2 h; 121 ºC por
16 h.
Líquidos
Glutaraldehído Variablec
Peróxido de hidrógeno 6% – 30%
Formaldehído 6% – 8%d
Dióxido de cloro Variablee
Ácido peracético Variablef
Desinfección
Calor
Calor húmedo (incluye 75 ºC – 100 ºC (alta)
pasterización con agua caliente)
Líquidosg
Glutaraldehído Variable Alta a intermedia
Peróxido de hidrógeno 3% – 6% Alta a intermedia
Formaldehído 1% – 8% Alta a baja
Dióxido de cloro Variable Alta
Ácido peracético Variable Alta
Compuestos cloradosh 500 – 5 000 mg de cloro libre o Intermedia
disponible/litro
Aloholes (etílico, isopropílico)i 70% Intermedia
Compuestos fenólicos 0,5% – 3% Intermedio a baja
Compuestos iodóforosj 30-50 mg de yodo/litro; 1%-2% de yodo Intermedia a baja
disponible
Compuestos cuaternarios de 0,1% - 0,2% Baja
amonio
Antisepsisk
Alcoholes (etílico, isopropílico) 70%
Iodóforos 1 mg -2 mg de yodo libre/litro; 1%-2% de
yodo disponible

7
 Clorhexidina 0,75% -4,0%
Hexaclorofeno 1% -3%
Paraclorometaxilenol 0,5%-4,0%
a
Esta lista de germicidas químicos, se centra en formulaciones genéricas.
b
Para esterilización o desinfección se refiere a las instrucciones del fabricante para los tiempos de exposición y condiciones
también como recomendaciones para enjuague y manejo subsecuente de utensilios procesados.
c
Hay varias preparaciones de glutaraldehído en el mercado, pueden ir desde las que se pueden utilizar directamente, u
otras que deberán diluirse antes de usarse.
d
Debido a la controversia sobre el papel del formaldehído como un carcinógeno ocupacional potencial, su uso está limitado
a ciertas situaciones específicas bajo condiciones controladas.
e
El dióxido de cloro se dice que es el químico activo resultante al mezclar agua, clorito de sodio y ácido láctico en diversas
proporciones, dependiendo de su uso como esterilizante o desinfectante. De forma similar al caso de los compuestos
clorados, el espectro de acción germicida es amplio, pero los efectos oxidantes en metales o superficies plásticas pueden
limitar su uso.
f
En años recientes, se han registrado varios productos conteniendo bajas concentraciones (<0,1%) de ácido peracético
(peroxiacético) combinado con bajas concentraciones (<0,1%) de peróxido de hidrógeno para uso como esterilizantes o
desinfectantes. Esta combinación de dos poderosos químicos oxidantes a bajas concentraciones hace posible tener una
actividad germicida de amplio espectro mientras que se minimizan los efectos negativos tales como la corrosión que se
presenta a concentraciones altas del ácido peracético.
g
Debido a que existen muchas formulaciones registradas como desinfectantes hospitalarios que actúan sobre diferentes
tipos de bacterias, y que cada uno de ellos está compuesto de varios ingredientes activos, es difícil definir una clasificación
genérica. Debido a esto hay que poner mucha atención a la información de los productos comerciales, así como a la
literatura respecto al espectro de actividad, patrones de uso, instrucciones de uso, precauciones, etc.
h
Estos desinfectantes pueden estar disponibles en forma líquida o sólida (por ejemplo: Hipoclorito de sodio o de calcio). El
blanqueador casero común, es una excelente y barata fuente de hipoclorito de sodio. Concentraciones de entre 500 y 1
000 mg de cloro por litro son apropiadas para la gran mayoría de usos que requieren un nivel intermedio de actividad
germicida. Concentraciones más altas son extremadamente corrosivas, además de irritantes, y sólo deberán usarse en
material orgánico que es difícil de limpiar (por ejemplo: Superficies porosas) o con contenidos inusualmente altos de
microorganismos (por ejemplo: Salpicaduras de material cultivado en el laboratorio).
i
La efectividad de los alcoholes como germicidas de nivel intermedio es limitada, puesto que se evaporan rápidamente,
dando como resultado tiempo de contacto muy cortos y también poca capacidad para penetrar residuos de material
orgánico. Hay rápida actividad tuberculocida, bactericida y fungicida, pero varía en el espectro de la actividad virucida. Los
utensilios para ser desinfectados con alcoholes deberán ser cuidadosamente limpiados previamente y entonces deberán ser
sumergidos por un tiempo apropiado (por ejemplo: 10 min).
j
Sólo deberán ser usados iodóforos comerciales como desinfectantes de superficies duras, y siguiendo las instrucciones del
fabricante para garantizar la efectividad y estabilidad del producto. Estos antisépticos no son convenientes para la
desinfección de instrumentos médicos o utensilios o para la desinfección de superficies en el ambiente.
k
Esta no es una lista de formulaciones completa, aunque incluye los germicidas que son más comúnmente usados en
como antisépticos en hospitales.

Los factores que influencian la muerte microbiana que deben ser considerados en
la selección del proceso de esterilización incluyen los siguientes:
1. El diseño y/o composición química del objeto.
2. El estado biológico y físico del microorganismo antes de la esterilización.
3. La resistencia inherente del microorganismo al proceso de esterilización y la
proporción resultante de los microorganismos muertos.
4. La población inicial de microorganismos asociada con el objeto de que va a
ser esterilizado.
5. La intensidad del agente esterilizador.
6. La duración de la exposición al ambiente esterilizador.

En la siguiente tabla se muestran los métodos convencionales de esterilización y

los utensilios esterilizados por cada uno.

Proceso Objeto
Calor húmedo Soluciones parenterales
Instrumentos
Equipo para procesos asépticos
Medios de cultivo

8
 Tapones de hule
Calor seco Material de vidrio
Aceites
Instrumentos
Agujas
Petrolato
Polvos
Equipo para procesos asépticos
Óxido de etileno Equipo para anestesia
Catéteres
Equipo para diagnóstico
Utensilios prostéticos implantables
Equipo de laboratorio
Equipo para terapia respiratoria
Equipo quirúrgico
Suministros quirúrgicos
Instrumentos telescópicos
Tubos plásticos
Materiales de empaque
Radiación ionizante Polvos
Vendajes
Tubos para colección de sangre
Lancetas
Cepillos y brochas
Ungüentos para quemaduras
Parches para quemaduras
Tubos de centrífuga
Unidades de diálisis
Suturas quirúrgicas
Aserrín para animales de laboratorio
Batas de laboratorio
Filtración Gases
Líquidos
Ungüentos y aceites de baja viscosidad

Desarrollo

Material y substancias utilizadas

Tubos de 13 mm x 100 mm con tapa de rosca,

Pipetas Automáticas y puntas,
Propipeta,
Papel,
Papel aluminio,
Mechero,
Gradilla,
Algodón,
Tijeras,
Botellas con tapa de rosca,
Caldo nutritivo.

Procedimiento

9
 Prepare el caldo nutritivo y esterilice en botellas de 250 ml o 500 ml con
tapa de rosca.
Esterilice 30 tubos de 13 mm X 100 mm con tapa de rosca dejando flojas
las tapas para realizar el proceso adecuadamente. Al final del proceso
cierre las tapas.
Esterilice cajas con puntas para las pipetas automáticas.
Realice la esterilización en autoclave a 120 ºC por 15 minutos.
En esterilidad (en campana de flujo laminar o sobre la mesa con mecheros)
Coloque 5ml de caldo nutritivo a cada uno de los tubos estériles.
Incube a 37 °C los tubos y el frasco con el caldo nutritivo restante durante
24 horas.
Observe si hay crecimiento.

