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INDICE DE CONTENIDOS
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GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
INMUNOLOGÍA BÁSICA
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Los días de trabajo práctico en laboratorio, consulte con su docente dónde y
en qué horario debe concurrir. Es obligatorio el uso de guardapolvo o ambo.
REGULARES: Parasitología
Fisiología
Microbiología
SISTEMA DE EVALUACIÓN
Los alumnos serán evaluados a través de:
a) El desempeño en los trabajos prácticos.
b) La aprobación de los informes de laboratorio.
c) La aprobación de los dos parciales obligatorios.
Examen recuperatorio: Se podrá recuperar uno solo de los dos parciales, en un parcial
recuperatorio en el que se aplicará la misma metodología y tipo de ejercicio correspondiente al
respectivo examen parcial.
Los parciales serán escritos, a desarrollar, y podrán consistir en: Preguntas de respuesta breve.
Preguntas a completar con una palabra clave. Preguntas de justificación (V-F) Situaciones
problemáticas a resolver. Planteo de experimentos, con interpretación de gráficos de
resultados.
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CONDICIONES PARA QUEDAR EN CONDICIÓN DE ASISTENCIA CUMPLIDA
Haber cumplido con el 75% de asistencia a los teórico-prácticos.
Aprobar todos los informes (de carácter grupal) correspondientes a los trabajos
prácticos de laboratorio.
REQUISITOS PARA RENDIR EL EXAMEN FINAL
BIBLIOGRAFÍA FUNDAMENTAL
TIZARD I. 2009. Inmunología Veterinaria. Editorial Harcourt 8va. Ed. Grade de España
SA. 592PP.
Material de las clases teóricas y Guía de Trabajos Prácticos. Cátedra de Inmunología. 2017.
Disponible en cartelera web de la FCV-UBA.
DAY MJ. , SCHULTZ RD. 2011. Veterinary Immunology: principles and practice. 1er ed. Manson
Publishing Ltd.
CALLAHAN GN, YATES RM. 2014. Basic Veterinary Immunology. 1er ed. University Press
of Colorado. USA.
BIBLIOGRAFÍA AMPLIATORIA
FAINBOIM L, GEFFNER J. 2011. Introducción a la Inmunología Humana. 6ta ed. Editorial Médica
Panamericana.
ABBAS A, LICHTMAN A, PILLAI S. 2008. Inmunología Celular y Molecular. 6ta. ed. Editorial
Elsevier.
DAY MJ. 2008.Clinical Immunology of the Dog and Cat 2da. ed., Editorial Blackwell.
MURPHY K., TRAVERS P., WALPORT M. 2009. Inmunobiología de Janeway., 7ma. ed., Editorial
Mc Graw Hill.
REGUEIRO GONZALEZ J., LOPEZ LARREA C., GONZALEZ RODRIGUEZ S., MARTINEZ NAVES
E. 2010. Inmunología: Biología y Patología del Sistema Inmunitario. 4ta. ed., Editorial Panamericana.
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PROGRAMA ANALÍTICO
Unidad 1- Mecanismos de defensa
Unidad 2- Inmunoquímica
Antígenos (Ags)
o Conceptos de Antigenicidad e Inmunogenicidad.
o Estructura físico-química de los Ags. Haptenos, Carriers.
o Concepto y tipos de determinantes antigénicos: conformacionales (continuos y
discontinuos), secuenciales.
o Tipos de Antígenos: propios (de órgano; de grupos sanguíneos; de género H-Y)
y extraños (de patógenos, de tumores, de transplantes).
o Antígenos timo-dependientes y timo-independientes.
Anticuerpos (Acs)
o Inmunoglobulinas (Igs) de membrana y secretadas.
o Estructura físico-química: cadenas pesadas y livianas, dominios constantes y variables.
o Características de las Igs en las diferentes especies domésticas y de producción:
particularidades en equinos, aves y camélidos.
o La Ig como antígeno: isotipo, alotipo e idiotipo.
o Clases y subclases de Igs. Distribución en el organismo. Transporte trans-placentario.
Incidencia de los diferentes tipos de placentación en el pasaje de Igs de la madre al feto
en las especies domésticas. Receptor Fc del Recién Nacido (FcRn)
o Resultado de la unión del Ag-Ac: Neutralización de virus y toxinas, inhibición de la
adhesión de bacterias. Otras funciones biológicas de las diferentes clases de Igs:
Opsonización. Activación de la vía clásica del Complemento. Citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos (ADCC).
Moléculas de histocompatibilidad
o Moléculas de histocompatibilidad clase I, clase II y clase III: Estructura. Localización.
Función.
o Complejo mayor de histocompatibilidad: nomeclatura y herencia. Mapa genético en las
especies domésticas y de producción.
o Moléculas de histocompatibilidad no clásicas
Colaboración celular
o Activación de los LT, Interleuquinas.
o Influencia del antígeno y el microambiente en la cooperación celular: Perfiles Th1, Th 2,
Th9, Th17, Th3
o Colaboración T-B: Activación del LB y producción de Igs: Switch isotípico, maduración
de la afinidad.
o Colaboración T-T: Citotoxicidad ejercidas por los LT citotóxicos.
o Colaboración T-Macrófagos: Macrófagos activados.
o Memoria inmune.
Unidad 5
Alteraciones del Sistema inmune
Hipersensibilidad tipo I
o Inmunopatogenia: Alergia y atopía en los animales domésticos.
o Shock anafiláctico: Órganos de choque en las diferentes especies.
o Diagnóstico.
Hipersensibilidad tipo I
o Inmunopatogenia: Daños mediados por anticuerpos en enfermedades autoinmunes.
Reacciones alogeneicas
o Anemia hemolítica del recién nacido en equinos, cerdos y felinos. Reacciones post-
transfusionales.
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o Diagnóstico. Determinación de grupos sanguíneos y pruebas de compatibilidad entre
potenciales donantes y receptor.
Hipersensibilidad tipo III
o Inmunopatogenia: Daños mediados por complejos inmunes en enfermedades
autoinmunes y en enfermedades infecciosas crónicas. Enfermedad del suero.
o Diagnóstico
Hipersensibilidad tipo IV
o Bases celulares de la hipersensibilidad retardada.
o Granuloma tuberculoso. Dermatitis por pulgas en caninos. Hipersensibilidad de
contacto.
o Diagnóstico.
Hipersensibilidad tipo V
o Anticuerpos anti-receptores: Anticuerpos agonistas y antagonistas. Fenómenos de
autoinmunidad. Concepto. Ejemplos de enfermedades autoinmunes específicas de
órgano y sistémicas. Inmunodeficiencias.
o Inmunodeficiencias primarias y secundarias. Diagnóstico.
Inmunoprofilaxis
Inmunoprofilaxis pasiva
o Natural: Pasaje de Igs de la madre a la cría. Incidencia de los diferentes tipos de
placentación en el pasaje de Igs de la madre al feto en las especies domésticas.
Composición en Igs de calostro y leche. Importancia de la ingestión de calostro.
o Artificial: administración de sueros hiperinmunes.
o Elaboración de sueros hiperinmunes. Indicaciones de uso. Ventajas y desventajas de
su aplicación. Uso de aves en la elaboración de sueros hiperinmunes.
Inmunoprofilaxis activa
o Ventajas y desventajas de su aplicación.
Tipos de vacunas.
Vacunas atenuadas.
o Vacunas convencionales: Características y ejemplos.
o Vacunas de nueva generación: Vacunas a vectores recombinantes, Vacunas
deleteadas.
Vacunas inactivadas.
o Vacunas convencionales: Características y ejemplos.
o Vacunas de nueva generación: vacunas a subunidades. vacunas a péptidos
sintéticos. Vacunas a péptidos recombinantes.
o Vacunas a DNA desnudo.
Concepto de vacunas que permiten diferenciar animales vacunados de infectados
(DIVA)
Metodología de elaboración de vacunas.
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o Proceso de producción de inmunógenos a escala industrial.
o Requisitos de bioseguridad.
o Métodos de inactivación.
o Métodos de atenuación.
o Formulación de vacunas: Uso de adyuvantes
o Controles requeridos durante las diferentes etapas de producción
o Aprobación de vacunas por organismos oficiales.
o Controles de inocuidad, esterilidad y potencia.
o Otros controles.
Administración de vacunas
o Vías y esquemas de inmunización.
o Vacunas mixtas, vacunas polivalentes.
o Consideraciones para establecer esquemas de vacunación en las diferentes
especies animales.
o Fracasos de la vacunación.
o Reacciones adversas a la vacunación.
Unidad 8
Unidad 9
Técnicas inmunológicas de diagnóstico
Técnicas de detección primaria de la interacción Ag-Ac
o Técnicas inmunoenzimáticas: ELISA. Inmunoblot. Inmunohistoquímica.
o Inmunofluorescencia. Citometría de flujo.
o Radioinmunoensayo.
o Inmunocromatografia
Diagnóstico de hipersensibilidades.
o Evaluación del resultado de la inmunoprofilaxis.
o Diagnóstico de enfermedades infecciosas
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CONCEPTOS BÁSICOS DE BIOSEGURIDAD
Grupo 2. Aquéllos que pueden causar una enfermedad en el hombre y pueden suponer un
peligro para las personas expuestas, siendo poco probable que se propaguen a la población.
Generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos:
Actinomyces sp, Bacteroides sp, Enterobacterias, Salmonella sp, Shigella sp, Candida sp,
Cryptococcus neoformans.
Grupo 4. Agentes que, causan enfermedades graves en el hombre, y suponen un serio peligro
para otras personas expuestas, con muchas probabilidades de que se propague a la población.
Generalmente no se cuenta con profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos:
Virus de Lassa, Machupo y Ébola.
Niveles de contención
El término "contención" se emplea para describir los métodos que hacen seguro el manejo de
materiales infecciosos en el laboratorio. El propósito de la contención es reducir al mínimo la
exposición del personal de los laboratorios, de otras personas y del entorno, a agentes
potencialmente peligrosos.
a) Nivel de contención 1:
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Saccharomyces cerevisiae, etc.).También, es el que se utiliza en la industria de la alimentación
para la elaboración de quesos, cerveza, embutidos, etc.
b) Nivel de contención 2:
Es el obligatorio para agentes del grupo 2 como algunos que, perteneciendo a la propia
flora habitual del hombre, son capaces de originar patologías infecciosas humanas de gravedad
moderada o limitada. Deben ser manipulados por personal especializado (veterinarios y otros
profesionales de la salud) y son los que con más frecuencia se estudian en el Laboratorio de
Diagnóstico Veterinario (Ascaris sp, Estafilococos, Salmonella, Toxoplasma,
Clostridium sp, etc.).
c) Nivel de contención 3:
d) Nivel de contención 4:
Es el nivel requerido cuando se trabaja con un agente patógeno exótico o no, que
produce una enfermedad infectocontagiosa, de alta mortalidad y para la cual no existe
tratamiento o el tratamiento existente es poco fiable. Normalmente son microorganismos de
dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Agentes del grupo 4 ó animales de experimentación
infectados con ellos: ejemplos de este nivel son los arenavirus como el que produce la fiebre de
Lassa y el virus Machupo, virus Ebola, etc. Además, deben incluirse en este nivel de
contención los microorganismos propios del grupo 3 que adquieran propiedades patógenas que
los eleven al grupo 4. Un ejemplo sería Mycobacterium bovis multirresistente que puede causar
fallecimiento por fracaso terapéutico.
Sólo si se conocen las posibles enfermedades a las que se expone el veterinario, su forma de
transmisión y exposición, se podrán realizar las acciones correspondientes a fin de prevenirlas.
Durante la revisación clínica se contaminan las manos del profesional, por lo tanto deben
lavarse entre la atención de pacientes.
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Asimismo, debe desinfectarse la camilla y todos los elementos empleados durante la consulta.
Es común la toma de muestras (sangre, orina, materia fecal, biopsias, etc.) para efectuar
análisis complementarios que ayuden al diagnóstico o al seguimiento de un caso clínico. Estas
muestras, en general, son analizadas por laboratorios de diagnóstico externos a la clínica, por
lo tanto debe evitarse la diseminación de patógenos durante su traslado:
Los tubos de sangre deben estar correctamente tapados e identificados (nunca se debe
enviar la sangre dentro de la jeringa de extracción).
Las muestras de orina (para urinálisis o bacteriología), tejidos u órganos (para
diagnóstico histopatológico, conservados en formol al 10%), deben ser conservadas en frascos
de tapa a rosca cerrados herméticamente.
Las muestras de órganos remitidas en frío para diagnóstico microbiológico deben
colocarse en bolsas plásticas cerradas. Nunca se deben colocar muestras de diferentes
órganos en la misma bolsa.
Todas las muestras deben remitirse dentro de cajas, preferiblemente de telgopor (con
refrigerantes, cuando se requiera) y adecuadamente precintadas para evitar su apertura
accidental.
Las muestras deben ir acompañadas de un protocolo de remisión de muestras (ver más
adelante), de manera que el destinatario esté advertido de los riesgos potenciales antes de
tomar contacto con la muestra.
Residuos patogénicos
Los residuos patogénicos deben tratarse de manera especial hasta su destino final. Esta
actividad está reglamentada en la ley Nº 154 de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Todos
los residuos patogénicos deben colocarse en bolsas rojas de más de 120 micrones de espesor.
Estas bolsas se colocan en cajas de cartón o en recipientes plásticos debidamente sellados e
identificados. El tratamiento de estos residuos es llevado a cabo por empresas especializadas
que cuentan con la infraestructura necesaria para esterilizarlos sin riesgo de eliminar patógenos
al medio ambiente. En general los residuos patológicos son incinerados en hornos a
temperaturas mayores a los 1200ºC que dejan como residuo vapor de agua y cenizas inocuas
(hornos pirolíticos).
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Bioseguridad en la producción agropecuaria
Son varias las zoonosis que el profesional puede adquirir durante prácticas rutinarias en la
producción agropecuaria, por lo tanto también deben tomarse precauciones.
Usar mameluco descartable o de algodón resistente al lavado intenso y botas de goma.
Revisar el estado de la manga, andenes, cepos, puertas laterales, etc.
Usar guantes para realizar tacto rectal o necropsias.
Comprobar el buen funcionamiento de las jeringas metálicas, verificar que no
tengan pérdidas cuando se inyecta. Desinfectarlas y lavarlas muy bien luego del uso.
No reutilizar las jeringas descartables, eliminar las jeringas en una bolsa roja y las
agujas en un frasco con tapa con hendidura.
Luego del trabajo en la manga, desinfectar las botas y colocar la ropa en una bolsa
plástica y luego lavarla, separada de otras, en agua a 90ºC.
Enterrar o incinerar los cadáveres de animales sospechosos
de haber muerto por enfermedades infecciosas graves o zoonóticas.
La práctica dependerá de la enfermedad de la que se sospeche.
Remitir las muestras al laboratorio siguiendo las indicaciones descriptas anteriormente.
Bioseguridad en el laboratorio de diagnóstico
Frente a un caso clínico, el médico interviniente deberá conocer cuáles son las pruebas
laboratoriales inmunológicas más adecuadas para corroborar o desestimar su diagnóstico
presuntivo y también para la correcta toma de muestra a enviar.
La calidad y utilidad de los análisis de laboratorio depende en gran medida tanto de la correcta
toma de muestra según la prueba diagnóstica a solicitar como de su conservación y envío al
laboratorio. Los errores cometidos en este paso repercutirán en el resultado de la prueba,
dando errores diagnósticos que tendrán consecuencias negativas para la resolución del cuadro
clínico.
Las reglas básicas para la toma y remisión de muestras de sangre o suero al laboratorio
son las siguientes:
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- Informar al laboratorio la/las pruebas inmunológicas a solicitar ya que algunas de ellas
requieren de un tratamiento especial de envío, de una muestra control para ser procesada
paralelamente a la muestra del paciente, como por ejemplo la prueba de estimulación de
linfocitos, etc.
- Cuando la muestra debe ser extraída con anticoagulante, previo a la extracción debe ser
consultado el laboratorista, quien indicará el más conveniente para las pruebas que deba
realizar. Los más usados son los quelantes del Ca++, como el citrato de Na, o la solución de
Alsever, que tiene glucosa para proteger a los eritrocitos y citrato de Na como
anticoagulante.
- Para la correcta toma de muestra y para evitar los posibles riesgos de envío, es
aconsejable que la misma sea obtenida en el laboratorio, particularmente en las pruebas de
evaluación celular o de los factores del complemento.
- Las pruebas que requieren células viables hacen necesario que la sangre se transporte en
frio hasta el laboratorio y dentro de las 3 a 4 horas de extracción. Si esto no es posible, se
debe enviar la muestra acondicionada del modo más conveniente para cada caso y lo más
rápidamente posible.
- La toma de muestra de sangre se obtiene por punción venosa de sangre periférica (con o
sin anticoagulante dependiendo de la prueba a solicitar), en condiciones de asepsia,
utilizando jeringas y agujas descartables.
- Extraer la cantidad mínima necesaria para las pruebas. Esto es crítico cuando se deben
hacer sangrías sucesivas a pequeños animales.
- El uso de elementos sucios o mojados (excepto con anticoagulantes), el manipulación
brusca y la formación de espuma cuando se trasvasa la muestra de la jeringa al tubo de
ensayos pueden producir hemólisis. La predisposición a sufrir hemólisis en la muestra de
sangre depende de la especies y en orden creciente es: equinos, bovinos, ovinos, aves,
felinos y caninos.
- Las muestras se envían al laboratorio dentro de contenedores (frascos o recipientes con
tapa a rosca) con la correcta etiqueta identificatoria escrita con letra clara y legible. En ella
constan los datos de: nº de historia clínica, especie, sexo, edad, utilización del animal,
diagnóstico presuntivo, material y conservante enviado, además de los datos del
profesional interviniente. Si las muestras provienen de una necropsia, se describe los
puntos más relevantes de los hallazgos. Se adjunta, como ejemplo, el protocolo de envío de
muestras utilizado en el servicio que brinda el área de Inmunología de la Facultad.
- Hasta el envío o procesamiento de las muestras, éstas deben ser conservadas en
heladeras (4ºC) en cajas de telgopor con refrigerantes y abundante papel a fin de prolongar
el efecto refrigerante y protegen a los envases de rupturas. La caja de transporte debe
tener una etiqueta con el rótulo RIESGO BIOLÓGICO.
Extendidos de Sangre:
Los extendidos de sangre se realizan inmediatamente después de extraída la muestra, junto al
animal, utilizando las últimas gotas de sangre que quedan en la aguja. Preparados
correctamente estos extendidos son estables aún si no están fijados. Pueden teñirse hasta
varios días después si se conservan secos y protegidos de la humedad. Envueltos en papeles
limpios y colocados en un recipiente hermético, pueden remitirse por correo. El método de
fijación puede variar según la tinción, pero en general se pueden fijar con calor o con distintos
alcoholes. Los extendidos fijados son de estabilidad casi indefinida.
Extracción de Suero:
Para extraer el suero de la sangre, se la deja coagular en un tubo de ensayo. Una vez formado
el coágulo, se lo desprende del vidrio con la ayuda de una aguja o varilla. Para obtener la mayor
cantidad posible de suero, se coloca el tubo en una estufa a 37°C durante 30 minutos a 1 hora y con el
fin de obtener la mayor retracción del coágulo, se lo deja en heladera (4°C) durante una noche.
A partir de aquí, se puede centrifugar el tubo (a 3000 r.p.m. durante 30 minutos) o extraer
directamente el suero (sobrenadante) con una pipeta. En ambos casos se debe operar
cuidadosamente tratando de evitar tocar el coágulo para no producir hemólisis.
El suero puede mantenerse a 4°C durante 48-72 horas. Si hay riesgo de contaminación,
conviene agregarle una pizca de azida sódica (este conservante puede ser tóxico por lo que es
conveniente consultar al profesional del laboratorio antes de hacerlo). Si no se va a usar dentro
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de ese lapso, el suero debe congelarse a temperaturas inferiores a -20°C (lo óptimo es a -70°C). Si bien
a estas temperaturas prácticamente no hay degradación proteica, sí la hay durante cada ciclo
de congelación – descongelación.