Observaciones

Resultados

Conclusiones

10
 PRÁCTICA 2

EFECTO DE METALES PESADOS EN Escherichia coli

Objetivo

Construir una curva dosis-respuesta en un cultivo de Escherichia coli utilizando

sales de metales pesados.

Introducción

Las enfermedades infecciosas han causado la muerte de millones de series

humanos a lo largo de la historia de la humanidad. Con el descubrimiento de los
antibióticos, esta realidad comenzó a ser modificada y en los años ochenta del
siglo XX, podía hablarse de una victoria prácticamente total frente a las
infecciones por microorganismos. Sin embargo, este aparente triunfo fue destruido
por la propagación de una nueva enfermedad: el síndrome de inmunodeficiencia
adquirida (SIDA).

En la actualidad, las enfermedades infecciosas muestran una tendencia

emergente, por lo que el conocimiento de los antibióticos, a quienes se prefiere
denominar en la actualidad como drogas antibacterianas, resulta de suma
importancia para los interesados en los temas de salud.

El origen de la palabra antibiótico es griego: anti significa contra, y bios,

vida. Los antibacterianos son sustancias naturales, semisintéticas o sintéticas,
que, a concentraciones bajas, inhiben el crecimiento o provocan la muerte de las
bacterias. Popularmente se les conoce a todos como antibióticos, aunque en
realidad, estos son únicamente las sustancias producidas de forma natural por
algunos microorganismos.

La acción del agente antibacteriano es lograda mediante los siguientes

mecanismos de acción:
inhibición de la síntesis de la pared celular
inhibición de la síntesis de proteínas
inhibición del metabolismo bacteriano
inhibición de la actividad o síntesis del ácido nucleico
alteraciones en la permeabilidad de la membrana celular

Con cualquiera de estas acciones o con una combinación de ellas, el germen

es incapaz de sobrevivir.

11
 Un germen puede desarrollar resistencia ante un antibiótico. Esto quiere
decir que será incapaz de dañar a dicho germen. La resistencia puede
desarrollarse por mutación de los genes residentes o por adquisición de nuevos
genes. La resistencia de los gérmenes a los antibióticos es en la actualidad uno de
los grandes desafíos para las autoridades de salud.

Al escoger un antibiótico que se ha de utilizar en un régimen terapéutico

determinado, han de tenerse en cuenta la edad del enfermo, el cuadro clínico que
presenta, el sitio de la infección, su estado inmunitario, otros factores y la
prevalencia de resistencia local.

Escherichia coli

E. coli es una bacteria bacilar, gram negativa, anaerobia facultativa,

perteneciente a la familia de las Enterobacteriaceae. Existen cientos de cepas de
esta bacteria, la mayoría son inofensivas y viven en el intestino de humanos y
animales sanos. Sin embargo, existe una cepa, la O157:H7 que produce una
poderosa toxina, la cual puede causar una infección severa. La mayoría de las
enfermedades por esta bacteria se han asociado a comer carne molida de res mal
cocinada. Se sabe que es sensible a las cefalosporinas, las quinolonas y a la
ampicilina.

Curva Dosis-Respuesta

La curva dosis-respuesta se construye graficando en las ordenadas las

respuestas o efectos causados en el organismo expuesto a una substancia
química y en las abscisas las Dosis (D) a las que fue expuesto. Si la
experimentación se hace con un solo individuo, tejido, etc., la respuesta observada
normalmente es una función hiperbólica de la dosis de una forma similar a la
ecuación Michaelis-Menten para expresar la velocidad inicial de una reacción
enzimática. La curva pasa por el origen del sistema de coordenadas cartesianas y
la pendiente máxima se presenta en el origen. La pendiente permanece
aproximadamente constante durante un rango amplio de la dosis (cinética de
primer orden), después la pendiente disminuye con la dosis hasta que se vuelve
cero (cinética de orden cero) y la respuesta adquiere su valor máximo. A este
valor máximo se le denomina efecto máximo (E max) y es una medida de la eficacia
del tóxico.

En algunas ocasiones, la relación dosis-respuesta no es tan definida y

dentro de una población se observa una distribución de respuestas para cada
dosis. En este caso el efecto que se mide no es la magnitud, sino el porcentaje de
la población en este estudio que presenta una determinada respuesta para cada
dosis suministrada. Este tipo de efecto se denomina cuantal. En estos casos se
acostumbra graficar, en la ordenada el por ciento de la población que presenta un
determinada valor de la respuesta y en la abscisa, el logaritmo de la dosis
suministrada. Esta curva tiene forma sigmoidal. A la región de la curva donde los

12
efectos no son medibles, se le conoce como región NOAEL (por sus siglas en
inglés (No Observed Adverse Effects Level).

Hay compuestos peligrosos que presentan dos curvas dosis-efecto, una

curva que representa efectos tóxicos y otra los efectos letales. Cuando se
aumenta el nivel de la dosis, se pasa de un área de la curva en la que no se
observan efectos dañinos a otra donde se observan efectos tóxicos crecientes.
Cuando se aumenta aún más la dosis, se presentan los efectos letales crecientes
que también se relacionan con la dosis en la misma forma que los efectos
anteriores.

Desarrollo

Material

Tubos de ensaye (33 por equipo)

Incubadora a 37 ºC
Inóculo de Escherichia coli o Salmonella tiphimurium
Agua destilada
Sales: de Ag(NO3), Cu(NO3)2, K2Cr2O7 y Pb(NO3)2

Procedimiento

1. Prepare una solución stock de 200 mM (50 mL) de cada sal.

2. Realice diluciones seriadas (1/3) de 1 mL a lo largo de 10 tubos, para que al
tomar 25 µl de cada tubo, se obtenga la concentración final señalada.
3. Todo debe realizarse por triplicado.

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caldo de 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
cultivo
(ml)
Sal (µl) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

Inóculo 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.0.25 0.25 0.25
(μl)
Conc. 1000
Final
(µm)

4. Incube a 37 ºC durante 12-14 horas y determine la absorbencia a 600 nm.

5. Construya una curva dosis respuesta para cada sal.

Cálculos

13
C1V1=C2V2

Observaciones y resultados

Gráfica:

Conclusiones

14
 PRACTICA 3

TOXICIDAD DE CROMO (III) Y (VI) EN LA GERMINACION DE SEMILLAS

Objetivo

El alumno identificará los diferentes síntomas de toxicidad causados por metales

(cromo) en plantas.

Introducción

Los metales son elementos distribuidos en el ambiente. Algunos de ellos pueden

ser dañinos para el hombre. Los metales difieren de otros tóxicos ya que estos no
pueden ser destruidos ni creados por el hombre. Su influencia en el hombre
depende de su transporte a través del medio ambiente (agua, aire, suelo y
comida), o por alteración de la especiación bioquímica del elemento.

Los metales se redistribuyen de manera natural en el medio ambiente mediante

los ciclos biológicos y geológicos. El agua de lluvia disuelve las rocas y las menas
y transporta los materiales a los ríos, arroyos y luego los sedimenta. Los ciclos
biológicos incluyen la bioconcentración por las plantas y los animales y los
incorporan a sus ciclos alimenticios. Por otro lado, las actividades antropogénicas
modifican (aumentan) el contenido del metal en una región.

Hay factores que influencian la toxicidad de los metales:

-Interacción con metales esenciales. Por ejemplo, por metabolismo similar entre
un metal esencial y el tóxico.

-Formación de complejos metal-proteína. Como las metalotioneínas que se

acomplejan con Cd, Zn, o Cu.

-Edad y estadio de desarrollo. En el caso de niños y jóvenes, ingieren más

calorías por Kg de peso que los adultos, por lo que si hay algún metal
contaminante, mayor será la ingesta. Además, por ejemplo el Pb se absorbe más
por vía GI en los niños que en los adultos. Por otro lado, el crecimiento rápido y la
división celular, da oportunidad para efectos genotóxicos.

-Factores por estilo de vida. Por ejemplo, el tabaquismo aumenta la exposición al

Cd y la ingestión de alcohol predispone a la pérdida de metales esenciales.

15
-Forma química o especiación. La forma química de un metal repercute en la
biodistribución en el organismo. El tetraetilo de Pb y el metilmercurio son solubles
en lípidos y son más solubles en mielina que las sales inorgánicas de éstos.

-Estatus inmune del huésped. Algunos metales producen reacciones de

hipersensibilidad: Hg, Au, Pt, Be, Cr y Ni (hipersensibilidad tipo I). El Au puede
actuar como hapteno (hipersensibilidad tipo II). Hipersensibilidad tipo IV se
presenta con el Ni o Cr. Se pueden presentar granulomas con berilio o zirconio.

Químicamente los metales pesados reaccionan con ligandos que contengan

Oxígeno (hidroxilo, carboxilato, fosfato, cetona), azufre (sulfhidrilos o disulfuros),
nitrógeno (NH2 y NH), o pueden formar enlaces de coordinación (agentes
quelantes).

Desarrollo

Material

Semillas de trigo, lenteja o maíz,

Vasos de precipitados de diferentes volúmenes,
Agitadores magnéticos,
Mechero,
Probetas,
Matraces volumétricos de diferentes volúmenes,
Pipetas automáticas y puntas,
Ca(NO3)2.4H2O,
CaCl2.2 H2O,
KH2PO4,
KNO3,
Mg(ClO4)2,
FeCl3,
H3BO3,
MnCl2. 4H2O,
MoO3,
Zn(NO3)2.6H2O,
CuSO4.5H2O,
Cloro comercial,
CrCl3,
Na2CrO4,
NaOH,
HCl,
HNO3,
H2O2 al 30%,
Agua destilada,

Soluciones

16
Preparación de la solución nutritiva de Hoagland

Prepare las soluciones stock de las siguientes sales:

Sal g/lt

Ca(NO3)2.4H2O 8,431
CaCl2.2 H2O 31,421
KH2PO4 13,183
KNO3 2,585
Mg(ClO4)2 23,323
FeCl3 0,726
H3BO3 0,143
MnCl2. 4H2O 0,077
MoO3 0,001
Zn(NO3)2.6H2O 0,011
CuSO4.5H2O 0,011

Tome 10 ml de cada una de las soluciones anteriores, agregue 800 ml de agua

destilada, ajuste a pH 5,8 y afore a l lt.

Solución de hipoclorito de sodio para eliminar microorganismos de las

semillas

Tome 4 ml de cualquier blanqueador comercial y afore a 100 ml. Prepare la

solución un poco antes de su utilización.

Para desinfectar material, utilice 8 ml de blanqueador comercial y afore a 100 ml.

Sumerja el material a desinfectar en la solución durante 30 minutos.

Solución stock de Cr(III) y Cr(VI)

Prepare una solución stock de 1 000 ppm de CrCl 3 y otra de Na2CrO4 en agua
destilada. Calcule la cantidad necesaria para las concentraciones requeridas y
agregue a la mezcla de las soluciones nutritivas de Hogland antes de aforar.

Procedimiento

1. Coloque 100 g de semillas en 500 ml de solución de hipoclorito de sodio en

un vaso de precipitados de 1 000 ml. Deje 30 minutos con agitación.
2. Elimine el agua con hipoclorito de las semillas y enjugue 3 veces con agua
destilada estéril.
3. En un refractario o recipiente grande, extienda toallas de papel y
humedézcalas con la solución nutritiva.
4. Coloque varias semillas a 1 cm de la orilla del papel como se muestra en la
figura. Doble el papel a lo largo (doblez 1) para que las semillas queden

17
 entre el papel, y luego doble a lo ancho varias veces, como si se estuviera
haciendo un rollo de papel (doblez 2). Haga el procedimiento en una
campana de flujo laminar o en un área previamente desinfectada con
solución de hipoclorito de sodio comercial al 50% v/v y trabaje entre dos
mecheros, como si se hiciera un sembrado microbiológico.
Doblez
2
Doblez
1

5. Los rollos con las semillas se colocan en recipientes de plástico

desechables desinfectados con solución de hipoclorito de sodio. En el
recipiente se deberá colocar una cantidad de solución nutritiva y los rollos
deberán estar mojados por la solución, sin que las semillas estén
sumergidas y tapar con una bolsa de plástico. Monte el experimento por
duplicado y por lo tanto deberá haber dos recipientes para control (solución
nutritiva sin cromo), dos con solución nutritiva con 10 ppm, dos con 100
ppm y dos con 1 000 ppm de cromo. El maestro asignará qué tipo de sal de
cromo usará cada equipo.
6. Coloque los recipientes en un lugar limpio e iluminado. Deje 1 semana para
dejar crecer las plántulas. Remplace el agua que se evapore a lo largo de la
semana, con agua destilada.
7. A los siete días, saque las plántulas con cuidado. Registre si todas las
semillas germinaron. En las que germinaron, mida con una regla la longitud
de la raíz primaria, longitud del tallo, longitud de las hojas y registre la
presencia o ausencia de raíces secundarias y de hojas.
8. Compare los resultados tanto del control, como de las diferentes
concentraciones de cromo.

Resultados

Control:

18
10 ppm:

100 ppm:

19
1 000 ppm:

Conclusiones

Cuestionario

1. Compare sus resultados con los de sus compañeros. En general, ¿Cuál es

más tóxico en los organismos el Cr(III) o el Cr(VI)? ¿Por qué?

20
 2. ¿Qué efectos de toxicidad se presentaron en las plantas utilizadas?

3. ¿Cómo se podría determinar la concentración de cromo en cada parte de la

planta?

Bibliografía

21
 PRÁCTICA NO. 4

IDENTIFICACIÓN DE PLOMO EN UTENSILIOS DE BARRO VIDRIADO

Colaboradores: Samantha Vianey Bustamante Cuevas

Luis Alberto Hernández Zarate
(Estudiantes de Q.F.B.-UG)

Objetivos
• Determinar cualitativamente la presencia de plomo en recipientes de
cerámica a diferentes valores de pH.
• Discutir los efectos toxicológicos que presenta el plomo sobre los
organismos vivos.

Introducción
El plomo es un metal tóxico presente de forma natural en la corteza terrestre.
Su uso generalizado ha dado lugar en muchas partes del mundo a una
importante contaminación del medio ambiente, un nivel considerable de
exposición humana y graves problemas de salud pública. Entre las principales
fuentes de contaminación ambiental destacan la explotación minera, la
metalurgia, las actividades de fabricación y reciclaje y, en algunos países, el
uso persistente de pinturas y gasolinas con plomo. Más de tres cuartes partes
del consumo mundial de plomo corresponden a la fabricación de baterías de
plomo-ácido para vehículos de motor. Sin embargo, este metal también se
utiliza en muchos otros productos, como pigmentos, pinturas, material de
soldadura, vidrieras, vajillas de cristal, municiones, esmaltes cerámicos,
artículos de joyería y juguetes, así como en algunos productos cosméticos y
medicamentos tradicionales. También puede contener plomo el agua potable
canalizada a través de tuberías de plomo o con soldadura a base de este metal.
En la actualidad, buena parte del plomo comercializado en los mercados
mundiales se obtiene por medio del reciclaje.