Para los exámenes serológicos de diagnóstico específico se puede emplear un suero que ha
sido conservado congelado, no así para exámenes electroforéticos donde es conveniente evitar
el congelamiento. En el rótulo de la muestra debe especificarse si la muestra ha sido
congelada, conservada a 4ºC y cualquier otra observación que se considere necesario.
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EJEMPLO DE PROTOCOLO DE ENVÍO DE MUESTRAS
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PRUEBAS INMUNOLÓGICAS
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TÉCNICAS DE EVALUACIÓN DE INMUNIDAD INNATA
Fagocitosis
Los mecanismos que tienen las células para incorporar en su interior fluidos, solutos y
partículas desde el medio externo son: pinocitosis, endocitosis mediada por receptores
específicos y fagocitosis. Mediante el proceso de pinocitosis ingresan a las células fluidos y
solutos. Por medio de la endocitosis mediada por receptores específicos, entran a la célula
macromoléculas, virus y otras partículas de pequeño tamaño. Ambos mecanismos son
independientes de la polimerización de la actina. En cambio, la fagocitosis, que es la ingestión
de partículas de mayor tamaño, ocurre por mecanismos dependientes de la actina. Las células
más eficientes para fagocitar partículas son los monocitos, macrófagos y neutrófilos a los que
se los denomina fagocitos profesionales.
Los polimorfonucleares neutrófilos se originan en la médula ósea (MO) y son
continuamente enviados a la circulación. Viven pocos días y tan pronto como los
microorganismos invaden los tejidos dejan el torrente circulatorio, se adhieren al endotelio
celular activado y se mueven a través de la barrera endotelial hacia el sitio de la lesión. Son
considerados como la primera barrera de defensa frente a los microorganismos, ya que son los
primeros en llegar al sitio de invasión atraídos por los factores quimiotácticos que se generan
en el foco inflamatorio. Los factores quimiotácticos son principalmente componentes
bacterianos, productos de degradación de las bacterias, mediadores de la inflamación y otras
moléculas endógenas liberadas por el daño tisular.
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3- incremento del Ca2+ citoplasmático
4- incremento de la actividad de la proteinquinasa C (PKC)
Mecanismo de fagocitosis
La interacción receptor-ligando entre el fagocito y la partícula a ingerir activa la
maquinaria de la fase de ingestión para lo cual es necesario la modificación de las proteínas
involucradas en el remodelamiento de la membrana y el citoesqueleto: actina, miosina y
proteínas de unión a la actina. Los microfilamentos de actina en la porción de citoplasma que
subyace al sitio de unión comienzan a polimerizarse. Esta polimerización lleva a que la
membrana envuelva la partícula, formándose seudópodos (extensiones de la membrana en
forma de dedos). Estos rodean a la partícula y finalmente se fusionan formando la vesícula
fagocítica o fagosoma primario. Mientras esto ocurre, los gránulos citoplasmáticos se funden
con la membrana del fagosoma y se produce un fagolisosoma. En el interior del fagolisosoma,
la partícula ingerida queda expuesta a sistemas microbicidas que pueden clasificarse como
oxígeno independientes y oxígeno dependientes.
Moléculas efectoras independientes del oxígeno
Estas sustancias están localizadas en los lisosomas o gránulos citoplasmáticos, se
liberan dentro de los fagolisosomas y no requieren la producción de oxidantes para ser
activas. Pueden actuar tanto intra como extracelularmente en el caso de que la partícula
sea muy grande para ser ingerida generando lesión en el tejido subyacente y efecto
conocido como fagocitosis frustrada. Estos agentes incluyen proteasas y enzimas
hidrolíticas como fosfolipasas, glicosidasas y lisozima; la fagocitina y las leucinas que
actúan sobre las membranas bacterianas; la lactoferrina fija el hierro privando a las
bacterias de este elemento indispensable para su crecimiento y la lisozima, que cliva los
mucopéptidos de la pared celular bacteriana.
Moléculas efectoras dependientes del oxígeno
Durante el proceso de fagocitosis las células pueden incrementar en 50 veces la
cantidad de oxígeno consumido y metabolizar grandes cantidades de glucosa. Debido al
gran consumo de oxígeno, este fenómeno se denomina estallido respiratorio. El
consumo de oxígeno es utilizado para la producción de metabolitos tóxicos como anión
superóxido, peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilo, oxígeno singulete, hipocloritos y
cloraminas.
Se ha confirmado experimentalmente la relación entre la citoxicidad de los macrófagos y la
producción aumentada de los reactivos del nitrógeno e intermediarios del oxígeno. En los
sobrenadantes de cultivo de macrófagos activados por citoquinas se encuentran niveles
elevados de nitritos inorgánicos (NO2-) y de anión superóxido (O2-), ambos asociados con la
actividad antimicrobiana. Las vías oxidativas productoras de estos dos metabolitos son
diferentes y no comparten precursores comunes.
El siguiente esquema muestra las vías de producción de moléculas efectoras,
señalando algunos de los estímulos necesarios para su activación, a saber: interferón gamma
(IFN), lipopolisacárido de E. coli (LPS) y forbomiristil acetato (PMA).
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L-
arginina oxígeno
Otros reactivos
nitrito intermediarios y peróxido de hidrógeno
-
(NO2 ) moléculas efectoras (H2O2)
El óxido nítrico (NO) posee una vida media de pocos segundos, interactúa con una serie
de moléculas dando como resultado citotoxicidad. En presencia de oxígeno y agua, el NO
genera otros reactivos intermedios del nitrógeno y por último se descompone para formar NO2 -
y NO3-.
b) Quimiotaxis y adherencia
Técnica de migración y adherencia a través de una membrana: para ello se utiliza la
cámara de Boyden, que posee una membrana microporosa con poros de 3 micrones de
diámetro. Se colocan las células en un compartimento y los factores quimiotácticos en otro y se
lleva a incubar. La capacidad de las células para migrar hacia el estímulo se evalúa tiñendo las
que quedan retenidas en la membrana. Los resultados se comparan con los obtenidos con
células del mismo animal (sin estímulo) y con PMN de un individuo normal utilizado como
control de valor de animal sano.
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b) Activación:
La activación de las células fagocíticas se señaliza a través de eventos de fosforilación de las
proteínas celulares involucradas en la trasmisión de la señal de activación. La posibilidad de
identificar proteínas fosforiladas con el uso de anticuerpos monoclonales que detectan, por ej.,
tirosinas fosforiladas, permite identificar el primer paso de activación de las células fagocíticas.
Para esta evaluación es necesario recurrir a las técnicas de PAGE e Inmunoblot a partir de las
células activadas (ver capítulos correspondientes en la presente guía).
La identificación de la migración de proteínas del citoplasma al núcleo celular para regular la
trascripción de moléculas relacionadas con la inflamación y fagocitosis constituye también una
manera de identificar los primeros eventos de activación celular. Como ejemplos de estos
sistemas podemos incluir la activación del factor NF-kB que involucra la degradación del factor
inhibidor de kB citoplasmático (proteína IkB) y el incremento de sus componentes p50 y p65 en
el núcleo celular. Esta modificación en los componentes proteicos celulares también se estudia
utilizando anticuerpos marcados y mediante el uso de técnicas de SDS-PAGE e inmunoblot.
c) Ingestión:
La etapa de ingestión se puede evaluar utilizando como partícula a ingerir diferentes
microorganismos. La utilización de levaduras como por ejemplo el Saccharomyces cerevisiae,
se fundamenta en el tamaño de las partículas (fácil de ver en el microscopio óptico) y cuya
estructura de manosas son fácilmente detectados por los PRRs. La capacidad de ingestión de
las células provenientes del individuo a evaluar se determina realizando una cuantificación del
número de levaduras ingeridas en un determinado tiempo de incubación.
El recuento de las partículas o microorganismos ingeridos puede ser realizado mediante
diversas metodologías:
- Tinción de las células con las coloraciones de Wright o Giemsa; de esta manera se
diferencian las células que han ingerido de las que no. Se deben contar por lo menos 200
células y determinar cuántas partículas por citoplasma celular es considerado como ingestión
positiva. Los métodos microscópicos requieren una laboriosa observación para determinar la
asociación de los microorganismos a las células y discriminar si estos microorganismos fueron
ingeridos o no.
-Marcación de las partículas a ingerir con fluoresceína; se utiliza la marcación de la partícula
con isotiocianato de fluoresceína u otro colorante fluorescente previo a la incubación con las
células, luego se elimina por lavado las partículas no ingeridas y se detectan las células que
ingirieron por microscopia de fluorescencia o citometría de flujo (ver capítulo correspondiente
en la presente guía). La utilización de la coloración combinada diferencial con bromuro de etidio
permite identificar las bacterias extracelulares (fluorescen en color rojo-naranja) de aquéllas
internalizadas (permanecen de color verde correspondiente a la fluoresceína).
-Marcación con sustancias radiactivas de componentes bacterianos como proteínas, DNA y/o
RNA. Las bacterias se marcan durante su fase de crecimiento con aminoácidos o
nucleótidos marcados con 14C, 35S amino 3H nucleótidos: tritio y luego del experimento de
ingestión en el que se incuban las células y las bacterias durante un periodo de tiempo
generalmente entre 30 a 60 minutos a 37ºC se lavan las células para eliminar las bacterias no
ingeridas. Se utiliza un detector de radioactividad como un contador de centelleo líquido o
sólido para cuantificar la radiactividad retenida por el sedimento celular. Esta actividad se
relaciona con el número de partículas radiactivas ingeridas y por lo tanto con la capacidad de
ingestión de las células fagocíticas del individuo evaluado.
d) Digestión:
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-
NBT (color amarillo y soluble) + O2 ----------› Formazán (color azul e insoluble) + O2
Para esta prueba se pueden utilizar PMN provenientes de sangre entera, estimulados
con levaduras o forbolmiristilacetato (PMA) Luego de una incubación de 30 minutos a 37C, la
formación del formazán puede ser evaluada cuali o cuantitativamente.
Los cristales del colorante pueden identificarse intracelularmente por microscopía y realizar un
recuento del número de células que sufrieron estallido respiratorio, o bien los cristales pueden
ser solubilizados utilizando N,N dimetilformamida y realizar la cuantificación por
espectrofotometría obteniendo los datos en densidad óptica.
Quimioluminiscencia
El estallido respiratorio en los PMN normales está asociado con la generación de
energía luminosa conocida como quimioluminiscencia, la cual es dependiente de la producción
del oxígeno singulete (1O2). Este oxígeno se produce cuando uno de los electrones
desapareados de oxígeno es elevado a una órbita superior con la inversión del spin. La luz se
emite cuando el electrón retorna a su nivel inicial y se mide como quimioluminiscencia. El
oxígeno singulete es producido por la reacción entre H2O2 y el hipoclorito:
- 1 -
H2O2 + OCl ----------› O2 + H2O + Cl
La luz emitida se mide por la detección fluorométrica apropiada. La sensibilidad del ensayo se
incrementa por el uso de hidracina cíclica, 5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalazinedione (luminol)
que actúan como substrato para el 1O2. La luminiscencia se mide en un contador de centelleo
usando el canal del 3H o a través de placa radiográfica.
Evaluación de la producción de Óxido Nítrico (NO)
Puede realizarse mediante la evaluación de la producción de NO o de la enzima que cataliza su
producción (iNOS o NOS2)
- Producción del NO
Los niveles de producción de NO en los cultivos de macrófagos estimulados con
bacterias o productos bacterianos nos permiten evaluar el grado de activación de estas células.
La vida media del NO es de segundos, por esto, la evaluación de su producción se realiza
mediante la cuantificación de nitritos en el medio de cultivo.
La síntesis de nitritos comienza 4 a 6 horas luego del tratamiento con IFN y LPS en un cultivo
de macrófagos y es lineal por 72 horas. La identificación de este metabolito en los
sobrenadantes de cultivo se realiza mediante la utilización del reactivo de Greiss (sulfanilamida
y naftiletilendiamina) que se colorea cuando reacciona con nitritos y nos permite relacionar la
coloración con los niveles de NO producidos en un cultivo. El cambio de color se evalúa por
espectrofotometría a 550 nm. Se realiza una curva patrón utilizando diferentes concentraciones
conocidas de NaNO2 y reactivo de Greiss. De esta curva se obtiene la relación que permite
estimar la producción de NO in vitro.
Los análogos de la L-arginina,como la NG-monomethyl-L-arginina (L-NMA), poseen acción
inhibitoria de la producción de nitritos a partir del NO por la vía de la iNOS por un fenómeno
competitivo. La utilización de estas moléculas permite confirmar que el aumento de producción
de nitritos en un cultivo está dado por este mecanismo.
25
transforman en su hábitat. En el caso de bacterias extracelulares u otros patógenos este
mecanismo es capaz de contener o eliminar al agente agresor constituyéndose en un
mecanismo efector bacteriostático o bactericida. Estos mecanismos pueden ser evaluados
utilizando técnicas de cultivo bacteriano y determinando el número de unidades formadoras de
colonias sobrevivientes al proceso de fagocitosis.
Algunas de las deficiencias descriptas como entidades clínicas en las especies domésticas son:
Bibliografía
26
2. Margni R.A. Inmunología e Inmunoquímica. Fundamentos. Editorial Médica
Panamericana S A 1996.
3. Baehner RL, Nathan DG. Quantitative nitroblue tetrazolium test in chronic granulomatous
disease. N.Engl. J. Méd. 278: 971-976. 1968.
4. Abramson JS, Wheeler JG. The Neutrophil. Oxford University Press. 1992.
5. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocitosis in macrophages. Ann Rev Immunol
1999. 17:593-623.
COMPLEMENTO
El sistema de complemento (C) está formado por unas 30 proteínas del suero que
interaccionan entre sí de modo regulado formando una cascada enzimática que permite una
amplificación de la respuesta inmune humoral.
Las principales consecuencias de la activación del C son:
1. Lisis del microorganismo o célula diana
2. Opsonización, con la consiguiente mejora de la fagocitosis y destrucción del
microorganismo fagocitado
3. Quimiotaxis sobre los fagocitos
4. Acción anafilotóxica,
5. Eliminación de inmunocomplejos circulantes
6. Regulación de la función de la inmunidad adaptativa (LB)
Las tres rutas comparten las últimas fases, consistentes en el ensamblaje del denominado
complejo de ataque a la membrana (CAM).
Por otra parte, el complemento puede ser utilizado como un indicador de que la reacción Ag-Ac
tuvo lugar, ya sea para identificar antígenos como anticuerpos. Por ejemplo, la lisis por
complemento se puede utilizar para tipificar grupos sanguíneos en animales utilizando
anticuerpos específicos. Mientras que, la técnica de fijación de complemento se emplea para
detectar Acs específicos para el diagnóstico de algunas enfermedades infecciosas, utilizando
un Ag de referencia.
Esto tiene una explicación clara si se analiza la curva que resulta de graficar los porcentajes de
hemólisis en función de la cantidad de complemento agregado al sistema, puede observarse
que dicho gráfico no corresponde a una recta, sino a una curva sigmoidea que presenta una
marcada pendiente en la zona que va del 25 al 75% de hemólisis. Los extremos de la curva,
que corresponden a la zona que va del 0 al 25% y del 75 al 100 % de hemólisis, presentan una
pendiente significativamente menor o nula.
ANTICUERPOS
29
Anticuerpos monoclonales
Kohler y Milstein desarrollaron una técnica que permitió la producción de anticuerpos
producidos a partir de un solo clon de linfocitos B. El fundamento de la técnica consiste en
fusionar linfocitos B provenientes de un ratón inmunizado con el antígeno de interés con líneas
celulares provenientes de mielomas no secretante murino. Los híbridos resultantes presentan
dos propiedades: secretan anticuerpos específicos hacia el antígeno empleado en la
inmunización, proliferan indefinidamente y pueden ser mantenidos como líneas celulares.
Esta tecnología ha revolucionado el empleo de los anticuerpos, tanto en lo referido al enfoque
diagnóstico como terapéutico. Es importante destacar que mediante esta metodología se
pueden obtener anticuerpos homogéneos (ya que proviene de un único clon de linfocitos B) y
de muy alta especificidad, lo que facilita la puesta a punto y repetitividad de las técnicas
inmunológicas que los aplican.
Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas secretadas por un único clon de linfocitos
B y por lo tanto, con idéntica secuencia aminoacídica en sus regiones variables. Poseen una
especificidad única, con una afinidad hacia el antígeno determinada e invariable y presentan un
único isotipo. En estas características residen las principales ventajas que presentan los
anticuerpos monoclonales para su uso en investigación y diagnóstico. Por el contrario, los
anticuerpos policlonales consisten en una mezcla de inmunoglobulinas provenientes de
distintos clones de linfocitos B. A continuación se enumeran las principales diferencias entre
anticuerpos monoclonales y policlonales (Figura 1)
Figura 1: Esquema de producción de anticuerpos policlonales y monoclonales
Anticuerpos monoclonales:
1. Son químicamente homogéneos, poseen una única secuencia de aminoácidos por lo cual
sus propiedades son estables.
2. Son de especificidad definida porque todas las moléculas tienen la misma región
hipervariable.
3. Poseen una única avidez y afinidad.
4. Su estabilidad físico-química depende de cada anticuerpo monoclonal en particular. Pueden
ser sensibles o resistentes a cambios de pH, temperatura, liofilización y a la marcación con
enzimas o isótopos.
5. En general, no poseen reactividad secundaria, o sea, no forman complejos antígeno-
anticuerpo insolubles con antígenos mono o bivalentes. Pueden hacerlo si el antígeno tiene
epitopes repetitivos.
6. Se pueden producir en cantidades ilimitadas.
7. Pueden conservarse las células (clonos) productoras a través de varios años si se las
manipula con cuidado (según técnicas de cultivo celular)
Anticuerpos policlonales:
30
1. Son heterogéneos. Sus propiedades constituyen un promedio de las propiedades de los
distintos anticuerpos constituyentes (del antisuero).
2. Son una mezcla de anticuerpos con especificidades propias para cada epitope del
inmunógeno. Por lo tanto, la probabilidad de reacciones cruzadas con epitopes de otros
antígenos es mayor a la de los anticuerpos monoclonales.
3. Su avidez y afinidad corresponden al conjunto de la mezcla de anticuerpos y varían en
función del momento de la respuesta inmune en que se realizó la determinación. Así, la
afinidad media de los anticuerpos detectada al comienzo de una respuesta inmune será menor
que la detectada a medida que la respuesta inmune avanza. Estos se debe a que a medida que
la respuesta inmune se va desarrollando, se produce la maduración de la afinidad de los
anticuerpos.
4. Son estables como consecuencia de su heterogeneidad, lo que permite que sean más
resistentes frente a distintos cambios físico-químicos.
5. Poseen reactividad secundaria debido a la presencia de múltiples anticuerpos dirigidos
contra distintos epitopes en la molécula antigénica, lo que permite la formación de una red
antígeno-anticuerpo.
6. Se producen en animales inmunizados, por lo tanto, son difíciles de estandarizar.
31
En la tabla 1 se muestran las posibles fuentes de anticuerpos y sus características
Sobrenadante Anticuerpos
de cultivo de bovinos
Monoclonal 1 0.05 > 95%
hibridoma provenientes del
(con 10% de Suero de Feto
Suero Fetal Bovino
Bovino)
Sobrenadante
de cultivo
Monoclonal 0.05 0.05 Ninguno >95%
(sin Suero Fetal)
Líquido ascítico
Anticuerpos de
Murino Monoclonal 1-10 0.9-9 90%
ratón
Fuente: Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988.
pp726.
- Precipitación
Las interacciones de una proteína disuelta en agua ocurren entre las moléculas de proteína-
agua y proteína-proteína. Cuando predominan las interacciones proteína-agua, las proteínas se
hallan en solución; cuando predominan las interacciones proteína-proteína, éstas precipitan.