Muchos casos de envenenamiento con plomo son causados por productos

disponibles en el hogar. Una fuente de plomo es la vajilla de cerámica vidriada,
ya que, los compuestos de plomo han sido usados para vidriado de vajillas
puesto que estos bajan el punto de fusión, amplían el rango de procesamiento,
proporcionan baja tensión superficial, y permiten una gran flexibilidad en la
formulación de una composición que logre propiedades de baja expansión,
superficie suave y alto brillo, no todos los vidriados cerámicos desprenden
plomo, sino aquellos cocidos a bajas temperaturas y con altas dosificaciones de
este metal en el vidriado. Se demostró que, en el uso de la cerámica vidriada, la
frecuencia con que se emplea ésta y el tiempo en que ha venido siendo

22
utilizada, se asocia a una mayor concentración de plomo en la sangre de los
niños. Los casos de envenenamiento con plomo resultantes del consumo de
bebidas ácidas almacenadas en recipientes cerámicos vidriados han sido
reportados desde Pakistán, Japón, México hasta Yugoslavia.

Se cree que el curado ácido de las piezas cerámicas, es decir, un lavado con
vinagre previo al primer uso sería una medida preventiva para disminuir los
riesgos de una intoxicación con plomo y cadmio. Estudios realizados en México en
vasijas de barro vidriadas demostraron que, aunque el contenido de plomo
disminuyó proporcionalmente con el número de lavados, el plomo residual se
conservó por arriba de los niveles permisibles, por lo que no sería una medida
preventiva adecuada y presenta el hecho de que los metales no se extraen en su
totalidad con tan sólo un primer contacto con la solución lixiviante. Sin embargo,
en un estudio realizado por Schellenberg (1990), sobre la presencia del plomo
lixiviable en vidriados cerámicos, de los tratamientos previos, mostró que la
mayoría del plomo se disuelve en el primer minuto después de la adición del
ácido, con muy poco incremento luego de las 24 horas.
La exposición al plomo puede afectar adversamente a los sistemas nervioso,
inmunológico, reproductivo y cardiovascular. La absorción depende de tránsito
gastrointestinal, estado nutricional y edad; se produce principalmente por medio de
los sistemas respiratorio y gastrointestinal; es mayor si hay deficiencias de hierro o
calcio, en dietas ricas en grasas y durante la infancia (cuando es de 40 a 50%,
mientras que en la edad adulta es de 10%). La vida media del plomo en el tejido
cerebral es de aproximadamente 2 años y en los huesos persiste durante 20 a 30
años. Se ha reportado que cruza la placenta y la barrera hematoencefálica, por lo
que se considera que daña la función neurocognitiva en bebés y niños pequeños
generando problemas de conducta, disminución del coeficiente intelectual y del
aprendizaje.

23
Desarrollo

Materiales
• 3 vasijas de cerámica
• Parrilla eléctrica
• Gradilla
• 10 tubos de ensayo 13x100
• Baño María
• Termómetro

24
 • Pipetas de 1 ml
• Papel indicador de pH
• Probeta de 100 ml
• Vaso de precipitado 100 ml

REACTIVOS.

• Agua destilada
• HCl conc.
• NaOH 1 N
• HNO3 Conc.
• KI 1N y almacenar protegida de la luz.

Procedimiento
1.- Traer tres vasijas de barro vidriadas nuevas.
2.- Marcar las vasijas como A, B y C.
3.-
 Colocar agua destilada en la vasija A (la mitad del recipiente).
 Colocar agua destilada y ajustar a pH < 2 con HCl conc., en la vasija
B (la mitad del recipiente).
 Colocar agua destilada en la vasija C y ajustar a pH > 10 con NaOH
1 N (la mitad del recipiente)
 Registrar el pH de cada vasija.

4.- Calentar las vasijas a ebullición y dejarlas hervir 30 minutos, éstas

deben estar siempre en la campana de extracción. En caso de que el
contenido de agua disminuya considerablemente puede agregar mayor
cantidad de la misma solución.
5.- Enfriar la solución y medir el pH.
6.- Colocar por separado 5 ml de solución de cada vasija en tubos de
ensayos más una gota de HNO3 concentrado.
8.- Agregar a cada tubo, 1 ml de la solución de yoduro de potasio (esta
solución es sensible a la luz), procurando que la solución caiga
directamente en el contenido del tubo. No agite y observe.
10.- Para el reporte elabore una tabla que relacione el valor de pH con la
presencia del plomo, para las tres vasijas.
11.- Un precipitado amarillo indica la presencia de plomo

Resultados

25
Cuestionario
1. Menciona otras fuentes de contaminación de plomo en el mundo y en
México
2. Mencione 5 alimentos cuyo pH sea ácido y 5 cuyo pH sea alcalino.
3. ¿Cómo influye la edad del individuo en la absorción gastrointestinal del
plomo?
4. ¿Qué efectos ocurren en los eritrocitos cuando la concentración de plomo
rebasa el valor de 80µg/dl y que es lo que provoca esta manifestación?
5. ¿Cómo se manifiesta principalmente la intoxicación por plomo en el sistema
nervioso central y en el tracto gastrointestinal?
6. ¿Cuál es la t1/2 del plomo en sangre y huesos? Y ¿qué papel juegan los
eritrocitos en la relación de concentración plasma/orina en la eliminación del
mismo?
7. Describir la reacción entre el Pb y el KI, y el producto amarillo resultante.

Bibliografía
-OMS. (Septiembre 2016). Intoxicación por plomo y salud. Organización
Mundial de la Salud, 1, 2.

-MASKANA, Vol. 7, No. 1, 2016 Revista semestral de la DIUC 97 Evaluación de

la extracción de plomo y cadmio de vajilla cerámica vidriada Marittza E. Flores,
Marcela M. Idrovo, Damián V. Flores Centro de Análisis de Minerales Metálicos
y No Metálicos (CESEMIN), Facultad de Ciencias Químicas, Universidad de
Cuenca, Campus Balzay, Av. Víctor Manuel Albornoz y Av. De Los Cerezos, CP
010103 Cuenca, Ecuador.

26
 PRÁCTICA 5

ENSAYO DE MICRONÚCLEOS

Objetivo

Determinar la presencia de micronúcleos como medida de inestabilidad genética

inducida por agentes genotóxicos.

Introducción

La integridad genética de la población humana se ve afectada por la actividad

industrial, por lo que es importante utilizar métodos para determinar el grado de
daño genético en una población (ensayos de genotoxicidad). Los micronúcleos
son cuerpos citoplásmicos de naturaleza nuclear que corresponden a material
genético no incorporado correctamente a las células hijas durante la división
celular. Estos reflejan aberraciones cromosómicas y son originados por roturas en
el material genético o por errores durante la replicación y posterior división del
DNA y/o por exposición a agentes genotóxicos. Hay factores que pueden influir o
modificar el número de micronúcleos que pueden estar presentes en una célula,
como edad, género, tratamientos médicos, la exposición diaria a agentes
genotóxicos etc.

Los micronúcleos (MN) son masas de cromatina que tienen forma de pequeños
núcleos, que aparecen cerca del núcleo principal en las células interfásicas. Los
MN se pueden generar en forma espontánea o como respuesta a determinados
agentes (clastogénicos y/o aneugénicos) como resultado de la pérdida de
fragmentos cromosómicos y/o cromosomas enteros durante la división celular. Las
roturas cromosómicas darán lugar a fragmentos cromosomales acéntricos que al
no disponer de centrómero no se incluirán en los núcleos hijos durante la división
celular, al no poderse unir al huso mitótico en la anafase. Estos fragmentos se
rodean de membrana nuclear y aparecen como pequeños núcleos. Si el daño
genotóxico ha afectado a las proteínas del cinetocoro al centrómero o al huso
mitótico lo más probable es que haya un retraso mitótico y un desequilibrio en la
distribución de cromosomas provocando que los cromosomas rezagados se
pierdan durante la anafase y se rodeen de envoltura nuclear.

Del 10 al 25% de los linfocitos de sangre periférica son de vida larga (hasta más
de 5 años) y generalmente están en estado no proliferativo (fase G 0), al estar en
este estado, requieren un estímulo durante el cultivo que se realiza con PHA. Sin
embargo, como los MN son inestables tienden a desaparecer a lo largo de las
divisiones celulares, por lo cual es importante saber si una célula se ha dividido y
cuántas veces lo ha hecho, para ello se utiliza citocalasina B que detiene la
citocinesis al impedir la polimerización de la actina. De esta forma las células que
hayan llevado a cabo una división celular aparecerán como binucleadas y las que

27
realicen más de una división aparecerán como multinucleadas. La frecuencia
basal de MN en sangre periférica oscila entre 0 y 2.5%.

Los tejidos epiteliales proliferan muy rápido y están en contacto continuo con el
ambiente. El epitelio está formado por varias capas de células, las cuales van
exfoliando a medida que alcanzan la superficie, por cual el daño que puede
observarse es el que ha ocurrido en las células basales que es el lugar en el que
las células se dividen para formar el tejido. La renovación rápida del tejido hace
que los MN aparezcan entre 1 y 3 semanas después de la exposición al agente
tóxico, ya que es el tiempo que tardan estas células en llegar a la superficie del
tejido. La frecuencia de MN en células de exfoliación epitelial de la mucosa tiende
a ser inferior a la que se observa en células sanguíneas (0.03 a 0.47%).

En la tabla 1 se presentan las diferencias entre células binucleadas y micronúcleos

y en la figura 1 se presentan fotografías de células con micronúcleos.

Tabla 1. Criterios definidos por el HUMN-project para la selección de células binucleadas y de

micronúcleos en cultivos de células humanas.

Criterios para células binucleadas Criterios para micronúcleos

El citoplasma debe distinguirse claramente
Membranas citoplasmáticas y nuclear intactas
Núcleos con similar grado de condensación de
la cromatina
Igual tamaño, forma (ovalados) y patrón de
tinción
Pueden estar unidos por puentes
nucleoplasmáticos
Pueden tocarse, pero no solaparse
Ninguno de los núcleos debe encontrarse en
etapas de apoptosis
El diámetro oscila entre 1/16-1/3 de la media
del diámetro del núcleo principal
No refractarios
Intensidad de tinción similar a los núcleos
principales o superior
Forma similar a los núcleos de la célula
binucleadas
No conectados con ninguno de los núcleos de
las células binucleadas
Pueden tocar los núcleos de la célula
binucleadas pero no solaparse con ellos

Figura 1 (a) (b) y (c) células binucleadas portadoras de micronúcleos; tanto las células como los
micronúcleos cumplen los criterios de selección definidos por el comité internacional de
micronúcleos humanos; (d) (e) y (f) distintos estadios de células en vías de apoptosis; (g) (h)
e (i) células con distintos índices de división nuclear; (g) células mononucleadas; (h) célula
trinucleada portadora de micronúcleos: (i) célula tetranucleada portadora de micronúcleos,
(j) célula mononucleada con micronúcleos

28
Reactivos

Amortiguador
EDTA 0.1 M
Tris HCl 0.01M
NaCl 0.02 M
pH 7.0

Giemsa al 10%
En una caja Koplin colocar 5 ml de solución madre de Giemsa y agregar 45 ml de
agua destilada.

Solución madre de Giemsa

Giemsa 1 g
Glicerina 67 ml
Metanol absoluto 133 ml
Calentar en estufa o en baño maría la glicerina a 60ºC, agregar el colorante y
mantener 30 min a la misma temperatura. Agregar el metanol y agitar durante 4 h.
Filtrar y guardar en frasco ámbar en el refrigerador.

Desarrollo

Procedimiento

MN en células de epitelio bucal

Realizar un raspado de la parte interna de las mejillas con un cepillo dental sin
tocar lengua ni dientes. Sumergir el cepillo en 10 ml de amortiguador (EDTA 0.1 M,
Tris HCl 0.01 M, NaCl 0.02 M, pH 7.0), agitar por 1 minuto y centrifugar a 1500
rpm durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y lavar 3 veces con el
amortiguador a las mismas condiciones. Al final la pastilla se resuspende en 1.5 ml
de amortiguador. Dejar caer desde una distancia de 20 cm dos gotas de la
suspensión de linfocitos en un portaobjetos humedecido con etanol. Dejar secar la
laminilla a 37ºC durante 10 minutos. Sumergir la laminilla en el colorante Giemsa
al 10% durante 5 a 10 minutos. Realizar la observación y el conteo en el
microscopio mediante inmersión.

Resultados

Se cuentan 1000 células en interfase y se indicará el número de células con MN.

Observación en el microscopio

29
Conclusiones

Cuestionario

1. Describa mediante un esquema cómo se producen los micronúcleos en una

célula.

2. Mencione qué es un agente clastogénico.

3. Mencione varios xenobióticos clastogénicos.

30
 4. Defina lo que es un biomarcador de efecto temprano.

5. Investigue si hay valores de referencia para este biomarcador en población

humana.

Bibliografía

31
 PRÁCTICA 6

ENSAYO ECOTOXICOLÓGICO CON LOMBRICES: EVASIÓN Y VIABILIDAD

 EVASIÓN

Este ensayo es una prueba aguda (se desarrolla en 48 h) que se puede aplicar
como una alternativa a pruebas de mortalidad. Se basa en la evaluación de
efectos subletales caracterizados por el comportamiento de evasión de las
lombrices, para la cual se mide el número de lombrices que se desplazan desde
un suelo contaminado y que, por tanto, evaden la exposición. Dicho
comportamiento se calcula a través de la concentración efectiva media (CE50),
que indica la concentración a la que el comportamiento de evasión es el 50 % de
los organismos expuestos, comparado con el control. Esta prueba se usa para
evaluar si el hábitat es funcional para la lombriz (Feisthauer, 2003; Hund et al.,
2003).

Material y equipo

Contenedor de prueba
Guantes
Balanza analítica
Papel aluminio
Micropipeta de 100 a 1000 μL
Papel filtro
Potenciómetro
Pinzas
Pipetas volumétricas de 1 a100 mL
Puntas para micropipeta de 100 a 1000 μL
Tela sintética (organza)

Contenedor de Prueba

El contenedor de prueba es un recipiente redondo de acero inoxidable o PVC con

un diámetro de 21 cm, altura de 5 cm y espesor de 3 mm; tiene seis cámaras
unidas en forma radial con paredes (placas) de 6 cm de ancho, 5 cm de altura y un
espesor de 2 mm, y una cámara central con un diámetro de 8 cm y paredes de es-
pesor de 2 mm. Las paredes y la cámara central están intercomunicadas con cinco
arcos y dos arcos, respectivamente, los cuales tienen una dimensión de 0.5 cm de
altura y 1 cm de ancho.

32
Organismos de prueba

Se emplean lombrices adultas cliteladas (Eisenia fetida), con un peso de 0.250 a

0.500 g cada una.

Suelo

El suelo problema (4 kg) se tamiza a través de una malla de 4 mm. Se determina

su pH y porcentaje de Humedad. En función de los resultados de estas
determinaciones se realiza el ajuste a un pH de 6.5 a 7.0 y un contenido de
humedad del 70%. Las concentraciones de muestra provienen de diferentes
suelos contaminados y sitios de referencia (también se puede trabajar con fases
de procesos de biorremediación), por lo que se obtienen suelos o muestras con
concentraciones diversas.

Procedimiento

Preparación de los organismos

Previamente a la prueba, las lombrices se depositan en cajas de Petri con papel
filtro humedecido con agua desionizada, para que vacíen sus intestinos durante 5
h. Posteriormente son lavadas, secadas y pesadas.