Cuando a una proteína disuelta en agua le agregamos una sal, se produce una competencia
por la molécula de agua y como la sal es más hidrofílica que la proteína como consecuencia
predominan las interacciones proteína-proteína y se logra la precipitación de la proteína.
La temperatura: Una de las sales más utilizadas para la precipitación de las proteínas en
este caso Inmunoglobulinas o Anticuerpos es el sulfato de amonio. La solución de esta sal
utilizada como reactivo conviene usarla a 4ºC, ya que a mayor temperatura, mayor solubilidad
proteica y como el objetivo es precipitarla a menor temperatura es más favorable la reacción.
Esta relación entre solubilidad y temperatura se cumple dentro del rango de 0 a 40ºC.
La estructura química: factores como: el número y la posición de los grupos polares de dicha
proteína y el peso molecular de la proteína a purificar, deben ser considerados en la selección
del método.
Precipitación salina
La precipitación salina es un método que permite separar las distintas fracciones proteicas
del suero. Las sales más comúnmente utilizadas son el sulfato de amonio y el sulfato de sodio.
La ventaja de trabajar con sulfato de amonio es que no se cristaliza a temperaturas bajas ni a
temperatura ambiente, como lo hace el sulfato de sodio.
32
La concentración de sal a la cual precipitan los anticuerpos varía según la especie. Por
ejemplo, la mayoría de los anticuerpos de conejo precipitan con una solución saturada al 40%,
mientras que los anticuerpos de ratón necesitan entre 40-50%.
Método de Purificación:
-Cromatografía
La característica que distingue a los métodos cromatográficos es la presencia de dos fases
mutuamente no miscibles: una móvil y una estacionaria, que se hallan en contacto.
Una separación óptima entre dos componentes de una muestra se obtiene cuando el
componente que eluye en segundo término es retenido lo suficiente como para impedir su
superposición con el componente que eluyó en primer término.
Es lógico, por lo tanto, que los métodos cromatográficos más comunes para la purificación de
estas moléculas sean:
Fundamentos:
Este tipo de cromatografía utiliza como soporte esferas de gel con poros de diferente
tamaño.
Una columna tendrá dos volúmenes medibles, el volumen externo (Vo), constituido por el
volumen intersticial (el espacio que queda entre las esferas de gel), y el volumen interno (Vi)
correspondiente al volumen de las esferas a los que los solutos y solventes pueden acceder
cuando se introducen dentro de aquéllas, a través de sus poros.
Las moléculas que no puedan acceder al Vi, debido a que su tamaño es mayor al de los poros,
sólo se equilibrarán en el Vo, mientras que las de menor tamaño se equilibrarán en ambos
volúmenes.
Cuando una muestra compleja de proteínas y otros componentes, disuelta en un pequeño
volumen, es aplicada éstas columnas, filtrará a través de la misma: las proteínas de mayor
peso molecular eluirán con el Vo y por lo tanto se obtendrán primero, mientras que las
proteínas de menor tamaño, que pueden acceder al Vi, aparecerán más tardíamente y en un
volumen de elución (Ve) determinado que dependerá de su peso molecular. (Ver esquema).
33
ASPECTOS METODOLÓGICOS:
Fundamentos:
La cromatografía de intercambio iónico trabaja por la unión de biomoléculas con una carga
determinada, a una matriz estacionaria de carga opuesta.
Las biomoléculas se unen a resinas de intercambio iónico cuando tienen carga opuesta a la de
los iones fijos de la resina. Esta unión es de tipo electrostático y reversible. La fuerza puede ser
modificada variando la concentración salina y el pH de la solución buffer utilizada como
eluyente.
La separación de dos o más sustancias se consigue por un mecanismo de adsorción
reversible, que consiste en la fijación inicial y posterior remoción. Si las sustancias fijadas
tienen diferentes propiedades eléctricas, mediante la variación del pH o fuerza iónica del
eluyente se conseguirá que cada una de ellas eluya por separado.
Matrices y solventes:
La matriz puede estar constituida por silicato de aluminio, resinas sintéticas, polisacáridos
como la celulosa o el dextrano, etc. La naturaleza de los grupos cargados es la que determina
el tipo y la fuerza de unión del ión intercambiador.
Los dos tipos de resinas más utilizadas son:
de intercambio catiónico (con matrices con carga negativa) y
de intercambio aniónico (con matrices con carga positiva).
34
La elección correcta de la resina, en especial en lo que se refiere al grupo funcional que le
aporta la carga, dependerá de la carga neta de la sustancia que se desea separar.
En los casos de moléculas anfotéricas como las proteínas, que poseen grupos cargados
positiva y negativamente, su carga neta dependerá del pH del medio. Estas sustancias, según
sea el pH del medio, podrán unirse a resinas aniónicas o catiónicas; en su punto isoeléctrico
(pI), tendrán carga neta cero y no se fijarán a ningún tipo de resina intercambiadora.
Cromatografía de Afinidad
Fundamentos:
La técnica de cromatografía de afinidad es una de las técnicas más utilizadas para la
purificación de proteínas. Consiste en una cromatografía de adsorción la que se fundamenta en
la especificidad de interacciones biológicas como las interacciones antígeno-anticuerpo,
enzima-inhibidor, lectina-hidrato de carbono, etc.
La biomolécula que se quiere purificar (por ejemplo, un anticuerpo) usualmente tiene un sitio de
reconocimiento a través del cual puede interactuar con otra molécula natural o artificial a la que
se llama ligando (por ejemplo, un antígeno).
El ligando es inmovilizado sobre una matriz polimérica y es usado para capturar selectivamente
a la biomolécula que se desea purificar, cuando ésta se encuentra en una mezcla impura.
La biomolécula deseada puede ser eluída del ligando por cambios en las condiciones externas
(pH, fuerza iónica, solventes y temperatura) que desestabilizan la interacción biomolécula–
ligando y permiten que la molécula deseada sea eluída en forma purificada.
Existe una gran diversidad de biomoléculas que pueden purificarse por este método
cromatográfico, entre ellas: antígenos, anticuerpos, enzimas, proteínas unidas a hormonas,
proteínas unidas a vitaminas, receptores, glicoproteínas, lectinas, ARN, ADN, bacterias, virus,
fagos, células y proteínas producidas por ingeniería genética.
La naturaleza de la matriz a la que se fijan los ligandos es muy importante, ya que en las
condiciones experimentales debe ser física y químicamente estable.
Existen numerosas matrices comerciales disponibles en su forma activada o sin activar para
ser utilizadas como soporte para el ligando. La activación de la matriz se realiza para que el
ligando quede inmovilizado en ella a través de una interacción química que produzca una unión
estable entre matriz y ligando.
En general, se utilizan matrices de naturaleza polisacárida, en su mayoría derivados de la
agarosa. Debido a su estructura química, estas matrices tienen la característica de ser casi
inertes, de forma que no producen interacciones inespecíficas. Esto es esencial porque la
cromatografía de afinidad se basa en interacciones específicas.
El ligando idealmente debería tener una afinidad de unión de 10-4 a 10-8 M-1 en solución.
Si la constante de disociación es mayor que 10-8 M-1 esta técnica no puede ser utilizada para la
purificación de estas moléculas pues la unión es muy estable y la separación de la biomolécula del
ligando se hace muy difícil. Estas afinidades muy altas corresponden a la interacción hormona-
receptor para lo cual este método no resulta útil.
Ejemplos:
36
Posibles métodos de elución de la muestra:
Antígenos y anticuerpos están unidos por una variedad de fuerzas, las cuales incluyen:
Fuerza iónica
Interacciones hidrófobas
Puentes de hidrógeno
Fuerzas de Van Der Waals
Las soluciones de elución pueden poseer diferentes características como alto (NaOH 1M,
Dietilamina 0.05 M pH 11.5) o bajo (Glicina-HCl 0.02M) pH 2.5pH, presencia de calcio o
magnesio, presencia de agentes quelantes como el EDTA, agentes caotrópicos como
guanidinio.
En la Figura se esquematiza la metodología de purificación de proteínas por columna de
afinidad.
37
Figura: Esquema de purificación de una proteína a través de una columna de afinidad
Matriz
+
Ligando
+ Impurezas
Muestra
38
Tabla: Métodos de aislamiento y purificación de anticuerpos
Aplicaciones Ventajas Desventajas
Precipitaciones y cromatografía de intercambio iónico (DEAE)
Aislamiento y concentración de
Fácil. Bajo costo. Útil para Rinde anticuerpos impuros.
Anticuerpos
grandes volúmenes. Ácido
o
e
t
2- Fraccionamiento de anticuerpos
La papaína cliva la molécula de IgG en tres fragmentos de semejante peso molecular (45 a
50kDa). Dos de estos fragmentos, idénticos entre sí, son denominados Fab (fragmento de
unión al Ag). En ellos reside la capacidad de reconocimiento antigénico, expresando una única
valencia. El tercer fragmento, denominado Fc (fragmento cristalizable) no participa en el
reconocimiento antigénico.
La tripsina actúa de manera similar a la papaína y permite obtener los mismos fragmentos.
39
La pepsina, por su parte, cliva el fragmento Fc en piezas pequeñas y deja el resto de la
molécula intacta. Esta porción intacta, denominada (Fab’)2, se halla constituida por dos
fragmentos Fab unidos a través de los puentes disulfuro intercatenarios. Presenta, por lo tanto,
dos sitios de reconocimiento antigénico por lo que su valencia es dos.
Un tercer fragmento de anticuerpos, el Fv, es de gran utilidad para los estudios de afinidad de
antígeno y anticuerpo. Este fragmento está compuesto por las porciones variables de las
cadenas liviana y pesada, con lo cual posee un sólo sitio de combinación al antígeno. Tanto el
fragmento Fab como el fragmento (Fab’)2 están estabilizados por los puentes disulfuro
intercatenarios. Dado que el fragmento Fv no posee estas uniones, debe estabilizarse
agregando un péptido de unión o “linker”. El fragmento linker es una pequeña secuencia que
une el extremo amino terminal de la cadena liviana con el extremo carboxiterminal de la cadena
pesada. La estructura que se obtiene recibe el nombre de “single chain fracción variable” (scFv)
que se puede sintetizar mediante técnicas de ADN recombinante.
Papaina Pepsina
Bibliografía:
1. Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor
Laboratory. 1988. pp726.
2. Affinity Chromatography: principles and methods. Pharmacia fine chemicals.
3. Cuatrecasas, P; Wilchek, M and Anfinsen, C. B. Selective enzyme purification by affinity
Chromatography. 1968. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 61: 636-643.
4. Fainboim, L; Geffner, J. Introducción a la Inmunología Humana. 6ta Edic. 2011.
5. Gagnon, P. Purification tools for monoclonal antibodies.1996. Validated Biosystems. Inc.249
pp.
40
6. Margni, R. A. Inmunología e Inmunopatología. Fundamentos. Editorial panamericana
Buenos Aires quinta edición. 1996. 976pp
7. Roitt, I. Inmunología. Fundamentos”, 11va. ed., Editorial Panamericana. 2008.
8. Subramanian, A. Immunoaffinity Chromatography. 2000 Methods in Molecular Biology
Vol 147: 95-104.
9. Kent, U.M. Purification of Antibodies Using Affinity Chromatography. 1999. Methods in
Molecular Biology Vol 115: 23-28.
10. Wilchek, M and chailen, I. An Overview of Affinity Chromatography. 2000. Methods in
Molecular Biology. Vols 147: 1-6.
*Albúminas: es la proteína más abundante del suero, varía según la especie entre un 35 y 50%
de las proteínas totales. Es sintetizada por el hígado y su principal función es el mantenimiento
del volumen (equilibrio osmótico). Además es transportadora de sustancias poco solubles en
agua (ej: ácidos grasos libres).
*Globulinas: la fracción globulínica de las proteínas plasmáticas es una mezcla muy compleja
que se agrupa en tres fracciones con funciones diferentes: alfa, beta y gamma. Según sean la
especie animal y las condiciones de la corrida electroforética (matriz sólida, buffer, condiciones
eléctricas, tiempo, etc), las fracciones alfa y beta pueden subdividirse en dos sub-fracciones
(alfa-1, alfa-2 y beta-1 y beta-2, respectivamente).
Proteínas componentes de las distintas fracciones del suero identificadas por electroforesis
41
2-globulinas:
Transferrina
Fibrinógeno
Factores del complemento
Proteína C reactiva
Amiloide A
Ferritina
Pueden aparecer trazas de IgM, IgA e IgG en especies domesticas
3- globulinas:
IgM
IgA
IgE en concentraciones ínfimas
IgG
ELECTROFORESIS
El punto isoeléctrico (PI) de una molécula (en este caso una proteína) es el pH en el
cual la carga neta de la misma es cero. Si se mantiene a este pH, la proteína no migra
cuando se la somete a la acción de un campo eléctrico. El PI es inherente a la estructura
primaria de la proteína, pues depende de cuáles aminoácidos forman la cadena
polipeptídica. Por lo tanto, a determinado pH, distintas proteínas con distinto punto
isoeléctrico tendrán distinta carga neta, lo que permitirá separarlas e identificarlas por
medios electroforéticos.
J. Tiselius fue el primero que utilizó la electroforesis en 1937 para separar los
componentes del suero. Existen dos métodos generales para separación de proteínas por
electroforesis:
Electroforesis libre o de frente móvil, que se realiza en una fase líquida, y
Electroforesis de zona, que utiliza una matriz sólida o soporte, como el papel de filtro,
membranas de acetato de celulosa o geles de almidón, poliacrilamida, agar o agarosa.
Estos materiales son porosos e hidratados y permiten retener las proteínas.
42
De ambas, la electroforesis de zona es la que tiene mayor aplicación en el laboratorio clínico
por su sencillez y mayor capacidad de resolución. Para la separación de las proteínas del
suero, por ejemplo, se utiliza frecuentemente acetato de celulosa como matriz y se escoge
un pH alcalino, en el que todas las proteínas están cargadas negativamente y migran hacia
el polo positivo (ánodo). En estas condiciones, la albúmina es la que migra más
rápidamente hacia el polo positivo, seguida por: alfa, beta y gammaglobulinas.
Técnica
Se describe a continuación un ejemplo de corrida electroforética. Se debe tener en
cuenta las condiciones de corrida, los reactivos que se utilizan y los pasos metodológicos
son variables de acuerdo a diferentes factores (especie animal, nivel de automatización del
equipo, etc).
La muestra se siembra sobre un soporte de agar o acetato de celulosa y se somete a
corriente eléctrica. El paso de la corriente provoca la migración de las diferentes proteínas
que conforman la muestra, pero cada una de ellas lo hará a una velocidad diferente según
su punto isoeléctrico.
El pH del buffer utilizado es de 8,6, a este pH, todas las proteínas del suero están
cargadas negativamente. La más cargada es la albúmina, con un PI mucho menor que el pH
del medio (PI de la albúmina: 4,4); las menos cargadas, por el contrario, son las
gammaglobulinas, con un PI mucho más cercano al pH del buffer (PI de las gamaglobulinas:
6,8-7,2). Por lo tanto, las albúminas son las que migran más rápido hacia el polo positivo,
seguidas por las alfa, beta y por último las gammaglobulinas.
A esta migración se opone el efecto electroendosmótico, que consiste en un
movimiento en sentido opuesto a la corriente eléctrica que detiene parcialmente la corrida de
las proteínas. Este es causado porque la mayoría de los soportes no son neutros. Debido a
su carga fuertemente negativa, las albúminas logran superar ampliamente el efecto,
mientras que las gammaglobulinas, cuya carga negativa es menor, no pueden superarlo tan
fácilmente y quedan detenidas en el punto de siembra o incluso son arrastradas hacia el
polo negativo.
Materiales
Tiras de acetato de celulosa para electroforesis
Solución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8,4-8,6)
Cuba de electroforesis
Fuente de poder
Solución colorante de proteínas
Solución decolorante
Solución transparentizante
Densitómetro Integrador
Procedimiento
Es fundamental que todo el material que se vaya a utilizar esté bien limpio y seco.
1. Se sumergen las tiras en la solución amortiguadora (buffer) durante por lo menos 10
minutos.
2. Se elimina el exceso de líquido entre dos hojas de papel de filtro.
3. Se extienden las tiras sobre un portaobjetos teniendo la precaución de que no queden
burbujas entre el vidrio y la tira. Las tiras de acetato de celulosa tienen dos caras
diferentes: una es la superficie penetrable donde deben sembrarse las muestras, la otra
no es penetrable de tal manera que no debe ser utilizada para la siembra. Para
diferenciarlas, las tiras tienen uno de sus ángulos recortado, este debe quedar ubicado
en el ángulo inferior derecho.
4. Se coloca el portaobjetos sobre el puente de la cuba de electroforesis.
5. Se siembran las muestras con el sembrador. Los sembradores están estandarizados
para sembrar siempre el mismo volumen de muestra. Los equipos generalmente traen
3 sembradores de diferente volumen. Según el ancho de sembrador que se utilice, se
43
podrán sembrar 1, 2 ó 3 muestras por tira. Una de las muestras se tiñe con azul de
bromofenol, el cual se asocia a las moléculas de prealbúmina y permite identificar el
frente de corrida. La cuba se llena hasta una altura determinada con el buffer de
corrida, se conecta a la fuente de poder y se aplica una corriente constante de 200
voltios durante 30 minutos. El grado de separación obtenido para las proteínas de una
muestra dada, varía según sea la especie animal de la muestra y depende del tiempo
de corrida y del voltaje aplicado. Por lo tanto, estos parámetros deben estandarizarse
previamente según las necesidades de cada caso en particular. (Por ejemplo, una
muestra de suero equino se corre a 200 voltios durante 25 minutos; una muestra de
suero canino se corre a 180 voltios durante 20 minutos).
6. Una vez finalizada la corrida, se desconecta la cuba de la fuente de poder y se
procede a colorear las tiras, sumergiéndolas durante 5 minutos en la solución
colorante de proteínas.
7. Se procede luego a la decoloración de la tira, sumergiendo las tiras en solución
decolorante. El objetivo del decolorante es barrer con el colorante que no se unió a las
proteínas. Este procedimiento se repite hasta que las tiras queden blancas (es
conveniente ir renovando la solución decolorante durante este procedimiento).
8. Las tiras se sumergen en metanol puro durante 30 segundos y luego en la solución
transparentizante durante 1 minuto.
9. Las tiras se colocan sobre un portaobjetos con el ángulo cortado de la tira ubicado en
el ángulo inferior izquierdo (en forma invertida a como lo sembramos), de esta forma la
cara sembrada queda boca abajo, mirando el vidrio. No deben quedar burbujas entre
el vidrio y la tira.
10. Los portaobjetos se colocan en una estufa a 80 ºC hasta su transparentización total.
La tira de acetato debe quedar completamente transparente para que pueda
efectuarse la medición por densitometría.
11. Las diferentes bandas de proteínas separadas a partir de la muestra original sobre la
tira de acetato de celulosa, teñidas y transparentizadas, son leídas en un
densitómetro. El aparato debe ser previamente calibrado según la longitud de onda
que vamos a utilizar (generalmente 520 nm), el largo de la tira que vamos a medir y la
concentración de proteínas de la que partimos. El densitómetro detecta y registra los
datos de absorción de luz de cada banda de proteína y los transforma en un valor
numérico de concentración y en un gráfico (ver figuras al final del tema)
Aplicaciones de la electroforesis
La electroforesis es un método valioso para el diagnóstico de las alteraciones
en los componentes proteicos del suero (disproteinemias), orina y líquido
cefalorraquídeo.
Mediante esta técnica se puede detectar un aumento, disminución o alteración de las
proteínas (paraproteínemias), como:
Hipogammaglobulinemias: por inmunodeficiencia de tipo humoral
Hipoproteinemias: por pérdida de proteínas por el sistema digestivo
Hipoalbuminemia: por insuficiencia hepática crónica y síndrome de mala digestión-
mala absorción, secuestro de proteínas en cavidad pleural, peritoneal y tejido
subcutáneo, glomerulopatías, quemaduras, etc.
Hiperalbulinemia: por deshidratación etc.
Disminución de la alfaglobulina: por déficit de alfa 1-antitripsina, insuficiencia
hepática severa.
Aumento de beta y/o gammaglobulinas:
1. Policlonal: en inflamaciones crónicas (de origen infeccioso, autoinmune,
neoplásico).
2. Monoclonal: por ejemplo, el mieloma múltiple, en el que se detecta la aparición del
denominado componente monoclonal en la región donde corren las beta o las gamma
globulinas. Éste se manifiesta como una banda homogénea en la corrida
44
electroforética que se traduce a su vez en forma de un pico de base estrecha en el
proteinograma.
45
Ejemplos de patrones de electroforesis
Se observan las corridas electroforéticas (izquierda) y sus respectivos proteinogramas
(derecha).
46
Suero de perro con aumento policlonal
de beta y gammaglobulinas
(leishmaniasis)
Bibliografía
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2. Margni R. A. Inmunología e Inmunohistoquímica Fundamentos. Bs.As.: Editorial médica
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5. Informes del Servicio de Diagnóstico Inmunológico de la Cátedra de Inmunología de la
Facultad de Ciencias Veterinarias de la UBA.
INMUNOHISTOQUIMICA
47
dos anticuerpos es la amplificación de la reacción en cada paso, es decir, por cada
anticuerpo primario que reaccione lo reconocerán dos o más moléculas de
anticuerpos secundarios.
Enzimas utilizadas:
Las enzimas más utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina, que reaccionan
dando distintos colores con los diferentes sustratos según la reacción, lo cual servirá para
detectar distintas uniones antígeno-anticuerpo.
Fijación:
El mayor problema que suelen presentar los fijadores químicos es que pueden impedir
la unión antígeno-anticuerpo, por el enmascaramiento del antígeno debido a cambios
conformacionales que ocurren en el antígeno (epitope). No existe un fijador universal, en todos
los casos hay que realizar distintas pruebas con diferentes fijadores (y diferentes condiciones
de fijación) para cada antígeno y para cada tejido. El fijador más utilizado es el formol
tamponado, (formaldehído al 10 % en fosfato disódico y monobásico) debido a que es más
accesible por costos y es menos agresivo a los tejidos que el formol puro.
49
INMUNOFLUORESCENCIA
Desventajas:
Es necesario tener un microscopio de fluorescencia.
Es difícil la evaluación de detalles básicos.
Las preparaciones tienen vida muy corta debido a la pérdida de color de los
fluorocromos
Se necesita personal muy entrenado para poder determinar entre una reacción positiva
y una impronta negativa, ya que habitualmente las células poseen autofluorescencia,
que puede llevar a error cuando quien efectúa la lectura no tiene experiencia suficiente.
50
Figura 1: Esquema de la prueba de inmunofluorescencia a) directa, b) indirecta.
Fluorocromos
Los anticuerpos específicos pueden marcarse con fluorocromos. Estos colorantes permiten
identificar su presencia cuando son excitados por luz ultravioleta. Para unir los fluorocromos a
un anticuerpo, estos deben cumplir con una serie de requerimientos:
Que el fluorocromo desarrolle suficiente fluorescencia para que la señal emitida sea
visible y no se vea interferida por la autofluorescencia del tejido.
Que tenga un grupo funcional capaz de fijarse a la molécula de anticuerpo.
Que sea soluble en soluciones acuosas, ya que los solventes pueden producir la
desnaturalización de las proteínas durante la unión.
Que no pierdan fluorescencia al unirse con los anticuerpos.
Que no alteren la especificidad ni la actividad de los anticuerpos.
Que al formar los conjugados no pierdan su fluorescencia con la acción de la luz.
Microscopio de fluorescencia
El microscopio de fluorescencia consta de:
- el microscopio óptico
51
- una lámpara de mercurio o halógena que emite luz ultravioleta
- un sistema de filtros:
52
liofilizados, protegidos con resina de poliéster, se pueden conservar varios meses en un
desecador a 0°C sin que pierdan sus antígenos.
Es preferible trabajar con cortes fijados ya que la tinción inmunofluorescente en cortes sin fijar
se acompaña de difusión o pérdida del antígeno.
Se deben usar fijadores que no alteren la estructura antígeno-anticuerpo, los más empleados
son alcohol etílico al 95% entre 4-30°C, alcohol metílico, acetona o formol. Para bacterias es
muy útil la fijación mediante calor. La inclusión en parafina de los tejidos es muy usado y puede
lograr una localización más precisa y una tinción más viva que con cortes en congelación.
ASPECTOS METODOLÓGICOS
Procedimiento recomendado para la tinción por inmunofluorescencia directa:
1) Llevar el portaobjetos que contiene la muestra (células o tejido a analizar) a temperatura
ambiente.
2) Colocar de 10 a 50 µl (dependiendo del tamaño de la muestra) de anticuerpo anti-antígeno
conjugado en el portaobjetos.
3) Incubar en cámara húmeda a 37°C por 30 minutos
4) Lavar el portaobjetos con buffer de lavado (PBS) y luego sumergirlo por 10 minutos en buffer
de lavado (PBS)
5) Secar la parte posterior y los bordes del portaobjetos con una toallita de papel. No deben
secarse las superficies teñidas. No lavar con agua
6) Colocar una gota de líquido de montaje. Cubrir con cubreobjetos y observar en microscopio
de fluorescencia a 100 a 250X. Confirmar a 400X.
Bibliografía
1. Roum. Biotechnol. Lett., Vol. 6, No. 3, 2001, pp. 177.206. Bucharest University, Center
for Research in Enzymology and Biotechnology, Roumanian Society of Biological
Sciences
2. Veterinary Medical Research and Development, 2003 VMRD, Inc. P.O. Box 502,
Pullman, WA 99163, U.S.A.
3. Immunobiology 5th ed. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Schlomchik,
Mark. Garland Publishing c 2001
4. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorophase.html
5. Manual de procedimientos. Instituto Malbrán.
53
CITOMETRÍA DE FLUJO
1-Sistema de fluidos
La zona del citómetro donde las células (o partículas) se juntan con el fluido se la
conoce como cámara de flujo El fluido del citómetro se encuentra a presión y conduce la
muestra a través de la cámara de flujo. Las partículas de la muestra a ser analizadas llegan
separadas y en una corriente de fluido presurizado. El propósito de este sistema es permitir que
el rayo láser atraviese la muestra justo por el centro, incidiendo en UNA célula a la vez.
2-Sistema óptico
Está formando por un sistema de excitación y uno de recolección.
El sistema de excitación consiste en un láser y lentes que se usan para enfocar el rayo láser.
El sistema de recolección consiste en lentes que colectan la luz emitida por la interacción entre
el rayo láser y la partícula y un sistema de espejos y filtros que encausan rangos de ondas
determinados de la luz colectada a detectores ópticos específicos.
Generación de dispersión:
Cuando una partícula es incidida por el rayo láser se produce una desviación de la luz
que dependerá de las propiedades físicas de las partículas, es decir: su tamaño y complejidad
interna. La membrana celular, el núcleo, y cualquier material granular que se encuentre dentro
de la célula, afectan la desviación de la luz. La morfología y la topografía de la superficie celular
también contribuyen a la desviación total de la luz.
La luz desviada hacia adelante (Forward Scattered light: FSC) es proporcional a la superficie o
tamaño celular. FSC es una medida de la luz difractada y es detectada por un fotodiodo en
dirección frontal.
La luz desviada hacia el costado (Side Scattered light: SSC) es proporcional a la granularidad
celular y a la complejidad interna de las células. SSC es, esencialmente, una medida de la luz
refractada que ocurre en cualquier interfase dentro de la célula donde hay un cambio en el
54
índice de refracción. SSC se colecta aproximadamente a 90 grados del rayo láser mediante
lentes colectoras y luego es redireccionada a un detector.
Correlacionando las mediciones de FSC y SSC se pueden diferenciar tipos celulares en una
población heterogénea. La mayoría de las poblaciones leucocitarias pueden diferenciarse
usando FSC y SSC.
Fluorescencia:
Un compuesto fluorescente absorbe energía de cierto rango de longitud de onda que es
característico para ese compuesto. Esta absorción de luz provoca que un electrón de la
sustancia fluorescente alcance un mayor nivel de energía. El electrón así excitado decae en
energía emitiendo el exceso como un fotón. Esta transición de energía se denomina
fluorescencia. Cuanta más energía es consumida en la absorción, más energía es emitida en la
fluorescencia.
- El rango de onda en el cual un compuesto fluorescente puede ser excitado se conoce como
su espectro de absorción.
- El rango de onda emitido por este compuesto es denominado su espectro de emisión.
El láser de argón es comúnmente usado en citometría debido a que su longitud de onda de 488
nm puede excitar más de un fluorocromo. Entonces, se puede usar más de un fluorocromo
simultáneamente, siempre que todos sean excitados a 488nm y que sus picos de emisión se
encuentren lo suficientemente alejados entre sí.
La combinación de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y ficoeritrina (PE) satisfacen este
criterio. La magnitud de la señal detectada es proporcional al número de moléculas de
fluorocromo en la partícula.
En una mezcla de células se pueden usar diferentes fluorocromos conjugados a anticuerpos
monoclonales para distinguir las diferentes subpoblaciones celulares. La marcación de cada
célula junto con los valores de FSC y SSC, pueden ser usados para identificar cada
subpoblación presente en una muestra y los porcentajes relativos de las mismas.
3-Sistema electrónico: recolección de datos.
Las señales de luz se convierten finalmente en señales electrónicas, lo que permite que
los datos puedan guardarse en una computadora.
Pero cómo se define la muestra a tomar?
Umbral:
Se usa para limitar el número de eventos que adquiere un citómetro. El umbral se
establece en un parámetro. Por ejemplo, si el umbral se establece en FSC, sólo serán
registradas las señales generadas por partículas cuyo tamaño sea mayor que el umbral
establecido. Este control se usa para eliminar señales generadas por polvo, restos celulares, o
ruido electrónico en el sistema. En aquellos equipos que tienen más de un láser, se puede
establecer un segundo umbral. En ese caso la señal emitida por la partícula a ser analizada
deberá alcanzar los dos umbrales para ser procesada como un evento.
Los datos se guardan en un formato standard denominado “Flow Cytometry Standard Format”.
Una vez que los datos han sido guardados, pueden ser presentados y graficados de diversas
maneras: como histogramas, gráficos tridimensionales, gráficos de puntos, etc. Para esto
puede usarse software de versión libre on line, como el WinMDI.
55
Determinación de regiones o “Gating”:
Un grupo de datos puede ser definido por un “gate” que es una barrera numérica o
gráfica. Esta barrera se usa para definir las características de las partículas que se analizarán.
Por ejemplo, en una muestra de sangre, el operador puede querer analizar sólo la
población linfocitaria. Basado en la FSC o el tamaño celular la barrera (gate) puede
establecerse en una curva de FSC vs SSC para permitir el análisis de células que tengan sólo
el tamaño de los linfocitos.
Gate 1
Otro ejemplo. De la muestra sólo se desea tomar la población indicada, entonces se establece
una barrera (gate 1) en esa zona y el equipo sólo adquiere las partículas de esa región.
Una vez adquirida la muestra, los datos son guardados en la computadora del citómetro y
pueden ser analizados en cualquier momento y de diversas maneras.
Por ejemplo, un histograma permite analizar el número de eventos que comparten un mismo
parámetro. Los marcadores son usados para especificar el rango de eventos que serán
considerados positivos para un parámetro. Una vez que se ha establecido el primer marcador
sobre el control negativo (M1) se ubica el segundo marcador considerada con niveles de
fluorescencia positiva (M2). (Ver figura 1).
Figura 1
Negativo Positivo
M1 M2
células
Nº de
Fluorescencia
de menor a mayor
Un gráfico de puntos (dot plot) muestra los datos de dos parámetros. Cada punto puede
representar uno o más eventos, de acuerdo a lo establecido por el operador. (Ver figura 2)
Figura 2
57
El marcador de cuadrantes divide un gráfico de dos parámetros en cuatro secciones y permite
distinguir poblaciones negativas, positivas y doble positivas. (Figura 3)
Bibliografía:
1. Roum. Biotechnol. Lett., Vol. 6, No. 3, 2001, pp. 177.206. Bucharest University, Center for
Research in Enzymology and Biotechnology, Roumanian Society of Biological Sciences
2. Veterinary Medical Research and Development, 2003 VMRD, Inc. P.O. Box 502, Pullman,
WA 99163, U.S.A.
3. Immunobiology 5th ed. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Schlomchik,
Mark. Garland Publishing c 2001
4. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorophase.html
5. Manual de procedimientos. Instituto Malbrán.
60
Figura 1
Sangre periférica
Gradiente de Ficoll-Hypaque
Plasma
Halo mononucleares
Ficoll Hypaque
Polimorfonucleares
Eritrocitos
Cultivo
Estimulados
Controles
(SCM + medio de cultivo + estímulo:
(SCM + medio de cultivo) mitógeno o Ag)
Incubación
Cosecha
c.p.m.
61
Se ha desarrollado una variante de la metodología descripta, que utiliza
directamente la sangre entera heparinizada diluida en medio de cultivo como fuente de
linfocitos. En caninos, se ha demostrado que esta metodología es comparable y aún más
reactiva que la técnica clásica descripta. Se postula que tiene la ventaja de reproducir mejor
las condiciones in vivo y evitar la pérdida de células (supoblaciones de L con diferentes
funciones) que conlleva el proceso de purificación en gradiente utilizado en la metodología
convencional.
Célula teñida
con CFSE
62
La cantidad de formazán es proporcional a la actividad de las oxidoreductasas
mitocondriales y por lo tanto, proporcional a la cantidad de células vivas presentes en el
cultivo.
ASPECTOS METODOLÓGICOS
Cuatro horas antes de la finalización del cultivo, se agregan una solución de MTT para
lograr una concentración final de 0.5 mg/ml. Finalizada la reacción, los cristales de
formazán que se forman, se solubilizan con isopropanol acidificado con ClH y se miden por
absorbancia a 570 nm en un lector de microplacas,
El Índice de Estimulación de cada muestra se calcula como la relación entre el promedio de
la densidad óptica (DO) de los cultivos estimulados y el promedio de la DO de los cultivos
no estimulados.
Aplicaciones
cpm 30.000
20.000
10.000
Normal XSCID
63
(Felsburg, J et al. Canine X-linked severe combined immunodeficiency. Veterinary
Immunology and Immunopathology, 69 (1999), 127-135).
Bibliografía
CITOTOXICIDAD
Introducción
La citotoxicidad es un mecanismo efector de las células del sistema inmune que
permite eliminar células infectadas o alteradas del organismo o células de microorganismos
u organismos invasores. Varios tipos celulares, receptores y mecanismos están
involucrados en este mecanismo. Su evaluación permite conocer el nivel de protección
frente a enfermedades infecciosas de origen viral, capacidad de eliminar células alteradas
por procesos tumorales, etc. Hay dos condiciones indispensables para que cualquier
mecanismo citotóxico mediado por células se lleve a cabo:
Mecanismos de Citotoxicidad
64
Mecanismos de citotoxicidad específicos
Mecanismos citotóxicos mediados por linfocitos T: son de gran importancia para la defensa
del individuo contra las infecciones causadas por virus y contra parásitos intracelulares.
Tienen participación, además, en el rechazo de los transplantes y de ciertos tumores.
Células NK:
El sistema inmune presenta poblaciones linfocitarias que tienen la capacidad innata de lisar
cierto tipo de células tumorales y células infectadas por virus. Este fenómeno citotóxico,
descrito alrededor del año 1970, se conoce como citotoxicidad natural killer o actividad NK.
Para que se lleve a cabo no es necesaria sensibilización previa de las células efectoras. La
actividad NK no se ve influida por la exposición previa al antígeno por parte del individuo
del cual provienen estas células.
65
Evaluación de la funcionalidad celular por medio de reacciones de citotoxicidad
mediadas por LT citotóxicos.
Las sustancias radiactivas deben cumplir ciertos requisitos para ser utilizadas:
Deben incorporarse a las células blanco en cantidades compatibles con los
sistemas de microrreacciones.
No deben liberarse al medio espontáneamente.
Su liberación al medio debe tener correlación directa con el efecto lítico producido.
Una vez liberadas al sobrenadante, no deben ser reutilizables en forma significativa
por las células restantes.
El agente radiactivo más utilizado es el Na251CrO4 (dicromato de sodio) que tiene la ventaja
adicional de poner de manifiesto rápidamente el efecto citotóxico. Para el caso de bacterias
o parásitos que no incorporan 51Cr o que lo liberan en forma espontánea, se usan bases
nitrogenadas radiactivas, como por ejemplo la 3H-Timidina (timidina tritiada) que se
incorpora a los ácidos nucleicos o la 35S-Metionina que se incorpora a las proteínas.
La técnica más frecuentemente empleada para determinar citotoxicidad utiliza la liberación
de 51Cr debida a la lisis de la célula blanco. Las células efectoras son puestas en contacto
con las células blanco marcadas radiactivamente con 51Cr, durante 4 hs de incubación. La
66
radiactividad liberada es directamente proporcional a la lisis celular producto de la
citotoxicidad.
ASPECTOS METODOLÓGICOS:
Marcación de la célula blanco con dicromato de sodio (51Cr): Las células deberán
encontrarse en fase logarítmica de crecimiento.
Centrifugar la suspensión celular y resuspender el precipitado en dicromato de sodio
marcado.
Incubar 60 min a 37ºC con agitación suave.
Lavar con medio de cultivo y resuspender las células marcadas a la concentración
deseada.
Medición de la actividad citotóxica por medio de un ensayo de liberación de 51Cr: La
relación entre células blanco y células efectoras es un factor importante a tener en cuenta.
Generalmente las evaluaciones se realizan con diferentes proporciones de células blanco y
células efectoras (por ej. 1:50).
Sembrar en una placa de cultivo de 96 pocillos, células efectoras y células blanco
(no olvidar los controles).
Centrifugar las placas para aumentar el contacto entre las células e incubar a 37ºC
por 4 hs en estufa gaseada con CO2 al 5%.
Recoger el sobrenadante para la posterior medición de radiactividad en contador de
centelleo.
Medición de la actividad citotóxica por medio de un ensayo de liberación de 51Cr: La
relación entre células blanco y células efectoras es un factor importante a tener en cuenta.
Generalmente las evaluaciones se realizan con diferentes proporciones de células blanco y
células efectoras (por ej. 1:50).
Sembrar en una placa de cultivo de 96 pocillos, células efectoras y células blanco
(no olvidar los controles).
Centrifugar las placas para aumentar el contacto entre las células e incubar a 37ºC
por 4 hs en estufa gaseada con CO2 al 5%.
Recoger el sobrenadante para la posterior medición de radiactividad en contador de
centelleo.
Las cpm espontáneas no deben superar el 20% de las cpm máximas para que la prueba
sea válida.
En algunas ocasiones es conveniente expresar los resultados como unidades líticas (UL),
correspondientes a un determinado porcentaje de lisis. Frecuentemente se utiliza el 30% o
67
el 50%. Para ello se grafica el porcentaje de lisis en función de la relación células efectoras:
células blanco.
ASPECTOS METODOLÓGICOS:
1. Sensibilización y marcación de las células blanco:
Se lavan las células tres veces con medio de cultivo. Antes del último lavado se
dividen en dos alícuotas iguales.
A una de las alícuotas se le agrega el antisuero. Este antisuero ha sido
previamente calentando a 56ºC por una hora, procedimiento que inactiva los
factores del complemento. A la otra alícuota se la toma como control sin suero.
Se agrega dicromato de sodio marcado (51Cr) y se incuba a 37ºC por 30 min.