Desarrollo de la prueba
Se pesan 100 g del suelo problema y del suelo control, y se colocan en el
contenedor de seis cámaras, alternando el suelo control y el suelo contaminado en
diferentes concentraciones.

Nota:
Para controlar variables como % de materia orgánica y % de humedad todas las
muestras serán mezcladas con suelo control en una relación 1:3 y medidos en
volumen de 350 ml.

Posteriormente se depositan 10 lombrices en la cámara central. La migración de la

lombriz es lenta, por lo que, si después de 10 min no se observa migración, se
acerca una lámpara para disminuir el tiempo de espera y acelerar el movimiento
hacia los compartimentos, cuidando de no dañar a la lombriz. Cada contenedor
tendrá cuando menos cuatro réplicas.
Para evitar que las lombrices escapen, los contenedores deben ser cubiertos con
tela de organza y papel aluminio perforado con pequeños orificios, lo cual facilitará
la circulación de oxígeno dentro del contenedor y evitará la pérdida excesiva de
humedad. Los contenedores deben ser colocados en un lugar donde la luz sea
mínima y la temperatura no exceda los 25 °C (Hund y Wiechering, 2001).

33
Al término de 48 h, las paredes de las cámaras son tapadas con una placa
divisoria con dimensiones de 12 cm de altura, 8.3 cm de ancho y espesor de 0.5
mm (figura 2.7) para evitar el movimiento de la lombriz hacia las cámaras vecinas.
El suelo y los organismos de cada cámara deberán ser sacados para registrar el
número de lombrices en cada una de ellas, así como para evaluar su movimiento
ante los estímulos de tacto y registrar su peso al final de la prueba.

Cálculos

Si es una prueba de concentraciones múltiples, que tienen cuatro o más

concentraciones y un contenedor por cada concentración (alternando suelo limpio
y contaminado), la evasión se determina aplicando la siguiente fórmula a cada
réplica (ISO, 2008; De Silva y Van Gesten, 2009):

E= C - P / L x 100

Donde E = evasión (%)

C = número de lombrices en el control
P = número de lombrices en el suelo problema
L = número total de lombrices expuestas

Para evaluar si el suelo analizado es un hábitat adecuado para las lombrices, se

evalúan los siguientes criterios:

Si el 50 % de los organismos se encuentran en el suelo contaminado o tratado, se

considera que no muestran preferencia por ningún tipo de suelo y que dicho suelo
es un hábitat adecuado.

Por su parte, si el porcentaje de lombrices en el suelo contaminado es del 20%, se

considera que el suelo tiene efecto sobre los organismos y, por lo tanto, que es
tóxico o de baja calidad (Hund et al., 2003; Hund et al., 2005; Ricardo et al., 2010).

Preparen una presentación (15 minutos por equipo) en la que muestren los
resultados del experimento, recalcando si los suelos utilizados presentaban
toxicidad para los organismos usados.

Preparen un reporte de la práctica por equipo.

Cuestionario.

34
1. Menciona las características de los ensayos para toxicidad aguda, subcrónica y
crónica.

2. ¿Qué es un bioensayo?

3. Menciona algunas aplicaciones de los bioensayos.

35
Bibliografía

36
  VIABILIDAD

Ensayo de toxicidad aguda

Principio de la prueba

Los bioensayos con lombrices son ampliamente reconocidos como prueba para
evaluar la toxicidad de suelos contaminados (Dorn et al., 1998; Wilson et al.,
2002).
La lombriz más utilizada ha sido Eisenia en sus especies foetida y andrei, las
cuales pertenecen a la familia Lumbricidae. Estas especies de lombrices son
exógenas en México, pero de amplia distribución, fácil manejo y cultivo (Fragoso,
2002). Su principal característica morfológica es la presencia de segmentos
externos e internos en su cuerpo, son hermafroditas y cuando son adultas se
observa una protuberancia epidérmica denominada clitelo, en el que se forman los
capullos en los cuales son depositados los huevos (Santamaría, 1996). Esta
especie se desarrolla bien en pH de 5 a 7, a temperaturas de 20 a 28 ºC (Kaplan
et al., 1980).

Este ensayo incluye dos clases de pruebas toxicológicas: 1) prueba por contacto
con papel filtro y 2) prueba con suelo artificial y muestras de suelo contaminado.
La prueba por contacto en papel filtro puede ser utilizada como preliminar para
determinar las concentraciones correspondientes a las que se tiene que llevar a
cabo la prueba con suelo, siendo esta última más detallada. La prueba de contacto
es fácil de realizar y da resultados reproducibles. El suelo artificial y el suelo
contaminado son representativos de la exposición de la lombriz al compuesto
analizado.
El presente ensayo se basa en lo descrito en la guía 207 de la OECD para la
evaluación de sustancias (OCDE, 1984) y la publicación 96-327 del Departamento
de Ecología del Estado de Washington (WSDE, 1996), así como en las
experiencias obtenidas a nivel laboratorio (Cuevas et al., 2006). La prueba por
contacto en papel filtro involucra la exposición de las lombrices a sustancias
prueba sobre un papel filtro húmedo con la finalidad de identificar el potencial del
compuesto tóxico presente en el suelo. Esta prueba tiene una duración de 48 a 72
horas. El uso de suelo artificial involucra colocar las lombrices en un suelo artificial
Aplicando una serie de concentraciones de la sustancia prueba.
Cuando se desea evaluar la toxicidad del suelo contaminado de un sitio en estudio
o de un suelo restaurado, la prueba se puede realizar directamente con éste; la
mortalidad de las lombrices es evaluada a los 7 y a los 14 días. Para la prueba de
contacto la sustancia problema se expresa en mg/cm2, mientras que para suelo
artificial y muestras de suelo contaminado se expresa en mg/kg (base seca). Para
que una prueba sea considerada como válida, la mortalidad en el control no debe
exceder el 10% al final del período de exposición. Asimismo, es recomendable el
uso de un control positivo con un compuesto de referencia como 2-
cloroacetamida, para asegurarse que las condiciones utilizadas en la prueba

37
fueron adecuadas y no presenta ningún cambio significativo. Este ensayo se ha
realizado utilizando como medio de prueba suelo artificial, suelo control y suelo
contaminado y como sustancias problema a los hidrocarburos totales de petróleo
(TPH), benzo[a]pireno y pireno.

Material

Frascos de vidrio de 0.5 L o 1 L; frascos de vidrio (diámetro de 4.5 cm y altura de 7

cm); pipetas volumétricas clase A de 1 a 100 mL; pipetas serológicas de 1 a 10 mL
graduadas; micropipeta de 200 a 1000 μL; termómetro; espátula de acero
inoxidable; pinzas; guantes; papel filtro y malla 2 a 2.36 mm.

Equipo

Potenciómetro; balanza analítica con capacidad para pesar lombrices de 0.1 g;b
Balanza con capacidad para pesar muestras de suelo de 1.0 g; baño o cuarto con
control de temperatura 20 ± 2 ºC con intensidad luminosa de 400 a 800
lux y base de agitación o vórtex.

Reactivos y soluciones

Todos los reactivos utilizados deben tener al menos 99% de pureza. Para la
preparación de soluciones se emplea agua destilada. Soluciones amortiguadoras
para pH 4, 7 y 10; 2-cloroacetamida (99% pureza) y agua destilada o desionizada
tipo II.