Se lavan las células tres veces con medio de cultivo para retirar el cromo
radiactivo no incorporado.
68
3. Medición de la máxima liberación de marca (cpm máximas):
A los co-cultivos de células efectoras + células blanco recubiertas con anticuerpos y células
efectoras + células blanco sin recubrir con anticuerpos, se agrega un detergente (Tritón X-
100) que solubiliza las membranas plasmáticas de las células produciendo la liberación de
51
Cr.
El porcentaje de lisis específica debe calcularse para las células blanco recubiertas por
anticuerpos y paralelamente para las células no recubiertas por anticuerpos. El porcentaje
de CCDA se calcula restando al porcentaje de lisis específica de las células recubiertas con
anticuerpos, el porcentaje de lisis encontrado para las células blanco sin recubrir.
Si bien la liberación de 51Cr es un procedimiento ampliamente utilizado para detectar
citotoxicidad, en los últimos años se han desarrollado métodos colorimétricos, fluorímetricos
y más recientemente por quimioluminiscencia, tendientes a reemplazar el material
radiactivo y aumentar la sensibilidad.
Bibliografía
1. Bamford, A.I; Adair, B.M.; Foster, J.C. Primary cytotoxic response of bovine peripheral
blood leukocytes to parainfluenza Type 3 virus infection. 1995. Veterinary Iºmmunology
and Immunopathology. 45: 85-95
2. Fainboim, L; Satz, ML; Jennifer, J. 1999. Introducción a la Inmunología Humana. 387 pp.
3. Margni, R.A. 1996 Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Ed. Interamericana. 976
pp.
4. Podack, E.R. Functional significance of two cytotoxic T lymphocites. 1995. Journal of
Leukocyte Biology. 57: 548-552
5. Gondolf C, Burkhardt E, Failing K, Stitz L. A new colorimetric method for measuring cell-
mediated cytotoxicity in dogs. Vet Immunol Immunopathol. 1996 Dec; 55(1-3):11-22.
69
PAGE no desnaturalizante: La muestra se analiza en su estado natural y este
método nos permite identificar el peso molecular (PM) de sus componentes.
SDS-PAGE: La muestra se analiza luego de un proceso de disociación de la
muestra con detergentes. Este método es el más utilizado en Inmunología y nos
permite identificar antígenos o epitopes secuenciales ya que la muestra que se
analiza está desnaturalizada o disociada.
A continuación describiremos la técnica de SDS-PAGE.
Las muestras a analizar son hervidas a 100°C en presencia de un agente disociante
(dodecilsulfato de sodio o SDS), presente en exceso y un agente desnaturalizante (2-
mercaptoetanol o 2-ME). En estas condiciones, el grupo tiol del 2-mercaptoetanol rompe los
puentes disulfuro que puedan existir y hace que la proteína se desdoble en sus polipéptidos
constitutivos, los que fijan SDS en una relación constante (1.4g SDS/g de proteína). La
carga de la proteína o fragmento se hace insignificante ante el exceso de carga negativa
del SDS. En consecuencia, la carga de todas las moléculas será idéntica y su
desplazamiento en el campo eléctrico dependerá exclusivamente de su tamaño molecular.
El SDS-PAGE permite determinar aproximadamente el PM de una proteína si se la
compara con patrones de peso molecular conocidos que se incluyan en las pruebas y se
corren simultáneamente.
El gel utilizado en esta técnica resulta de la polimerización en largas cadenas de acrilamida
monomérica y su entrecruzamiento con la NN-metilenbisacrilamida. La polimerización
necesita un iniciador del proceso, como el NNNN-Tetrametildiamina (TEMED) y el
persulfato de amonio (PSA). El TEMED cataliza la formación de radicales libres a partir del
persulfato de amonio.
La concentración de los componentes del gel (acrilamida y bis-acrilamida) utilizados en su
armado determina el diámetro de poro. Cuanto mayor es el porcentaje de acrilamida/bis-
acrilamida utilizado, más pequeño es el poro obtenido.
70
Los geles teñidos muestran la complejidad de las muestras ya que en cada calle se
observarán un número de bandas variables dependiendo de las distintas proteínas que
componen la mezcla. La distancia que recorrió cada proteína en el gel desde el sitio de
sembrado de la muestra es proporcional a su peso molecular, por lo tanto, cuanta más
distancia recorrida menor el PM de esta proteína. Las proteínas del mismo PM corren en
forma conjunta.
Constituir el primer paso para el análisis antigénico en muestras (Inmunoblot, ver más
adelante)
Anexo
71
La preparación del gel de poliacrilamida debe realizarse en un frasco limpio y
desengrasado. Debe trabajarse siempre con guantes y preferentemente con barbijo (la
acrilamida es una sustancia neurotóxica que se absorbe a través de piel y mucosas).
3. Armado de la cuba
Con el armado de la cuba se generan las dos cámaras entre las cuales pasará la corriente
eléctrica. Los geles de poliacrilamida quedarán comunicando las dos cámaras (una anódica
y otra catódica) y el pasaje de corriente a través del gel producirá la corrida del material a
analizar. Por lo tanto, del correcto armado dependerá el éxito del análisis de la técnica.
Se colocan ambos geles en el soporte ad hoc tomando en cuenta la limpieza de las gomas
y su lubricación. Es fundamental que la cámara que se genera entre los dos geles no
pierda. Para comprobar esto se debe cargar con buffer la cámara interna fuera del tanque y
observar que no se produzcan pérdidas. Si esto sucede es posible sellar los bordes de la
cuba con agar al 1%, hasta lograr el aislamiento de la cámara interior. Una vez logrado
esto, se coloca el soporte dentro del tanque y se llena la cámara exterior con un volumen
de buffer que llegue aproximadamente hasta la mitad de su altura. El buffer con que se
llenan las cámaras y que se utiliza para la corrida es denominado buffer electrodo
72
Nota: La sensibilidad de la técnica depende del colorante de proteínas que se va a utilizar
para ver las bandas, pero el rango de detección se encuentra entre 1 a 10 g. En el caso de
muestras complejas conviene sembrar de 50 a 100 g de proteína total.
6. Corrida
La cuba se conecta a la fuente de poder y se corre a voltaje constante, 70 volts
durante 2 a 3 horas. El frente de corrida, marcado por el colorante presente en el buffer
muestra, permite determinar en qué momento la muestra ha alcanzado la parte inferior del
gel. Una vez concluida la corrida, se desconecta la fuente de poder y se desarma la cuba.
Con guantes y una espátula se despega el gel de los vidrios. El destino de este gel puede
ser la tinción o la transferencia a una membrana de nitrocelulosa para posteriormente
identificar la proteína por inmunoreactividad.
Bibliografía
1. Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor
Laboratory. 1988. pp726.
2. Mini-PROTEAN II Electrophoresis Cell Instruction Manual. Bio-Rad
3. Margni, R.A. 1996. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Ed.
Interamericana.
73
74
ELISA
Como toda reacción antígeno-anticuerpo, posee un equilibrio dinámico con una primera
etapa reversible seguida por una etapa irreversible. Esta cinética depende de la molaridad
del medio (soluciones tamponadas -o buffers- utilizados) y del tiempo y temperatura en que
se produce la reacción (incubación).
La peroxidasa y la fosfatasa alcalina son las dos enzimas más utilizadas. Desde hace
algunos años se ha difundido el uso de ureasa, β-galactosidasa y glucosa-oxidasa.
Peroxidasa
La peroxidasa es una hemoproteína que transfiere Hidrógeno desde un donador
reducido (DH) al O del H2O 2 liberando un producto oxidado y O2. La peroxidasa más
utilizada, obtenida del rabanito (HRP: Horse-Radish Peroxidase). Para revelar la reacción
química producida se utilizan diferentes cromógenos, entre ellos:
2,2-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)-6-sulfonato de diamonio (ABTS), que absorbe a
405 nm. cuando se oxida vira al color verde.
orto-fenilendiamina (OPD) o 1,2,-bencenodiamina, que absorben a 492 nm. Cuando
se oxida vira al color ocre
75
Diaminobenzidina (DAB): cuando se oxida vira al color pardo
El sustrato más utilizado con peroxidasa es el agua oxigenada o peróxido de
hidrógeno (H2O2): La acción de la peroxidasa sobre el peróxido de hidrógeno
degrada este compuesto dando agua y liberando oxígeno (O-). El oxígeno, a su vez,
oxida al cromógeno que pasa de incoloro en su estado reducido a coloreado en su
estado oxidado.
Como todas las enzimas, la peroxidasa acelera el proceso de degradación del sustrato sin
perder su funcionalidad, por lo tanto, se encuentra en condiciones de reaccionar
nuevamente una y otra vez es por eso que debe agregarse una sustancia de solución de
freno o stop que modifica el pH.
Fosfatasa alcalina
Las fosfatasas alcalinas utilizadas en los ELISAs se aíslan a partir de intestino
bovino o de Escherichia coli. Estas enzimas hidrolizan una amplia gama de ésteres de
fosfatos (como los de alcoholes primarios, secundarios, fenoles y aminas), tienen un pH
óptimo alcalino (por lo que se emplean soluciones a base de dietanolamina con pHs
cercanos a 9) y requieren Mg y Zn como cofactores.
Los cromógenos más utilizados para esta enzima son:
-pNPP (paranitrofosfato) que vira de incolora a amarillo.
-5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro blue tetrazolium (NBT/BCIP) que vira de
incoloro a azul.
durante 16 hs a 4°C.
El exceso de Ag se remueve mediante lavados con 0.05-0.1% de Tween 20 en PBS
(PBST).
Se agrega una solución que contiene proteínas que no son reconocidas por los
anticuerpos específicos (solución bloqueante), para limitar la unión inespecífica de
proteínas. Se puede utilizar 10% de leche descremada en polvo resuspendida en PBS. Se
incuba durante 1 hora a 37°C o durante 16 hs a 4°C.
El exceso de solución bloqueante se remueve mediante lavados con PBST.
Se agrega el suero problema y los sueros control positivo y negativo por duplicado o
triplicado. Se incuba durante 1 hora a 37°C o durante 16 hs a 4°C. (El suero problema es
aquél del cual se quiere conocer si posee Acs específicos contra el Ag que se encuentra
pegado en la placa, en este caso es un suero bovino en el que se analiza la presencia de
Acs anti-B. abortus).
Los anticuerpos no unidos al Ag se remueven mediante lavados con PBST.
76
Se agrega un anticuerpo unido a enzima (conjugado) que reconoce a las
inmunoglobulinas de la especie de la cual estamos evaluando el suero (En este caso, el
conjugado será un Ac anti-Ig bovina). Si el Ac específico está presente, el anticuerpo
conjugado reacciona con él y queda unido. Se incuba durante 1 hora a 37°C o durante 16
hs a 4°C.
El exceso de conjugado se remueve mediante lavados con PBST.
Se agrega el sustrato de la enzima. La reacción de la enzima con el sustrato resulta en
un producto coloreado y es un indicador visual de que la reacción antígeno-anticuerpo ha
tenido lugar.
Dado que las enzimas pueden continuar degradando el sustrato dependiendo del tiempo
y la temperatura se realiza el frenado de la actividad enzimática a tiempo de reacción
determinado que se relaciona con la aparición de color en los controles negativos de
sustrato. El freno depende de la enzima utilizada y es en el caso de peroxidasa ácido
sulfúrico y para fosfatasa se utiliza el hidróxido de sodio, ambos modifican el pH y la
reacción se frena.
La reacción cromática puede ser leída a simple vista o cuantificada por
espectrofotometría. La intensidad de la reacción es proporcional a la cantidad de enzima
activa presente en cada hoyo.
Lectura:
Como primer paso y para identificar si la prueba funcionó se debe realizar la lectura
de los controles, si el control positivo cambió de color y el control negativo dio lecturas
bajas o negativas entonces podemos proceder a continuar con la interpretación de los
resultados. En caso de haber anticuerpos anti-brucella en el suero bovino problema, se
observará la aparición o cambio de color en el sustrato. En un primer paso, los anticuerpos
del suero se unen al antígeno pegado a la placa. Al agregar los anticuerpos conjugados a la
enzima, éstos reconocen y se unen a los anticuerpos del suero. La enzima queda adherida
y se produce así la reacción al agregar el sustrato.
De no haber anticuerpos específicos en el suero problema, el resto de los anticuerpos se
eliminan con el lavado. Al agregar el Ac anti-bovino marcado con la enzima, éste no
reconoce ninguna molécula específica y se elimina al realizar el último lavado. Por lo tanto,
al agregar el sustrato no se producirá ninguna reacción específica. Se puede observar un
nivel bajo de señal por autodegradación del sustrato o debido a la presencia de enzima por
lavado ineficaz de la placa. Por esto es tan importante que después de cada incubación se
proceda al lavado con soluciones salinas con detergentes suaves, a fin de eliminar las
proteínas unidas de manera inespecífica a los soportes sólidos.
77
Se agrega la muestra a evaluar (muestra problema) y los controles positivos y negativos
por duplicado o triplicado. Se incuba durante 1 hora a 37°C o durante 16 hs a 4°C.
(Muestra problema es aquélla en la que se quiere determinar la presencia del Ag para el
que son específicos los Acs fijados a la placa)
Los antígenos no unidos al Ac se remueven mediante lavados con PBST.
Se añade un segundo anticuerpo específico para ese antígeno, pero unido a una enzima
(conjugado). Si el Ag específico está presente, el anticuerpo conjugado reacciona con él
y queda unido. Se incuba durante 1 hora a 37°C o durante 16 hs a 4°C. El exceso de
conjugado se remueve mediante lavados con PBST.
Se coloca el sustrato de la enzima y se relaciona la actividad enzimática observada con
la concentración del antígeno presente en la muestra.
ELISA DIRECTO:
La muestra problema (de la cual no se sabe si contiene o no Ac o Ag) se inmoviliza
sobre la fase sólida. En caso de analizar Ac, estos se detectan por medio de Ags
conjugados, y en el caso de analizar la presencia de Ag, estos se detectan por Ac
conjugados. (Fig. 1A).
ELISA INDIRECTO:
En el ELISAs indirecto el antígeno o anticuerpo a identificar es capturado en la placa
por la molécula complementaria (Ag o Ac), según corresponda. O sea, si se desea detectar
Acs específicos en un suero, se inmoviliza el antígeno en la fase sólida y se lo hace
reaccionar con el suero problema. Luego se utiliza un Ac anti-Ig de la especie conjugado a
una enzima. Este sistema tiene alta detectabilidad debido a que varias moléculas del
78
conjugado enzimático (Anti-Ig marcados con la enzima) pueden unirse a cada molécula de
Ac que reaccionó a su vez con el Ag inmovilizado, este efecto provoca una amplificación de
la señal. (Fig. 1B)
79
Valor de corte
Para la interpretación del ensayo y a fin de poder diferenciar entre muestras positivas y
negativas, debe calcularse el valor de corte utilizando la siguiente fórmula.
Valor de corte = densidades ópticas (D.O.) promedio + 2 desvíos estándar de los controles
del suero negativo.
El valor de corte debe ser tal que minimice los resultados falsos, ya sean positivos o
negativos. En general existe una zona de solapamiento en la distribución de la reactividad
de sueros positivos y negativos, en la que no puede establecerse con certeza si una
muestra es positiva o negativa.
Por este motivo el valor de corte se determina de manera tal de tener más falsos positivos
o falsos negativos, según qué tipo de error produzca consecuencias menos graves en la
decisión biológica.
Controles
En todos los ensayos y diagnósticos, los controles deben permitirnos afirmar que el
cambio de color detectado corresponde a la interacción específica entre Ag y Ac y no a
reacciones inespecíficas. Si las reacciones inespecíficas se detectan estas deben ser
minimizadas y tomadas en cuenta en el momento de establecer el valor de corte.
80
Los valores obtenidos con estos controles repetidos en todos los ELISAs a través del
tiempo nos permite calcular la repetitividad del ensayo y comparar resultados de diferentes
días o entre laboratorios.
A- Control negativo del Conjugado: Se realiza para corroborar que el anticuerpo conjugado
a la enzima no interacciona con ningún otro componente del sistema que no sea el
anticuerpo primario. Se realiza de la siguiente manera: se pega a la placa el antígeno, se
bloquea, no se incuba con el suero o anticuerpo primario (se mantiene el bloqueante), se
coloca el anticuerpo conjugado y por último el sustrato. Estos controles no deberían
reaccionar con ninguno de los componentes arrojando valores de densidad óptica bajas o
despreciables.
B- Control positivo del Conjugado: Este control se realiza a fin de determinar que el
anticuerpo conjugado a la enzima interactúa correctamente con el anticuerpo primario. Se
realiza de la siguiente manera: Se pega un suero de la especie frente a la cual es
específico en conjugado. Por ejemplo si el anticuerpo conjugado es un anticuerpo anti ratón
se coloca en la placa suero de ratón, se bloquea, no se coloca anticuerpo primario y se
coloca el anticuerpo secundario marcado con la enzima, continuando el resto de la técnica
de la misma manera. Este control debe dar positivo, es decir debe haber color en los hoyos
indicando el correcto funcionamiento del conjugado.
Control del sustrato: Permite determinar que el sustrato de la enzima no reacciona con
ningún otro componente del sistema excepto con la enzima. Se realiza de la siguiente
manera: se pega a la placa el antígeno, se incuba con el anticuerpo 1º, es decir, el suero, y
no se coloca el anticuerpo secundario conjugado, y se coloca luego el sustrato y este no
debería modificar su color, ya que no hay en los hoyos enzima que catalice la reacción.
81
han desarrollado métodos inmunoenzimáticos basados en la interacción avidina-biotina.
Pues estos reactivos permiten reemplazar a los antígenos o anticuerpos conjugados.
Proteína A:
Es una proteína de la pared de Staphylococcus aureus que tiene alta
afinidad por los fragmentos Fc de algunos isotipos de Igs (Ka=108 M-1). Tiene 4 sitios de
unión, aunque generalmente reaccionan sólo dos.
El diseño de una técnica inmunológica está relacionado con el dato o resultado que
pretendemos obtener de su realización. Este resultado permite clasificar las técnicas en:
TÉCNICAS CUALITATIVAS
Indican la presencia o ausencia de antígenos o anticuerpos en una muestra. En
algunos casos el resultado es suficiente para confirmar un diagnóstico, como por ejemplo,
en la detección de anticuerpos contra los virus de la arteritis equina o de la anemia
infecciosa equina, o la identificación de virus rábico en una muestra de encéfalo. Los
resultados se expresan como positivo y negativo.
TÉCNICAS SEMICUANTITATIVAS
Brindan una idea de la cantidad de anticuerpos presentes en una muestra. A tal fin,
la técnica se realiza sobre diluciones seriadas de la muestra para obtener el título, que es
la inversa de la última dilución que da resultado positivo.
El título es una manera indirecta de cuantificar la sustancia reaccionante y es directamente
proporcional a la cantidad de "sustancia" presente en la muestra y al límite de detección de
la técnica utilizada.
Por esto, cuando tenemos un resultado expresado en título debemos indicar cuál fue la
técnica empleada. Como ejemplos, podemos mencionar la titulación de anticuerpos contra
leptospira spp. obtenido por micoaglutinación o contra parvovirus caninoobtenido por
Inhibición de la hemaglutinación.
TÉCNICAS CUANTITATIVAS
Determinan la cantidad de antígeno o anticuerpo presente en una muestra, medidas
como cantidad absoluta o concentración. Estas técnicas requieren utilizar estándares de
concentraciones conocidas que se evalúan simultáneamente con la muestra y nos permiten
realizar curvas patrones, a partir de las que se calcula la cantidad de la sustancia presente
en la muestra por interpolación del resultado obtenido en la medición de la muestra
problema.
82
Nos referimos a controles externos a aquéllos que son evaluados en otros
laboratorios, llamados “laboratorios de referencia”, que controlan y avalan nuestros
resultados.
DILUCIONES
Como se ve, S está más diluido en la dilución 1/10 (10-1) que en 1/2 (10-0,3), es decir, que la
mayor de estas cuatro diluciones es 1/10.
Para preparar una dilución 1/3, por ejemplo, se pueden usar diferentes volúmenes
según el requerimiento de la técnica a usar:
Una dilución seriada es aquélla en la que se realizan diluciones sucesivas del soluto, de
forma tal que el factor de dilución se mantiene constante y la dilución anterior se utiliza
como fuente de soluto para la dilución siguiente.
Por ejemplo:
83
Dilución seriada en base 10. (Factor de dilución =10)
El título nos da una idea de los niveles de anticuerpo presentes en una muestra.
La principal aplicación de este concepto se refiere al nivel de anticuerpos específicos
(frente un antígeno dado) presente en un suero u otra muestra biológica.
Para obtener el título de anticuerpos, por ejemplo, de un suero, se hace una dilución
seriada de dicho suero y a cada dilución se la enfrenta con una cantidad fija del antígeno.
La reacción observada entre antígeno y anticuerpo dependerá de la especificidad, de la
afinidad y de la técnica que se use.
Asi, el título de anticuerpos presentes en el suero (título del suero) será la inversa de la
mayor dilución en la que se observa reacción positiva.
En el siguiente ejemplo:
Dilución 1/2: reacción positiva
Dilución 1/4: reacción positiva
Si la dilución 1/64 hubiese dado un resultado positivo, deberíamos haber seguido diluyendo
el suero hasta llegar al primer resultado negativo: cuando nuestro objetivo es obtener el
título de un suero debemos llegar hasta la dilución límite o final de la reacción.
El nivel o título de anticuerpos específicos contra un antígeno en particular presentes en el
suero de un individuo refleja la respuesta inmune humoral de ese individuo frente a ese
antígeno.
De Interacción PRIMARIA:
Ocurren en milisegundos y están determinadas por la afinidad del paratope del
anticuerpo por el epitope de un antígeno. La reacción no se puede reconocer a simple vista,
por lo tanto, para determinar si la misma tuvo lugar se emplean métodos en los que el
antígeno o el anticuerpo se marcan con una molécula que puede ser un radioisótopo (en la
prueba de RIA), una enzima (en las pruebas de ELISA, Inmunoblot e Inmunohistoquímica)
o un fluorocromo (en la Inmunofluorescencia o en la citometría de flujo). Estos métodos
transforman la reacción primaria en señales (radiactivas, colorimétricas o fluorescentes)
que pueden interpretarse y cuantificarse.
De Interacción SECUNDARIA:
Es la consecuencia de la unión antígeno-anticuerpo luego de ocurrida la reacción
primaria, determinada por las características del antígeno y del anticuerpo.
Para que estos fenómenos ocurran el antígeno debe ser polivalente (varios determinantes
antigénicos) y el anticuerpo debe actuar como divalente o polivalente, esta unión forma una
85
red o entramado en el que un anticuerpo está unido a por lo menos 2 partículas antigénicas
diferentes y cada partícula antigénica está unida a una o más moléculas de anticuerpo.
Estas reacciones pueden observarse a simple vista y según la solubilidad del antígeno
involucrado en la reacción (soluble o particulado) se los nombra como:
De lo que se desprende que la naturaleza del antígeno es la que define estas reacciones.
La proporción en las cantidades de antígenos y anticuerpos que interactúan definen la
estabilidad de estos complejos inmunes. El exceso de alguno de ellos puede evitar que la
interacción sea visible. La mejor proporción para que la reacción ocurra se la conoce como
zona de equivalencia.
De interacción TERCIARIA:
En los casos en que se utilice una consecuencia biológica de la unión antígeno
anticuerpo en otro sistema tanto in vivo como in vitro para revelar la formación del complejo
inmune, se habla de interacción terciaria. Como ejemplos podemos nombrar técnicas que
va a ser descritas en otros capítulos como la de Fijación del Complemento, la
seroneutralización y la inhibición de la hemaglutinación, entre otras.
86
positivos. Dicho de otra manera, es la capacidad detectar como negativos a los
verdaderos negativos.
Técnica de Referencia o
Infección Real
+ -
(enfermo) (sano)
Técnica Objeto + A B
de Valoración
- C D
S:A/A+C E:D/B+D
SENSIBILIDAD = A / A+C
ESPECIFICIDAD = D / B+D
En las que:
(A) Positivos por ambas técnicas (Positivos Verdaderos).
(B) Positivos para la técnica objeto de valoración que en la prueba de oro arrojan
resultados negativos (Falsos Positivos).
(C) Negativos para la técnica objeto de valoración que en la prueba de oro arrojan
resultados positivos (Falsos Negativos).
(D) Negativos por ambas técnicas (Negativos Verdaderos)
87
El término sensibilidad posee otra acepción que se refiere al nivel de detección mínimo o
límite de detección de una técnica inmunológica. Este concepto se refiere a la cantidad
mínima de anticuerpos reaccionantes necesaria para que éstos puedan ser detectados por
una determinada técnica.
Límite de detección
Técnica (mg/ml de Ac)
Concentración de
anticuerpos
necesarios para
que la técnica sea
positiva
RIA 0,0001
ELISA 0,0003
AGLUTINACIÓN 0,0300
INMUNOFLUORESCENCIA 0,5000
RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
Ag* Ac-Ag*
Ac +
Ag Ac-Ag
Donde
Ac representa al anticuerpo específico;
Bibliografía
INMUNOBLOT O WESTERN-BLOT
Anexo
Materiales necesarios:
91
1. Cuando la electroforesis ha concluido (ver SDS-PAGE), se desarma la cuba y se retiran
los geles. Se pueden equilibrar 30 minutos a temperatura ambiente en buffer de
transferencia. Esto previene el cambio de tamaño del gel durante la transferencia y
elimina el exceso de SDS que puede interferir en ella.
2. El armado del soporte lleva una secuencia de componentes que se realiza en un
contenedor lo suficientemente grande para que quepa el soporte abierto. Se llena el
contenedor con buffer para que el soporte de transferencia quede cubierto y evitar en lo
posible la formación de burbujas de aire.
3. Sobre la base negra de una mitad del soporte, se coloca la esponja, seguida por un
papel de filtro Whatman. Ambos deben ser del mismo tamaño que el gel y deben estar
embebidos en buffer de transferencia.
4. Se coloca el gel sobre el papel Whatman. Se quita cualquier burbuja de aire que haya
quedado entre el gel y el papel, utilizando una pipeta de vidrio a modo de palo de
amasar. Si quedan burbujas de aire, estas se observarán posteriormente como
manchas blanquecinas en las membranas, puesto que el aire interfiere con la
transferencia.
5. Se corta la membrana a transferir unos milímetros más grandes que los bordes del gel y
se la equilibra durante 10 a 15 minutos sumergida en el buffer de transferencia.
6. Se humedece la superficie del gel y se coloca la membrana sobre su superficie. Se
deben eliminar las burbujas de aire como en el paso 4. Se debe evitar levantar y re-
posicionar la membrana sobre el gel, ya que algunas proteínas comienzan a transferirse
tan pronto como el gel toma contacto con la membrana.
7. Se coloca una segunda pieza de papel Whatman pre-humedecido y de esponja y se
completa el armado cerrando el soporte de transferencia.
8. Se colocan los dos soportes armados en la cuba “ad hoc”. Se debe tener la precaución
de controlar los códigos de colores que indican los electrodos. Como las proteínas están
cargadas negativamente porque están recubiertas con SDS, se mueven hacia el ánodo
(+: base roja).
9. Se coloca el contenedor con hielo dentro de la cuba y se llena la cuba con buffer de
transferencia. El nivel del buffer debe superar el borde superior de la membrana, con el
objetivo de que ésta quede sumergida por completo y la transferencia sea pareja.
10. La transferencia se puede realizar durante 1 hora a 100 V agregando un refrigerante en
la cuba durante 16 horas a 15-30 V en una habitación refrigerada y con agitación del
buffer.
11. Cuando el tiempo se ha cumplido, se desconecta la cuba de la fuente de poder y se
desarma el aparato. Los geles pueden ser teñidos con azul de Coomassie para
determinar la eficiencia de la transferencia. Si se utilizó un marcador de peso molecular
preteñido, éste se puede utilizar como control de la transferencia.
12. Las membranas deben ser marcadas en sus extremos y calles para poder luego
determinar la identidad de la muestra.
92
constante. El objetivo del bloqueo es llenar todos los sitios libres con proteína no
reactiva.
3. La membrana se lava 4 veces con una solución de tween 20 al 0,1% en PBS (solución
de lavado) durante 10 a 15 minutos por vez, a temperatura ambiente en agitación
constante.
4. El anticuerpo primario, es decir, el anticuerpo específico para el antígeno que se quiere
detectar, se diluye en la solución de bloqueo.
5. La membrana se incuba con el anticuerpo primario durante 1 hora a temperatura
ambiente en agitación constante.
6. La membrana se lava 4 veces con solución de lavado durante 10 a 15 minutos por vez,
a temperatura ambiente en agitación constante.
7. El anticuerpo secundario, es decir, conjugado con fosfatasa alcalina o peroxidasa, se
diluye en la solución de bloqueo.
8. La membrana se incuba con el conjugado durante 1/2 a 1 hora a temperatura ambiente
en agitación constante.
9. Se lava la membrana igual que en el punto 3.
10. El revelado se realiza dependiendo del substrato que corresponda según la enzima
utilizada. Si el anticuerpo usado está conjugado con peroxidasa, se debe agregar H2O2
como substrato y un cromógeno que cambia de color al oxidarse y precipita sobre la
membrana, como el TMB (3,3¨, 5,5¨ tetramethylbenzidine). En el caso de usar un
anticuerpo conjugado con fosfatasa, se puede usar BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-
phosphate toluidine salt) como substrato y NBT (nitroblue tetrazolium chlooride) como
cromógeno, además se pueden usar placas radiográficas.
Las bandas donde hubo reacción antígeno-anticuerpo se hacen visibles por la precipitación
del cromógeno sobre la membrana; el fondo del papel donde no ocurrió la unión se observa
blanca. Cuando la imagen es óptima, la reacción se frena lavando la membrana con agua
destilada. Luego la membrana se coloca entre papeles absorbentes y se puede registrar el
resultado mediante un scanner o una cámara fotográfica.
El poro de la membrana puede ser de 0,45 m cuando se requiere retener proteínas, pero
algunos polipétidos pueden atravesar estas membranas sin unirse. En estos casos se
puede recurrir al uso de membranas de poro más pequeño, por ejemplo, de 0,1 m.
Las membranas de nitrocelulosa tienen una capacidad de unión de 80 g de proteína por
cm2 de superficie. Otras membranas, como las catiónicas de nylon (Zeta-Probe o Bio-Rad),
son más resistentes (no se rompen al secarse) y con su utilización se obtiene una
capacidad de unión de proteínas de hasta 500 µg/cm2. Esta característica es ventajosa,
pero por otro lado puede ser una desventaja, ya que hace que las membranas sean difíciles
de lavar y producen imágenes con mucha coloración de fondo.
INMUNOCROMATOGRAFÍA
Bibliografía
1. Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor
Laboratory. 1988. pp726.
2. Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Instruction Manual. Bio-Rad
3. Margni, R.A. 1996. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Ed.
Interamericana.
4. Millipore A. A short guide for developing inmunochromatographic test strips (en
línea). 2nd edition; 2001 (Fecha de acceso: diciembre 2001). URL disponible en:
http://www.com/oemproducts.
5. Engler KH, Efstratiou A, Norn D, Koslov RS, Selga I, Glushkevich TG, et al.
Immunochromatographic strip test for rapid detection of diphtheria toxin: description
and multicenter evaluation in areas of low and high prevalence of diphtheria. J Clin
Microbiol 2002; 4(l): 80-3.
94
1. PRECIPITACIÓN
Cuando un anticuerpo bivalente es puesto en contacto con un antígeno polivalente
soluble (proteínas, virus) contra el cual el Ac es específico, se forman complejos Antígeno-
Anticuerpo (Ag-Ac) que se insolubilizan y dan lugar a una reacción de precipitación.
La precipitación se produce en dos etapas.
En los agregados de complejos Ag-Ac, cada molécula de antígeno está unida a más de una
molécula de anticuerpo y cada molécula de anticuerpo está unida a más de una molécula
de antígeno.
Cuando los complejos Ag-Ac se producen con haptenos monovalentes o antígenos
que poseen un solo determinante antigénico por molécula, la precipitación no se
produce.
Los anticuerpos monoclonales, generalmente no muestran actividad precipitante.
Esto se debe a que en muchos de los casos los anticuerpos monoclonales
reconocen a un único epitope no repetido, lo que les impide formar agregados
(micelas) aunque el antígeno sea una macromolécula (figura 1).
Cuando se utilizan sueros inmunes obtenidos a partir de animales inoculados con
estas mismas macromoléculas la precipitación sí tiene lugar, pues en estos sueros
hay una mezcla de anticuerpos que reconocen distintos epitopes del mismo
antígeno, lo que posibilita la formación de complejos mixtos de Ag-Ac.
Figura 1
95
Figura 2
- Se ha demostrado que en los anticuerpos coprecipitantes hay un resto glucídico del tipo
“rico en manosa”, que puede ser removido mediante el empleo de enzimas. Cuando esto
ocurre, los anticuerpos coprecipitantes se convierten en precipitantes.
- La glicosilación afecta a uno solo de los fragmentos Fab y es la responsable del particular
comportamiento inmunoquímico y biológico de estos anticuerpos, convirtiendo al anticuerpo
en monovalente.
Según sea el medio en que se realice la prueba, la precipitación puede ser en medios
líquidos o en medios con geles.
El “Método del anillo”, se basa en la reacción que se produce en la interfase entre dos
sustancias cuando en una serie de pequeños tubos se colocan sucesivamente y evitando
que se mezclen.
ASPECTOS METODOLÓGICOS:
Se coloca en una serie de tubos 0,2 ml del suero con Ac específicos para el
antígeno en estudio
ASPECTOS MÉTODOLÓGICOS:
APECTOS MÉTODOLÓGICOS:
Añadir 5-10 % del suero específico (que contiene los anticuerpos) al agar fundido y
enfriado a 50ºC procurando que la mezcla sea lo más homogénea posible.
Cubrir inmediatamente la placa con la mezcla anterior y dejar en reposo hasta su
solidificación.
Mediante un sacabocados, efectuar sobre el gel una serie de orificios, los que
deben estar situados a distancias convenientes entre sí para evitar interferencias.
(Se necesita un orificio para cada muestra a valorar y cuatro a cinco orificios para
las distintas concentraciones del antígeno patrón que se utilizan para la
elaboración de la recta de calibración).
En uno de los orificios de la placa, colocar 2 microlitros de la solución antigénica a
valorar (muestra problema), o una dilución conveniente de esta solución.
En los orificios restantes, colocar 2 microlitros de cada una de las diluciones del
antígeno patrón de concentración conocida.
Mantener las placas a temperatura ambiente, en cámara húmeda, hasta que el halo
de precipitación no varíe.
Evaluar los resultados mediante la determinación del diámetro de los halos de
precipitación. Los resultados pueden leerse sobre el material fresco o después de
lavar las placas (Ver método más adelante).
Con esta técnica puede tenerse una idea de las relaciones entre los pesos moleculares de
los antígenos y anticuerpos reaccionantes, cuando se trabaja con concentraciones óptimas
de Ag y Ac.
99
- Si la banda de precipitación formada es recta, indica que los pesos moleculares de ambos
son muy próximos.
- Si la banda es cóncava con respecto al reservorio del antígeno, señala que el peso
molecular de éste es superior al del anticuerpo.
- Si la banda es convexa con respecto al reservorio del antígeno, señala que el peso
molecular de éste es menor que el del anticuerpo
Los dos fenómenos descritos son una consecuencia de las leyes generales de la difusión,
que establecen que la distancia a la que una sustancia difunde está en relación directa con
su concentración y en relación inversa con su peso molecular.
1) 2) 3) 4)
Figura 3
-En el caso I, los dos sistemas Ag-Ac que reaccionan son iguales y se funden en una única
banda de precipitación (reacción de identidad).
- En el caso II hay dos sistemas Ag-Ac diferentes que reaccionan independientemente y
cada uno produce una banda de precipitación que se cruzan (reacción de no-identidad)
evidenciando la presencia de reacciones Ag.-Ac diferentes.
- En el caso III, uno de los antígenos tiene un epitope que no existe en el otro. Por lo
tanto ambas bandas de precipitación se unen y funden parcialmente en una banda,
100
apareciendo una prolongación o espolón en la banda correspondiente al antígeno que
contiene los dos epitopes. Este espolón indica que en este antígeno “ab” hay
componentes antigénicos no compartidos con el antígeno “b” (reacción de identidad
parcial).
La difusión doble en placa es un excelente método para el estudio de la homogeneidad de
antígenos y anticuerpos purificados. Resulta muy útil también para la búsqueda de
impurezas, lo que está limitado por la concentración en que éstas se encuentren presentes,
ya que la precipitación se hace visible cuando los reactivos exceden valores mínimos. Para
obviar este inconveniente, se emplean generalmente altas concentraciones de Ag y Ac, lo
que permite aumentar la concentración de las impurezas y asegurar su precipitación.
La inmunodifusión doble es utilizada ampliamente en el diagnóstico serológico de varias
enfermedades en Medicina Veterinaria, por ejemplo para el diagnóstico serológico de la
Anemia Infecciosa Equina, método denominado “Test de Coggins” (figura 4). En esta
prueba, en una perforación central se coloca un purificado proteico del virus de la anemia
infecciosa equina y en seis perforaciones equidistantes del antígeno y entre sí, se
intercalan sueros de animales positivos (suero control positivo) y sueros de animales que
se desea investigar (sueros problema: S1, S2 y S3).
- Si el suero problema es negativo (S3) las bandas de precipitación de los dos sueros
positivos adyacentes se introducen en la perforación.
- Si el suero problema es positivo (S2), se forma una banda de precipitación entre el suero
problema y el antígeno que se fusiona con las bandas de precipitación de los dos sueros
positivos adyacentes (reacción de identidad).
- Si la banda del suero positivo se dobla pero no forma una banda de identidad completa,
el suero problema es considerado positivo débil (S1).
En cualquiera de estos dos últimos casos el animal se considera infectado.
Este esquema también se emplea para el diagnóstico serológico de otras enfermedades
como Fiebre Aftosa en bovinos, Brucelosis en caninos (Brucella canis) u ovinos (Brucella
ovis) o la Enfermedad de Marek en aves.
Figura 4
Ag: antígeno
S1
+: suero control
positivo
+ +
S 1: suero positivo
Ag débil
S3 S2 S 2: suero positivo
+
S3: suero negativo
APECTOS MÉTODOLÓGICOS:
101
Las placas o portaobjetos se mantienen en cámara húmeda. La lectura de los
resultados se efectúa a las 48 - 72 horas.
Si interesa conservar los resultados, el agar puede colorearse, previa desecación.
- En este caso, el agar debe lavarse previamente por inmersión en solución salina durante
un total de 24 a 48 horas, efectuando el recambio de la solución salina cada 12 horas.
Este lavado es necesario para eliminar las proteínas no precipitadas.
- Luego del lavado, el agar se cubre con un trozo de papel de filtro húmedo y se deja
secar a temperatura ambiente.
- Una vez seco, se retira el papel y se lo sumerge en la solución colorante Azul de
Coomasie durante aproximadamente 1½ hora. El exceso de colorante se elimina por
inmersión en solución decolorante y se procede luego al secado en estufa a 50 ºC.
2. AGLUTINACIÓN
Cuando un anticuerpo (bi o polivalente) es puesto en contacto con el antígeno para
el cual es específico, si este antígeno es polivalente y se encuentra en estado particulado
(hematíes, bacterias, células), se forman complejos Ag - Ac que dan lugar a una reacción
de aglutinación.
Esta reacción puede observarse micro o macroscópicamente como agregados o grumos de
número y tamaño variable.