Suelo artificial

El suelo artificial tiene una composición de: 10% musgo (materia orgánica), 20%
arcilla y 70% arena. Se utiliza CaCO3 para ajustar el pH a 7.0 ± 0.5

Muestra de suelo

Se necesitan cuando menos 1100g de suelo, ya que se prepara un mínimo de 4

réplicas de 200 a 250g de suelo contaminado. Los 100 a 200 g del remanente se
utilizan para realizar las determinaciones de pH, humedad y concentración del
compuesto; pero si se requiere caracterizar la muestra es necesaria la recolección
de mayor cantidad de suelo. Los recipientes deben ser llenados en su totalidad. Si
el análisis no se realiza de inmediato, las muestras deben ser selladas,
empacadas y almacenadas a 4 ºC en la oscuridad, para minimizar la pérdida de

38
compuestos volátiles. De preferencia, la evaluación de la toxicidad se debe
realizar en un lapso de 24 horas; de no ser posible se debe procurar hacerlo en un
plazo no mayor a 14 días, ya que la toxicidad pudiera no ser representativa por
degradación o pérdida del contaminante.

Organismos de prueba

Se utilizan lombrices adultas de al menos 2 meses de edad (cliteladas) del mismo

cultivo y la misma especie. Estos organismos pueden desarrollarse en diferentes
residuos animales, especialmente en estiércol de caballo, aunque puede
prepararse una mezcla 50:50 de estiércol y residuos vegetales. El Ph debe
mantenerse alrededor de 7 ± 0.5 y la conductividad debe ser menor de 6.0
miliSiemens. Para asegurar una buena producción de lombrices se debe tener 20
kg de residuos por 1 kg de lombrices.

Control del cultivo

El control con 2 cloroacetamida (control positivo) sirve como una referencia para
determinar la sensibilidad del organismo. Por lo que cada vez que haya un cultivo
nuevo, se debe realizar este control. Esta parte de la prueba debe llevarse a cabo
previo a la exposición de la lombriz a la sustancia de prueba. Para el control
positivo se requieren cuando menos tres concentraciones diferentes con
cloroacetamida. Se sugiere utilizar las siguientes concentraciones: 19.25, 38.5 y
77.0 mg/kg de compuesto tóxico de referencia (WSDE, 1996).

Cálculos

A continuación, se presentan los cálculos para determinar la cantidad a preparar

de una solución patrón de 2-cloroacetamida a adicionar a 600 g de suelo artificial
(200g c/u). Usando la concentración de 38.5 mg/kg.

T=W*F*C

donde:
T = Cantidad de compuesto tóxico de referencia a adicionar (mg)
W= Peso de la muestra (g)
F = Factor de conversión (1kg/1000g)
C = Concentración del compuesto tóxico de referencia (mg/kg)

Ejemplo:

W = 600 g, C = 38.5 mg/kg

39
T = (600 g) (1kg/1000g) (38.5 mg/kg) = 23.1 mg
En este caso, 23.1 mg es lo que se necesita para 600 g de suelo, pero es
necesario preparar una solución patrón usualmente de 22.5 mg de 2-
cloroacetamida/mL de agua (se puede utilizar cualquier concentración, tratando de
evitar residuos). Si se utiliza la solución patrón propuesta 22.5mg/mL (pesar 4.5 g
y disolver en 200 mL de agua), realizar el siguiente

cálculo:
V= R
S

Donde:
V = volumen de la solución patrón a adicionar (mL)
R = cantidad del compuesto de referencia a adicionar (mg)
S = concentración de la solución patrón (mg/mL)

Ejemplo:
R = 23.1 mg, S = 22.5mg/mL
V = (23.1 mg)/(22.5 mg/mL) = 1.03 mL

Se debe recordar que es necesario hidratar el suelo en 45%, lo que equivale a

adicionar 270 mL de agua. Si se considera que la 2-cloroacetamida de la solución
patrón está disuelta en agua entonces se tendría 270 -1.03 = 269 mL de agua por
adicionar. Los 269 mL de agua y 1.03 mL de la solución patrón se mezclan en un
matraz agitando y se adicionan a los 600 g de suelo. Se mide también el pH y la
humedad.

Preparación de las muestras de suelo

Determinación de humedad
Se calcula la humedad inicial para adicionar el agua de hidratación necesaria.Para
determinar la humedad se toma una alícuota de 25 g de la muestra de suelo, se
coloca en una cápsula de porcelana, previamente preparada a peso constante, y
se pesa. Se seca a 103-105 ºC durante 24 horas y posteriormente se coloca en un
desecador para enfriar. Una vez fría se pesa. La diferencia de pesos nos da el
peso seco final (WSDE, 1996).

Opcionalmente, se puede utilizar una balanza del tipo de Kern MB-3 concapacidad
de 50 g para determinar humedad, para lo cual se utiliza 1 g de suelo y 10 minutos
más tarde se tiene el resultado en por ciento. Para determinar la humedad del
suelo se utiliza la siguiente ecuación:

HS [ (A-B)/C-(A-B) ]*100

40
donde:
HS = humedad de la muestra en %
A = peso inicial de la muestra + cápsula (g)
B = peso seco final de la muestra + cápsula (g)
C = peso de la alícuota inicial (g)

Ejemplo:
A = 77.168 g, B = 76.448 g, C = 25.078 g
HS = (77.168-76.063)/[25.024-(77.168-76.063)]*100
HS = 4.61%

Hidratación de la muestra de suelo

Las muestras se pueden hidratar de 35 a 45%, correspondiente al peso del suelo

utilizado en la prueba (WSDE, 1996). Para ello se utiliza la siguiente fórmula:

HA = T-HS

donde:

HA = hidratación necesaria (%)

T = humedad que se quiere obtener (%)
HS = humedad del suelo (%)

Ejemplo
T = 45%, HS = 4.6%
HA = 45% - 4.6% = 40.4%
[ ]*100

Para determinar la cantidad de agua a adicionar se utiliza la siguiente

Fórmula:

V= [ ] W * HA *F
100

Donde:
V = cantidad de agua a adicionar (mL)
W = peso de la muestra (g)
HA = hidratación necesaria (%)
F = factor de conversión (1 mL/1g)

Ejemplo:

41
HA = 40.4%, W = 250 g
V = (250 g * 40.4%/100)*(1 mL/1g) = 101 mL

Procedimiento de la prueba

Prueba de contacto en papel filtro preliminar a la prueba de 14 días. Para esta

prueba se deben lavar los contenedores de vidrio (diámetro de 4.5cm y altura de 7
cm) con agua caliente y detergente, se deben enjuagar y dejar secar. Cortar papel
filtro con 4 cm de ancho por 15 cm de longitud según el frasco y depositarlo en él,
no debe exceder del borde del frasco. Se debe realizar una prueba de humedad
con papel filtro, para lo cual se preparan cuando menos 5 viales con diferentes
cantidades de agua (1 a 5.5mL) y se deposita una lombriz en cada uno de ellos.
La cantidad de agua a adicionar, previo a la prueba, será la correspondiente a la
mínima cantidad de agua en donde la mortalidad corresponda a 0. La sustancia
problema se disuelve en agua o en un disolvente orgánico (acetona o
diclorometano) para dar una concentración conocida. Se deposita 1 mL de esta
solución problema en el papel filtro (con micropipeta), cuidando que se distribuya
homogéneamente, y se seca por rotación del frasco con papel filtro (figura 14.1).

Los controles son: papel filtro con agua deionizada o destilada y papel filtro
impregnado del disolvente seleccionado y secado. Después de secado el papel
filtro, se adiciona en cada vial de 1 a 5.5 mL de agua deionizada o destilada (de
acuerdo a los resultados de humedad del papel filtro explicado previamente), cada
vial es tapado con tela (organza) y con papel aluminio que se ha perforado para
obtener orificios que permitan preservar la humedad y facilitar el intercambio de
aire.