Los principios que regulan la aglutinación son los mismos que regulan la precipitación; la
ocurrencia de uno u otro fenómeno depende de que el antígeno sea particulado (se
encuentre en suspensión) o soluble (en solución).
La aglutinación se lleva a cabo en medio salino. La concentración óptima de electrolitos es
de 0,15 M. Se cree que el mecanismo de aglutinación se debe a que los iones neutralizan
en parte las cargas superficiales de las partículas antigénicas, evitando el rechazo entre
ellas y asegurando la aproximación indispensable para que una molécula de anticuerpo
reaccione con al menos dos partículas antigénicas. De esta manera se inicia la formación
de los complejos inmunes que llevan a la aglutinación.
APECTOS MÉTODOLÓGICOS:
102
en estudio. Estos grumos son de tamaño variable. A veces son visibles a simple
vista pero otras veces es necesario el uso de lupa o microscopio para observarlos.
103
Los sueros problema son analizados por la prueba de B.P.A, que permite la identificación
de los animales que presentan anticuerpos específicos contra Brucella abortus. Esta
prueba es muy sensible pero poco específica y además no permite discriminar si los
anticuerpos que reaccionan son de tipo IgG o IgM. Por lo tanto, las muestras que resultan
positivas a B.P.A. son analizadas luego por las pruebas de Wright y por la Prueba del 2-
mercaptoetanol. En ambos casos se enfrentan diluciones seriadas del suero problema con
una suspensión estandarizada de Brucella abortus cepa 19. Los sueros son tratados
previamente con una solución de 2-ME que destruye los puentes disulfuro de las IgM, por lo
que estos anticuerpos pierden su poder aglutinante. De esta manera, si se observa
aglutinación aún en los tubos tratados con 2-ME, significa que la aglutinación es debida a la
presencia de anticuerpos de tipo IgG. Los animales que resultan positivos a esta prueba
son considerados como infectados y deben ser segregados del rodeo.
ASPECTOS METODOLÓGICOS:
Colocar 60ul de suero a analizar en el pocillo número 1 de una placa de
microaglutinación con pocillos de fondo cónico.
Colocar una gota de buffer borato a temperatura ambiente desde el pocillo número 2
al número 8.
Diluir el suero en el buffer borato utilizando un microdilutor, descartar el excedente
del pocillo número 8).
Colocar una gota de antígeno de toxoplasma comercial en todos los pocillos.
Agitar las placas enérgicamente durante 30 segundos cuidando de que no se
derrame el contenido de los pocillos.
Colocar un film plástico a fin de evitar la desecación e incubar 24 horas a
temperatura ambiente.
104
Hemoaglutinación pasiva, y simplemente Aglutinación pasiva cuando se utilizan otros
soportes.
Generalmente las uniones de los antígenos a los soportes son no covalentes y la fijación se
obtiene por mezcla directa. En el caso de los hematíes, la fijación de hidratos de carbono
no necesita intermediarios; en cambio para la fijación de proteínas es necesario el
tratamiento previo de los glóbulos rojos con aldehídos simples como el fórmico o pirúvico.
La aglutinación pasiva es un método semicuantitativo que, al igual que la aglutinación,
permite determinar concentraciones relativas de anticuerpos sobre la base de la máxima
dilución aglutinante. Es cuatro veces más sensible que la aglutinación y mucho más aún
que la precipitación. Esto es consecuencia del tamaño de las partículas antigénicas que
intervienen en la reacción. En la precipitación, el antígeno es pequeño y se necesitan
muchos complejos Ag-Ac agregados para que la reacción se visualice, en tanto que en la
aglutinación pasiva se ha transformado al antígeno en una partícula de gran tamaño, capaz
de dar aglutinados visibles con unos pocos complejos Ag-Ac. Por lo tanto esta técnica
posee mayor sensibilidad y bajo límite de detección.
La reacción se efectúa colocando en tubos distintas diluciones del suero a valorar y un
volumen determinado del antígeno fijado al soporte. Anticuerpo y antígeno se mezclan
mediante agitación suave y se incuban durante un tiempo determinado, en general a
temperatura ambiente. Los tubos se observan sin centrifugar, por la parte inferior, para
determinar si ha habido aglutinación.
Esta técnica se emplea para investigar hormonas y antígenos solubles en sangre, orina y
otros fluidos.
Fenómeno de Prozona:
Bibliografía
106
No se han identificado reacciones post-transfusionales relacionadas con el grupo
sanguíneo DEA4. Por esta razón, los animales portadores de este grupo sanguíneo son
considerados dadores universales.
Las características de los grupos sanguíneos caninos en lo que respecta a su
inmunogenicidad (y consecuentemente, al tipo de reacción que provocan) y la presencia o
ausencia de anticuerpos naturales en la población, determinan que una primera transfusión
de sangre incompatible, cualquiera sea el grupo sanguíneo al que pertenezcan los
eritrocitos transfundidos, no produzca una rápida destrucción masiva, sino las siguientes
consecuencias:
- Estimulación de una respuesta inmune primaria que disminuye la vida media de los
eritrocitos transfundidos, pues son destruidos progresivamente a medida que la
respuesta inmune se desarrolla.
- Vida media más breve de los eritrocitos transfundidos si la incompatibilidad se debe a
antígenos contra los cuales el receptor posee anticuerpos naturales.
- Sensibilización del animal receptor a los Ags del grupo sanguíneo incompatible
transfundido. De este modo, en futuras transfusiones con sangre incompatible de igual
grupo que la primera se producirá una respuesta inmune secundaria. Este efecto es
importante para grupos que provocan reacción fuertemente hemolítica (DEA1.1 y en
menor medida DEA1.2).
- Posible sensibilización de la madre DEA1.1 negativa a los eritrocitos DEA1.1 del feto
durante la preñez (25 % de incidencia). Esta situación es equivalente a la
sensibilización por transfusión. En cuanto al recién nacido, éste puede llegar a tener
problemas de hemólisis intravascular al mamar calostro que contiene los anticuerpos
maternos contra su grupo eritrocitario (ver isoeritrólisis neonatal).
Para prevenir las situaciones mencionadas, se recomienda tipificar previamente la sangre
de donante y receptor o, en su defecto, realizar la “prueba cruzada (cross-match)”.
La mayor eficacia en la transfusión se logra cuando los eritrocitos del donante pertenecen a
igual grupo sanguíneo que los del receptor, o cuando se transfunden eritrocitos del grupo
DEA-4.
107
La reacción positiva, que consiste en la presencia de aglutinación en el sedimento y/o de
hemólisis en el sobrenadante, indica que el plasma tiene Acs contra los Ags eritrocitarios.
En el caso de la prueba mayor, el resultado positivo hace contraindicada la transfusión. Una
reacción positiva en la prueba menor resulta significativa cuando se van a transfundir
volúmenes grandes de sangre y nos indica la conveniencia de transfundir sólo eritrocitos y
no sangre entera.
El resultado de la prueba cruzada no indica identidad de grupos sanguíneos entre dador y
receptor; sólo manifiesta la presencia o ausencia de Acs contra los Ags eritrocitarios en el
plasma. Es una medida indirecta y parcial de compatibilidad sanguínea, debido a que un
resultado negativo sólo indica que la transfusión no provocará reacciones post-
transfusionales inmediatas, pero no garantiza que se eviten las consecuencias a mediano y
largo plazo descriptas en el primer apartado.
PRUEBA DE COOMBS
La aglutinación es la manifestación visible de una reacción Ag-Ac en la cual el Ag es
particulado, como por ejemplo las bacterias y los eritrocitos.
Sin embargo, en algunos casos, si bien tiene lugar la reacción Ag-Ac no se produce la
esperada manifestación visible, o sea, la formación de lo que se denomina “enrejado” y que
se visualiza en forma de aglutinación.
Diversas son las causas que pueden concurrir para producir este efecto:
a- Exceso de Acs: En este caso, cada molécula de Ac se uniría con la totalidad de sus
valencias a una misma partícula antigénica. Así, sería imposible la formación del
enrejado pues no se producirían puentes de Acs entre las moléculas de Ag.
b- Presencia de Acs monovalentes: Son Acs que debido a determinadas características de
glicosilación se comportan como monovalentes, imposibilitando la formación del
enrejado. Los Acs contra Ags eritrocitarios pertenecen en su mayoría a este grupo.
c- Defecto de Acs: La cantidad de Acs específicos contra el Ag es muy escasa, y no
alcanza para formar un enrejado del tamaño suficiente como para que resulte visible.
La prueba de Coombs, también llamada de la antiglobulina, permite evidenciar estas
reacciones Ag particulado-Ac mediante el agregado de anti-Igs de la especie. Las anti-Igs
agregadas (también llamadas suero de Coombs), harán de puente entre las regiones Fc de
los Acs unidos a las partículas antigénicas, formando de este modo el enrejado que se ve
en forma de aglutinación. La prueba de Coombs puede ser directa o indirecta.
La técnica de Coombs directa consiste en el agregado de la anti-Ig a una suspensión de
partículas de la que nos interesa saber si ya llevan unidas anticuerpos. El diagnóstico de la
anemia hemolítica autoinmune, caracterizada por la presencia de auto-Acs contra los
eritrocitos propios, constituye un ejemplo de uso de esta técnica directa y consiste en el
agregado del suero de Coombs a una suspensión de eritrocitos de un animal sospechoso
de sufrir la enfermedad.
La técnica de Coombs indirecta, Implica dos pasos: una primera incubación de la
suspensión de Ag particulado con el suero del paciente y una segunda incubación luego del
agregado del suero de Coombs. De este modo podemos diferenciar los resultados falsos
negativos, cualquiera sea la causa que los provoque, de los resultados negativos reales
debidos a la ausencia de Acs específicos. La prueba de Coombs indirecta resulta de suma
utilidad para evidenciar los fenómenos de prozona y para la tipificación de grupos
sanguíneos. La reacción de Coombs directa se esquematiza en la figura 1.
108
Figura 1
Por lo tanto, en la prueba de Coombs directa el complejo inmune proviene del paciente y en
la prueba de Coombs indirecta el suero del paciente debe contactarse con el antígeno
particulado utilizado como reactivo diagnóstico.
ISOERITRÓLISIS NEONATAL
Esta enfermedad, también denominada ictericia hemolítica del recién nacido, se produce
cuando la madre transmite Acs contra los Ags eritrocitarios del cachorro a través del
calostro, provocando en el cachorro una reacción de hemólisis intravascular aguda. Puede
producirse cuando una madre DEA1.1 negativa, previamente sensibilizada al Ag
eritrocitario DEA1.1, tiene un cachorro DEA1.1 positivo. El resto de los Ags de grupos
sanguíneos carecen de relevancia en lo que respecta a esta enfermedad, debido a que son
Ags débiles y no provocan reacciones de hemólisis intravascular.
La sensibilización de la madre puede suceder por dos circunstancias:
a- Que alguna vez haya recibido una transfusión de sangre DEA1.1.
b- Que en una anterior preñez de un cachorro DEA1.1 positivo, los eritrocitos del feto
hayan pasado a la circulación sanguínea materna y estimulan la producción de una
respuesta inmune específica de tipo primaria en la madre. Esta respuesta da lugar a una
muy baja o nula cantidad de Acs anti-DEA1.1 al momento de la producción de calostro, por
lo que no hay riesgo de isoeritrólisis neonatal en esta primera preñez. No obstante, la
madre queda sensibilizada para futuras gestaciones.
En una posterior gestación de un cachorro DEA1.1 y en el caso de que los eritrocitos del
feto pasen a la circulación materna, la hembra ya sensibilizada (cualquiera sea la causa de
la sensibilización) responderá a este estímulo antigénico con una respuesta de tipo
secundaria. Esta respuesta dará lugar a una rápida síntesis de una elevada tasa de Acs
que serán transmitidos al recién nacido mediante el calostro. Los Acs anti-DEA1.1 al unirse
a los eritrocitos del neonato, provocarán la activación de la vía clásica del complemento con
la consecuente hemólisis intravascular aguda.
La isoeritrólisis neonatal puede prevenirse si se evita que el recién nacido mame calostro,
pero dado que el calostro es un alimento fundamental, no conviene privar de él al cachorro
a menos que exista la seguridad de la presencia de Acs anti-eritrocitos.
La realización de una prueba cruzada entre el suero o plasma de la madre y los eritrocitos
del recién nacido, es la herramienta con que se cuenta para tomar la decisión: Un resultado
positivo hace contraindicado el mamado de calostro. Es posible realizar esta prueba antes
del parto utilizando los eritrocitos del padre; de este modo obtenemos el dato con
anticipación para poder preparar el manejo adecuado del recién nacido en caso de que la
109
prueba arroje resultado positivo (administración de calostro artificial, búsqueda de nodriza,
etc)
APENDICE
Bibliografía:
1. Halle A. Canine blood groups and their importance in veterinary transfusion and
medicine. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice. Vol. 25, Number
6, Nov. 1995, 1323-1332.
2. Giger U et al. An acute hemolytic transfusion reaction caused by dog erythrocyte
antigen 1.1 incompatibility in a previously sensitized dog. JAVMA, Vol. 206, May 1,
1995, 1358-1362.
110
3. Margni R. A. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Bs. As. Editorial Médica
Panamericana. 5º edición, septiembre de 1996.
4. Tizard, I. Inmunología Veterinaria. Ed. Interamericana. M.C.Graw – Hill. 4° Edición,
1995.
Técnica de Seroneutralización
Se define como seroneutralización (SN) a la prueba in vitro que detecta la capacidad que
poseen los anticuerpos específicos presentes en el suero, de impedir la replicación viral y
provocar la pérdida de infectividad de un virus. Debido a la importancia que tiene la
aplicación de esta técnica en virología, se explicará la prueba de seroneutralización viral,
aunque la prueba puede utilizarse también para estudiar la capacidad de un suero para
producir la inactivación de una toxina por acción de los anticuerpos de un suero (antitoxina).
Fundamentos
Reacción de seroneutralización
La reacción consiste en mezclar una cantidad conocida de virus con un suero que se
intenta evaluar y determinar si la capacidad infectante del virus disminuye luego de un
determinado tiempo de incubación. Como los sueros están inactivados por calor para
eliminar proteínas termolábiles como las del complemento, esta disminución de la
capacidad infectiva del virus se atribuye a la presencia de anticuerpos neutralizantes.
111
Aplicaciones de la técnica
Los sueros se deben inactivar durante 30 minutos a 56ºC para destruir los factores
termosensibles del complemento.
En todos los casos se debe contar con sueros de referencia positivos y negativos. Los
sueros positivos se obtienen de animales que han estado en contacto anteriormente con el
virus (convalecientes o poli-vacunados), mientras que los sueros negativos provienen de
animales que no han tenido contacto alguno con el mismo.
Las reacciones se incuban por un período variable que depende del sistema de detección
(células o animales) y del tipo de virus, pero que en general es de 3 a 10 días. Las lecturas
se realizan diariamente buscando el efecto de la infección viral.
Por último, se puede recurrir a los animales de laboratorio, solo cuando no se pueden
utilizar cultivos celulares o embriones de pollo. En este caso, se observará si los animales
sobreviven o no, o si manifiestan determinada sintomatología característica.
Cuando los virus tienen una constitución antigénica única (como el virus del moquillo
canino), todas las cepas de ese virus pueden ser neutralizadas con un mismo suero.
Por el contrario, cuando un virus presenta diferencias antigénicas entre sus distintas cepas,
cada una de ellas deberá ser neutralizada con un suero específico que permita distinguir
serotipos o serovariedades virales. Entre estos virus, que constituyen el grupo más
numeroso, se encuentran el virus de la fiebre aftosa, y adenovirus como el de la hepatitis
canina.
En esta reacción, el antisuero que neutraliza indica qué cepa o virus es el que está
presente en la muestra. La verificación de la presencia eventual de dos o más tipos de virus
en una muestra se facilita si la neutralización se hace con todos los anticuerpos existentes.
Por ejemplo, en el caso de parvovirus canino, la seroneutralización se lleva a cabo con los
anticuerpos específicos para las tres cepas conocidas: CPV2, CPV2a y CPV2b, por
separado y en forma combinada, para poder identificar cuál es la cepa de virus responsable
de una infección.
Bibliografía
Guía de trabajos prácticos. Inmunología. Año 1980
Harris, RJC. Techniques in Experimental Virology. New York/London: Academic Press.
1964.
Robson, DS; Gillespie, JH; y Baker, J.A. The neutralization test as an indicator of
immunity to virus diarrhea. Cornell Vet. 50: 503-509.
Sorenson, DK; Chow, TL; Kowalczyk, T.; Hanson, RP.; y Brandly, CA. Persistence in
cattle of serum-neutralizing antibodies of vesicular stomatitis virus. Am. J. Vet. Res. 19:
74-77. 1958.
113
Anexo:
Cálculo de Reed y Muench: Método de los totales acumulativos
En la titulación del virus, el punto final se toma como la dilución en la cual cierto porcentaje
de cultivos celulares o animales muestran lesiones. Se ha demostrado estadísticamente
que el valor más apropiado es aquél en el que la mitad de los cultivos o animales muestran
el efecto producido por la infección viral y la otra mitad no. Esta región es la que ofrece
mínimo error en lo que atañe a la variación individual en la sensibilidad al virus. La
obtención de resultados estadísticos requiere inocular el mayor número posible de réplicas
y hacer diluciones poco espaciadas.
El método de Reed y Muench se basa en considerar que los cultivos celulares o animales
que recibieron menor dosis de virus infectante y presentaron lesiones, hubieran mostrado
las mismas lesiones con más dosis de virus infectante.
Para cada diución de virus se inoculan entre 4 y 8 réplicas (hoyos de cultivo celular o
animales de laboratorio). El objetivo de este método es conocer la dilución del virus que
corresponde al 50% de infección.
Se utiliza un sistema de sumas para obtener los totales acumulados y obtener el cálculo del
punto final. Los valores acumulados se obtienen sumando en el sentido de las flechas,
como se esquematiza en el siguiente cuadro.
No Acumulados
Infectados o Valores Valores
Dilución Número de infectados o positivos / %
muertos acumulados acumulados
de virus réplicas vivos Total de (1)
(positivos) positivos negativos
(negativos) acumulados
10-1 4 4 0 19 0 19 / 19 100
10-2 4 4 0 15 0 15 / 15 100
10-3 4 4 0 11 0 11 / 11 100
-4
10 4 4 0 7 0 7/7 100
10-5 4 3 1 3 1 3/4 75
10-6 4 0 4 0 5 0/5 0
-7
10 4 0 4 0 9 0/9 0
(1) [Acumulados positivos / Total de acumulados] x 100
Se observa que el punto final al 50% está entre el 75% y 0%, que corresponden a las
diluciones 10-5 y 10-6, respectivamente. Por lo tanto la dilución que representa el 50% de
infectividad debe estar comprendida entre estas: debe ser mayor a 10-5 pero menor de 10-6.
Para estimar cuál es este valor se calcula la distancia proporcional (DP) entre dichas
diluciones, utilizando la siguiente fórmula:
En este ejemplo,
DP = 75 - 50 = 0.33
75 - 0
Luego, el producto (DP x log. del factor de dilución) se suma en valor absoluto al exponente
de la dilución superior a 50.
En este ejemplo,
El factor de dilución es 10 y el logaritmo de 10 es 1.
114
La dilución que da un porcentaje de positivos superior a 50 es 10-5
Por lo tanto, (0.33 x 1) + 5, determina que el valor de la dilución que representa el 50% de
infectividad es 10-5.33
En este ejemplo,
El volumen de virus inoculado fue de 0.1 ml.
El título viral, por lo tanto, será: 105.33 x 10 = 106.33 TCID50/ml.
TCID50: Dosis infectivas al 50% en cultivos de tejidos, del inglés Tissue Culture Infective
Doses.