Figura 14.1. Secuencia general de la prueba con papel filtro con lombriz de tierra

1 2 3 4 5 6

1. Papel filtro Frasco

2. Lavado y seco
3. Adicionar solvente con el compuesto a probar
4. Secar con campana Adicionar agua destilada o desionizada
5. Depositar la lombriz lavada,
6. Secada y pesada

42
Ejemplo:
Concentraciones a utilizar:

Cantidad aplicada Concentración de la

al papel filtro solución aplicada
(mg/cm2) (g/mL)

1.0 7x10-2
0.1 7x10-3
0.01 7x10-4
0.001 7x10-5
0.0001 7x10-6

En este ejemplo 70 mg /70cm2 = 1.0 mg/ cm2, el área depende del tamaño del
papel y del frasco, al igual que la concentración. Las concentraciones a emplear
no deben ser menos de cinco. Para cada tratamiento o nivel de concentración se
preparan 10 réplicas. Una lombriz se coloca en cada frasco, depositándola sobre
el papel filtro húmedo. Antes de ser colocadas en los viales, las lombrices son
depositadas por tres horas en papel filtro humedecido, con la finalidad de vaciar
sus intestinos; después son lavadas y secadas. Los viales son colocados en forma
horizontal.

Prueba con suelo contaminado y suelo artificial

Se determina la humedad del suelo contaminado, se pesan 250 g y se depositan

en un frasco de vidrio, ajustando la humedad; se preparan un total de 4 réplicas.
La duración de la prueba es de 14 días, realizando una evaluación a los 7 días. La
temperatura debe mantenerse a 20 ± 2º C, con luz continua, con la finalidad de
asegurarse que las lombrices se encuentran en todas partes del medio.
La mortalidad se evalúa después de 7 días, por vaciamiento del medio en un
recipiente de vidrio, separando las lombrices y observando sus reacciones a los
estímulos mecánicos: Posteriormente, se vuelven a depositar en su contenedor
hasta su evaluación final a los 14 días. Para cuantificar la mortalidad se analiza
cada contenedor, contándose las lombrices. Por ejemplo: en el contenedor de la
concentración 1, réplica 1, se depositan 10 lombrices al inicio de la prueba, si al
final se cuentan 5 lombrices, se anota el resultado; a continuación, se cuentan las
4 réplicas siguientes y para calcular CL50 se utiliza el siguiente software:
www.igv.kvl.dk/download/software. Al término de la prueba se determina la
humedad y el pH.

Control

43
El control puede consistir en suelo no contaminado de la misma textura que la
muestra, al que se ajusta la humedad de la misma forma en que se procedió para
la muestra. También se puede utilizar como control suelo artificial, previo ajuste de
humedad y pH. En cualquiera de los dos casos se colocan 4 réplicas, cada una de
250 g. Se adicionan 10 lombrices libres de alimento, para lo cual 3 horas antes se
colocan en un contenedor de vidrio cubierto con papel filtro humedecido con agua
destilada o desionizada. Las lombrices se lavan, se secan y pesan. Al igual que a
la muestra, a los controles también se les determina la humedad y el pH al finalizar
la prueba.

Suelo artificial

La OECD (1984) describe una prueba con suelo artificial de la misma composición
que la proporcionada en el listado de reactivos y soluciones. Éste puede ser
utilizado para suelos muy arcillosos en los que el movimiento de la lombriz se
dificulte por la textura del suelo. En este caso se utiliza el extracto del suelo
contaminado. Como controles se tienen, además del suelo humedecido, un suelo
al que se le ha adicionado el disolvente utilizado en la extracción (acetona,
diclorometano, etc.) con la finalidad de corroborar el efecto del disolvente sobre el
organismo prueba.

Prueba de toxicidad directa

La determinación denominada directa se puede utilizar para suelos contaminados

y aquellos que se encuentran sujetos a bioremediación, para lo cual se pesan
200g de suelo problema, se ajusta con 10% de tierra de hoja y 15% de arena de
río. Se ajusta la humedad y el pH de la manera descrita anteriormente
(previamente se ha determinado humedad y pH). Se colocan cuando menos 5
contenedores de vidrio, depositando en cada uno de ellos 10 lombrices cliteladas,
con el intestino limpio, lavadas, secadas y pesadas. Las lombrices se dejan a 20 ±
2 ºC (también pueden dejarse a una temperatura de 24 ± 2 ºC, sin que se observe
efecto por la temperatura). El control puede ser suelo artificial sin contaminante o
suelo cercano al sitio de recolección de la muestra, que no contenga el
contaminante. Se revisa al día 7 y al día 14, las lombrices se sacan, cuentan,
lavan, secan y pesan.

Expresión de resultados

Los datos de concentración/mortalidad se utilizan para calcular la concentración

letal media o CL50, la cual se puede determinar por el método Probit o Trimmed-
Spearman, según sea el caso. Para ello, se puede utilizar el software
proporcionado por la USEPA.

44
 Reporte de la prueba

En el reporte del ensayo debe incluirse la siguiente información:

 Los datos del compuesto que se probó

 Las características del organismo de prueba, incluyendo la edad,
condiciones
 de cultivo, fuente de alimento, número de lombrices utilizadas por réplica
 Las condiciones de la prueba, así como cualquier variación de las
condiciones de la misma.
 La preparación del medio. Esto es, si hay alguna variación en la forma de
preparación del suelo artificial o de la muestra de suelo contaminado, así
como si existe variación en la cantidad de suelo
 Los resultados del peso promedio de los organismos al inicio y final de
la prueba. Así como una descripción de cambios físicos o patológicos
observados en los organismos

Figura 14.2. Diagrama de flujo del ensayo de toxicidad aguda con

Eisenia andrei

Prueba en papel filtro

(48-72 horas)

Suelo (14
días) Extracción de la
Sustancia problema

Suelo Suelo artificial

contaminado 4 réplicas por
4 réplicas por concentración
concentración + + 10 lombrices en c/u

Control: suelo sin

Controles:
contaminante + agua
1) Suelo artificial + agua
destilada o deionizada;
destilada o deionizada
también se puede
2) Suelo artificial +
utilizar suelo artificial
disolvente utilizado
4 réplicas + 10 lombrices
Los valores de humedad y pH del 4 réplicas
suelo + 10 al
y control, lombrices
inicio y
final de la Prueba. El
en c/u
método usado para calcular la CL50, incluyendo los datos y resultados de la
prueba. Los valores de mortalidad en el control y en las muestras tratadas con la
sustancia de prueba. La concentración más alta que no causa mortalidad y la
concentración más baja que ocasiona 100% de mortalidad.

Tabla 14.1.

45
Condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad aguda

Duración del bioensayo 14 días Temperatura 20 ± 2 ºC

Temperatura 20 ± 2 ºC
Fotoperíodo 24 horas, usando luz ambiental (400
luxes)
Contenedores Frascos de vidrio
Cantidad requerida de muestra de 1000 g
suelo
Cantidad requerida por réplica 200 – 250 g
Humedad del suelo 35 – 45 %
Organismo prueba Eisenia andrei
Edad del organismo > 2 meses (clitelada)
Número de organismos por réplica 10
Número de réplicas 4
pH del suelo 5 – 9, no realizar la prueba si el rango
no es
aceptable
Régimen de alimentación No alimentar durante la prueba
Respuesta a medir Supervivencia, alteraciones
morfológicas
Control positivo 2-cloroacetamida
Control negativo Suelo artificial o suelo blanco no
contaminado

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Manual de Prácticas para el Curso de

Toxicología I
Primera edición 2009

© Universidad de Guanajuato
Lascurain de Retana No. 5
C.P. 36000
Guanajuato, Gto., México

Impreso en México

ISBN

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48
Manual de Prácticas para el Curso de
Toxicología I

de: Rosa María García Nieto

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