Para calcular qué dilución del virus stock hay que efectuar para tener esa dosis, se realiza
el siguiente cálculo:
1 TCID50/ml se obtendría en una dilución 10-6.33
103 = 1000 TCID50/ml se obtiene en una dilución 1000 veces más concentrada:
10-6.33 x 103 = 10-3.33 (Es decir, que en una dilución 10–3.33 de este virus habrá 1000
TCID50/ ml).
El antilogaritmo de 3,33 es 2138: esto significa que una dilución 10-3.33 equivale a 1/2138
y contiene 1000 TCID50/ml.
A partir de esta dilución se realizan tres diluciones más en base 10, para titular el inóculo
viral en simultaneidad con la prueba (control de título viral).
Para realizar esta técnica es necesario tener el virus que se va a utilizar previamente
titulado, fraccionado y congelado a muy bajas temperaturas (en nitrógeno líquido a -196ºC,
o en freezers ultrafríos a -80ºC).
El inóculo, que contiene 1000 TCID50/ml, se mezcla en volúmenes iguales con cada dilución
de los sueros problema y con los sueros de referencia.
Debe incluirse siempre la titulación del virus en la misma prueba, a fin de comprobar que
las dosis infectantes utilizadas fueron las correctas.
115
Ejemplo de análisis de resultados:
DP = 80 - 50 = 0,5
80 – 20
La cifra obtenida de multiplicar [DP x log. del factor de dilución] se suma al log. de la
dilución que presenta un porcentaje de no infectados superior al 50%, con el fin de obtener
el Índice de Seroneutralización.
La dilución con un porcentaje de no infectados superior al 50% es 1/16 (el logaritmo de
16 es 1,2)
El factor de dilución es 2 (el logaritmo de 2 es 0,3). Por lo tanto,
IS = 1,2 + [0,5 x 0,3] = 1,35.
El antilogaritmo de 1,35 es 22,4.
Podemos decir, entonces, que el índice de seroneutralización es 1,35 y que 1/22,4 es la
dilución del suero que protege al 50% de los animales.
El rango de diluciones de virus que se utiliza en esta prueba es arbitrario, pero para
definirlo debemos tener en cuenta el origen de los animales a evaluar:
- En el caso de ser animales libres de infección, se emplea un número bajo de dosis
infectivas ya que al tener el suero niveles mínimos o nulos de anticuerpos, se necesita
poca cantidad de virus para que éste supere el efecto neutralizante del suero y produzca
efecto citopático.
- En cambio, si se trabaja con suero de animales vacunados, se utiliza un número más
alto de dosis infectivas, ya que los niveles de anticuerpos esperados son mayores.
El suero problema y los sueros de referencia se preparan en una única dilución (establecida
entre 1/2,5 y generalmente no más de 1/10, dependiendo del virus con que se trabaje).
Simultáneamente se procede a la dilución del virus en base 10.
Las diluciones de los sueros y el virus se mezclan en partes iguales y se incuban 1 hora a
37ºC.
116
Luego de la incubación se siembran (sobre cultivos celulares) o se inoculan (en ratones o
embriones de pollo).
Los resultados se pueden expresar como Títulos Seroneutralizantes, obtenidos por el
cálculo de Reed y Muench, o como Índice de seroneutralización (IS), que indica el efecto
que produce el suero neutralizante sobre la capacidad infectiva del virus.
Por ejemplo,
Título de virus incubado sin suero = 106.33
Título del virus incubado con suero problema = 103.40
IS = 106.33 - 103.40 = 10 2.93
10 2.93 expresa las dosis neutralizantes 50% del suero problema
Debe incluirse siempre la titulación del virus en la misma prueba, a fin de comprobar que
las dosis infectantes utilizadas fueron las correctas.
INHIBICIÓN DE LA HEMAGUTINACIÓN
Introducción: Hemoaglutinación
ASPECTOS METODOLÓGICOS:
Ambas pruebas (HA - IH) se realizan en microplacas de 96 hoyos con fondo en U o V.
La HA se lleva a cabo utilizando diluciones del virus en base 2 a partir de la dilución 1:2; los
glóbulos rojos (GR) capaces de ser aglutinados se colocan a una concentración final de
0.5% o 1%. Como diluyente de los Ag y GR se utiliza solución salina buffereada (PBS) con
0.1% de seroalbúmina bovina (BSA).
PROTOCOLO DE TITULACIÓN VIRAL POR HA:
117
Utilizando una micropipeta de 50 μl, efectuar diluciones seriadas en base 2 del Ag
(de 1:2 a 1:2048), dejando el último hoyo de la fila sin Ag para que sirva como
control de eritrocitos.
Agregar 50 μl de la suspensión de eritrocitos al 0,5 o 1% a cada hoyo, agitar
levemente para mezclar los reactivos.
Cubrir la microplaca e incubar a 4 ºC durante 16 hs.
Leer una vez que esté bien delimitado un “botón” en el fondo de cada pozo control
de eritrocitos.
Lectura:
Con la ayuda de un espejo se observa el fondo de cada pocillo. Primero se realiza la
lectura de los hoyos control.
La lectura puede realizarse a ojo desnudo
Interpretación de los resultados:
El título HA corresponde a la dilución más alta del virus en la que se observe 100% de HA.
Se considera que en esta dilución existe una (1) unidad hemoaglutinante (UHA).
En la siguiente figura se esquematiza la titulación por Hemoaglutinación de ocho
muestras de virus (filas A - H). Los títulos obtenidos figuran a la derecha de la placa.
118
Inhibición de la hemaglutinación
ASPECTOS METODOLÓGICOS:
119
FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
Las características del sistema de complemento han permitido idear una reacción
serológica denominada “Fijación de Complemento”, la que mediante un sistema indicador
permite determinar la activación del C a un complejo antígeno-anticuerpo, esté el antígeno en
solución o en suspensión. Como sistema revelador se emplea el denominado “sistema
hemolítico”, que consiste en una suspensión de complejos antígeno-anticuerpo formados por
glóbulos rojos de carnero y anticuerpos con especificidad por estos hematíes (hemolisina).
Esta técnica es muy empleada para la identificación cuantitativa de anticuerpos contra un
antígeno en particular y es la técnica de referencia (“gold estándar”) para muchas
enfermedades infecciosas. Por ejemplo, en el diagnóstico de brucelosis mediante este método,
el suero en estudio se incuba con una suspensión estandarizada de Brucella abortus y una
cantidad conocida y estandarizada de complemento (medida en unidades CH50). En un paso
posterior se agrega el sistema hemolítico. (Figura 1)
Si la muestra en estudio contiene anticuerpos específicos contra Brucella abortus, éstos se fijan
a la bacteria (figura 3 A) y activan el complemento por la vía clásica, que produce su lisis.
Cuando en un paso posterior se agrega el sistema hemolítico, ya no hay complemento
disponible y los glóbulos rojos permanecen intactos (figura 3 B).
120
El consumo de C por los complejos inmunes se manifiesta indirectamente por la ausencia de
hemólisis al agregar el sistema hemolítico. El C no “fijado” indica la ausencia de reacción
antígeno-anticuerpo durante la primera etapa de la prueba y se mide en unidades CH50 .
Se realizan diluciones del suero en base 2 que se incuban con cantidades fijas y conocidas del
resto de los reactivos.
El título se determina como la máxima dilución de suero que produce la hemólisis del 50% de
los glóbulos rojos del sistema hemolítico.
Para medir la hemólisis se centrifugan los tubos (para que sedimenten los glóbulos rojos que
no se hemolizaron). La hemoglobina presente en el sobrenadante se lee en unidades de
densidad óptica en un espectrofotómetro a 542 nm de longitud de onda.
Para llevar a cabo esta prueba deben tenerse una serie de consideraciones:
Las muestras de suero, libres de hematíes, deben ser inactivadas a 56°C durante 30 minutos
paradesnaturalizar los factores del complemento del suero y evitar que interfieran en la prueba.
El antígeno debe poseer Brucella abortus cepa 19, inactivada, a una concentración
standard de 0,00018% v/v.
Como fuente de complemento (C) se utiliza suero normal de cobayo. Éste se conserva
congelado y debe titularse cada vez que se usa. Para la prueba diagnóstico se emplean 5
unidades CH50.
La hemolisina corresponde a un suero hiperinmune contra hematíes de oveja y se utiliza a la
concentración que produce como resultado en ese sistema 12 unidades de CH50.
Los hematíes de oveja se obtienen por punción de la vena yugular en condiciones de asepsia y
con anticoagulante. Posteriormente se lavan por centrifugación y reemplazo del suero por
solución buffer. Se utilizan en una suspensión al 6% v/v.
La Fijación de Complemento es una técnica muy laboriosa y que depende de parámetros muy
estrictos en lo que refiere a la estandarización y titulación de los reactivos. Su aplicación está
limitada a los laboratorios de referencia nacional e internacional y se utiliza generalmente para
confirmar la positividad de otras técnicas. No es de práctica rutinaria, aunque como se
mencionó es la prueba de referencia para el diagnóstico de muchas enfermedades infecciosas
determinadas por la OIE.
Este método también se emplea para identificar, tipificar y/o semicuantificar antígenos: en estos
casos se emplean sueros específicos conocidos y a concentración fija y diluciones de la
muestra en estudio (en la cual se sospecha la presencia de un antígeno). La ausencia de
hemólisis indica la formación de complejos antígeno-anticuerpo debido a la presencia del
antígeno en la muestra, e inversamente, la observación de hemólisis indica que la muestra
carece de antígeno.
121
Bibliografía
POLARIZACIÓN FLUORESCENTE
122
Durante el tiempo que la molécula conjugada con fluoresceína permanece excitada, rota a una
determinada velocidad, produciendo una diferencia entre plano de polarización que la
excita (plano de excitación) y el plano de polarización que emite (plano de emisión), ésta
diferencia se cuantifica y se determina utilizando una fórmula.
Expresión de los resultados: unidades de milipolarización (mp) del suero frente al
antígeno. Cálculo de las unidades de mp de cada muestra.
G = Factor de polarización
El polisacárido O-: Extraído a partir del LPS de cepas lisas de bacterias gram negativas. Estos
antígenos son específicos para cada serotipo y se obtiene a partir de la purificación del LPS.
Ej.: Brucella sp. Salmonella sp.
Estructura de LPS
123
Péptidos: Sólo puede utilizarse péptidos de bajo peso molecular (que no superen los 20
kDa), para que no interfiera su tamaño en una menor rotación del antígeno-trazador libre.
Equipamiento
ASPECTOS METODOLÓGICOS
Protocolo FPA
124
Ventajas:
a) Prueba de glutaraldehído
125
Concentración
Tiempo de reacción aproximada de IgG Interpretación
(mg/dl)
La técnica se basa en la capacidad de los iones pesados de dicha sal de unirse a la porción Fc
de las Igs y hacerlas precipitar. Es un procedimiento rápido y económico, ya que sólo utiliza
una solución de sulfato de zinc que se mezcla con el suero del animal.
Para realizar la prueba, se agrega 0,1mL del suero problema a 6 mL de una solución de Sulfato
de Zinc (de concentración entre 250-400 mg/ml según el protocolo) y se incuba a temperatura
ambiente durante 30 minutos. Various solution.
El resultado puede evaluarse a simple vista (cualitativamente) comparando la turbidez
existente en el tubo de ensayo que contiene el suero del neonato con el tubo que contiene el
suero de su madre. Una menor turbidez en el tubo del neonato indica falla en la transferencia
pasiva de anticuerpos. Esta prueba podría ser también cuantitativa, si la muestra se llevara al
laboratorio para la lectura en espectrofotómetro a 620 nm, previa realización de una curva de
calibración con sueros patrones de concentraciones conocidas.
Es una técnica similar a la prueba de precipitación con sulfato de zinc. La turbidez producida
por el sulfito de sodio al precipitar las proteínas de gran peso molecular (principalmente las Igs)
se determina a ojo desnudo.
Clásicamente, esta prueba se realizaba empleando 3 soluciones de sulfito de sodio de
concentración creciente: al 14, 16 y 18 % de reactivo. La presencia (+), la ausencia (-) o la
ligera turbidez (+/-), son los parámetros para estimar el rango de concentración de Igs en el
suero, según la información volcada en la siguiente tabla:
126
Solución de sulfito
Concentración de Igs de sodio
(mg/ml)
14% 16% 18%
0a1 - - -
Menos de 5 - - +
4a5 - +/- +
6 a 12 - + +
12 a 18 +/- + +
Más de 15 + + +
d) Refractometría
La medición de proteínas séricas totales por refractometría es una buena evaluación indirecta
de la concentración de IgG, principalmente empleada en bovinos. En equinos, en cambio, no
resulta de elección, debido al amlpio rango de valores de proteinemia normales en potrillos
neonatos.
Se utiliza un refractómetro que permite medir el índice de refracción de la luz al incidir sobre
una gota de suero. Es importante tener en cuenta que en los animales clínicamente afectados,
la deshidratación puede causar falsos positivos. Valores de 5.2 g/dl o mayores se asocian en
terneros con una transferencia pasiva adecuada en terneros clínicamente sanos. Si se evalúa
terneros con mal estado general, el valor de corte debiera corregirse a 5,5 g/dL.
d) Inmunocromatografía
En la actualidad existen kit comerciales basados en esta técnica para detectar o incluso
semicuantificar los niveles de IgG séricos, para la especie equina. Su alto costo es la limitante
para su uso. (Ver capítulo correspondiente en esta guía)
Pruebas en laboratorio
a) Inmunodifusión radial
Es la prueba de referencia. Permite conocer la concentración de Igs y a la vez reconocer
clases y subclases de Igs. La desventaja es el tiempo de lectura, de 18 a 24 horas (Ver capítulo
sobre técnicas de interacción secundaria en esta guía).
c) Electroforesis
127
La electroforesis clásica de proteínas séricas sobre cellogel (tiras de acetato de celulosa) es
una técnica rápida y relativamente sencilla, que permite la posterior cuantificación de las
proteínas por densitometría (Ver capítulo correspondiente en esta guía).
d) ELISA
Esta es una técnica de interacción primaria, altamente sensible y específica. (Ver capítulo
correspondiente en esta guía).
- Técnica de Lowry
- Técnica de Bradford
Bibliografía
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management for dairy calves. American Feed Industry Association, Arlington, VA.
2. McGuire TC, Crawford TB, Hallowell AL, Macomber LE. 1977. Failure of colostral
immunoglobulin transfer as an explanation for most infections and deaths of neonatal foals. J
Am Vet Med Assoc 170(11):1302-4.
3. Beetson SA, Hilbert BJ, Mills JN. 1985. The use of the glutaraldehyde coagulation test for
detection of hypogammaglobulinaemia in neonatal foals. Aust Vet J 62(8):279-81.
4. Weaver DM, Tyler JW, VanMetre DC, Hostetler DE, Barrington GM. 2000. Passive transfer of
colostral immunoglobulins in calves. J Vet Intern Med 14(6):569-77. Review.
5. House AM, Irsik M, Shearer JK. 2008. Sepsis, Failure of Passive Transfer, and Fluid Therapy
in Calves. Veterinary Medicine-Large Animal Clinical Sciences Department, Florida Cooperative
Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida.
6. TIZARD, I. “Inmunología Veterinaria”. 8va. Edic. 2009. Editorial Harcourt Grade de España
SA. 592PP.
7. Margni, R. Inmunología e inmunoquímica. 5º Edición. Panamericana – 1996.
8. Blum, J.W., Hammon, H. Livestock Production Science 66 (2000) 151- 159.
128
INMUNOELECTROFORESIS
Materiales necesarios:-
Cuba de electroforesis
Portaobjetos limpios y desengrasados
Cámara húmeda
Agar noble
Solución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8,4-8,6)
Soluciones de antígenos y de anticuerpos a valorar
ASPECTOS METODOLÓGICOS:
Se colocan dos capas de agar sobre un mismo portaobjeto. La primera, denominada
capa de impregnación, contiene una solución de agar al 2% (0,2 g de agar en 10 ml de
solución amortiguadora). Con un hisopo embebido en esta solución, se cubre el
portaobjetos tratando de formar una delgada capa y luego se deja secar.
Los portaobjetos (con la capa de agar de impregnación seca) se colocan en posición
horizontal y sobre ellos se agregan 3 ml de una solución de agar al 1% caliente. Se deja
gelificar a temperatura ambiente.
Se efectúan dos perforaciones en el agar: una con un molde circular (sacabocado) y
otra estrecha y longitudinal. En este momento se extrae el agar sólo de la perforación
circular.
En el recipiente de la unidad de electroforesis (cuba), se coloca la cantidad necesaria de
solución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8.6). Los portaobjetos con el agar perforado
se colocan en la cuba y se establece contacto entre la placa de agar y la solución
utilizando tiras de papel de filtro previamente humedecidas con la solución
amortiguadora (uno de los extremos de la tira se apoya sobre el agar y el otro se
sumerge en la solución amortiguadora).
Se conecta la cuba a la fuente de poder y se ajusta la corriente a razón de 10
voltios/cm. de gel ó 8 mAmp/portaobjeto durante 15 minutos para equilibrar el sistema.
Se desconecta el aparato. Las soluciones de antígeno se colocan en las perforaciones
circulares de las placas de agar utilizando una pipeta Pasteur. Una de las muestras de
129
antígeno deberá estar teñida con azul de bromofenol para indicar el desplazamiento
(frente de corrida).
Se asegura que las tiras de papel de filtro estén bien colocadas y se conecta
nuevamente el aparato, cuidando que la corriente sea correcta.
Cuando se observa que la muestra teñida ha migrado lo suficiente hacia el ánodo para
una correcta separación, se desconecta el aparato y se retiran los portaobjetos de la
cuba. Se remueve el agar del canal para colocar el anticuerpo específico. Esto debe
hacerse con rapidez para evitar la difusión excesiva del antígeno.
Los portaobjetos se incuban en cámara húmeda durante 24 a 48 horas. Para una
correcta interpretación de los resultados, la capa de agar puede teñirse de manera
similar a la descripta para la técnica de inmunodifusión doble. (Ver capítulo sobre
técnicas de interacción secundaria)
Aplicaciones de la inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis permite separar e identificar antígenos o anticuerpos en una mezcla
antigénica debido a su diferente movilidad electroforética, observándose el resultado por medio
de la tinción de las bandas de precipitación que se producen luego de la incubación con el
antisuero.
Es una técnica cualitativa y semicuantitativa, pues se puede estimar la concentración de
antígenos según sean las características de las bandas de precipitación respecto de la muestra
testigo normal. En el caso de la inmunoelectroforesis en placa de agar, a mayor intensidad,
longitud y cercanía de las bandas al lugar de siembra del anticuerpo, mayor es la concentración
inicial del antígeno.
En el diagnóstico de laboratorio de las paraproteinemias, los resultados de la electroforesis de
zona y de la inmunoelectroforesis deberán ser combinados. Así, por ejemplo:
La presencia de un aumento franco o de una espiga en la región gamma en una electroforesis
sugiere fuertemente la presencia de una paraproteinemia monoclonal. No obstante, es
necesario llevar a cabo una inmunoelectroforesis para determinar la clase de cadena pesada y
de cadena liviana de la inmunoglobulina.
La inmunoelectroforesis puede ayudar a distinguir si un aumento en las gammaglobulinas es
policlonal o monoclonal.
La disminución o ausencia de inmunoglobulinas que se observa en diversos trastornos o
deficiencias inmunológicas, pueden ser analizados mediante esta técnica.
La inmunoelectroforesis permite la identificación de cadenas livianas en la orina de enfermos
con discracias de células plasmáticas o trastornos autoinmunitarios, mediante anticuerpos anti–
kappa o anti–lambda específicos. De esta manera se puede confirmar la naturaleza monoclonal
de la proteína de Bence–Jones en el mieloma.
Finalmente, la inmunoelectroforesis es útil para identificar las proteínas presentes en
cantidades elevadas en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con diversas enfermedades
nerviosas.
130
Comparación de un proteinograma con una inmunoelectroforesis.
131
Técnica de inmunoelectroforesis:
Bibliografía
132