JURNAL PRAKTIKUM ANALISIS INSTRUMEN

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

Disusun oleh :

Danny Adi Kurniawan NIM. 16030234010

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA
2019
A. Judul Percobaan : Penentuan Kadar Aspirin Dengan HPLC
B. Tanggal Percobaan : Selasa / 26 Februari 2019
C. Tujuan Percobaan : Menentukan kadar apirin dalam sampel menggunakan HPLC
D. Dasar Teori :

1. Aspirin

Aspirin adalah obat golongan Antiiflamasi non-steroid yang digunakan untuk

mengatasi rasa sakit (analgesik), mengatasi demam (antipiretik). Pada dosis rendah
aspirin dapat digunakan untuk mengatasi trombosis (antitrombotik) sehingga dapat juga
digunakan untuk mencegah serangan jantung.
Aspirin adalah obat antiinflamasi yang menghambat pembentukan
prostaglandin. Aspirin bekerja dengan cara menghambat enzim COX (siklooksigenase).
Sistem enzim COX merupakan enzim yang berperan dalam pembentukan
prostaglandin, dengan kerja penghambatan ini maka aspirin dapat menghasilkan efek
analgesik, antipiretik, antiinflamasi, dan antitrombotik.
Setelah pemakaian oral sebagian aspirin akan diabsorpsi dengan cepat di
lambung, sementara sebagian lagi diabsorpsi di usus halus. Efek obat maksimal dapat
dicapai kira – kira pada 2 jam setelah pemakaian. Setelah diabsorpsi obat segera
menyebar ke seluruh tubuh, sekitar 80% akan terikat pada albumin kemudian
dihidrolisis di hati menjadi asam salisilat dan dieksresi melalui ginjal, keringat dan
empedu. (Muhlisin, 2016)

Menurut Maizan Khairun Nissa (2017) efek samping aspirin yang mungkin ditimbulkan
yaitu:
 Pendarahan organ-organ dalam
Sifatnya yang mengencerkan darah dapat menyebabkan pendarahan di berbagai
tempat dalam tubuh bila dikonsumsi dalam jumlah tak terbatas dan melebihi dosis.
Tempat yang paling sering mengalami perdarahan adalah lambung. Gejala yang timbul
akibat perdarahan akibat aspirin antara lain nyeri perut hebat, feses yang menghitam,
dan urin yang kemerahan.
 Aspirin berbahaya untuk anak-anak
Aspirin dapat menyebabkan timbulnya gangguan serius yang disebut dengan
Sindroma Reye. Pada sindroma ini, terjadi penimbunan lemak di otak, hati, dan organ
tubuh lainnya pada anak, terutama jika obat aspirin diberikan saat anak
mengalami cacar air atau flu.
  Aspirin berbahaya untuk ibu hamil
Aspirin tidak dianjurkan diminum oleh ibu hamil. Obat ini berbahaya bagi janin
karena menyebabkan banyak kelainan bawaan, seperti penyakit jantung bawaan dan
mengurangi berat badan lahir. Hal ini karena aspirin mampu menembus lapisan
plasenta dan mempengaruhi tumbuh kembang janin

2. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan tipe
kromatografi elusi yang paling serbaguna dan digunakan secara luas. Teknih ini
digunakan oleh para kimiawan untuk memisahkan dan menentukan spesi-spesi dalam
berbagai bahan atau senyawa seperti senyawa organik, anorganik, maupun material
biologis. Pada kromatografi cair, fasa gerak merupakan pelarut cair berisi sampel yang
berupa campuran dari bahan-bahan terlarut. Jenis-jenis kromatografi cair kinerja tinggi
(HPLC) biasanya dikelompokkan oleh mekanisme pemisahannya ataupun jenis fasa
diamnya. Pengelompokkan tersebut diantaranya:

 Partisi atau Kromatografi Cair-Cair

 Adsorpsi atau kromatografi Padat-Cair
 Penukar Ion atau Kromatografi Ion
 Size-Exclusion Chromatography (Kromatografi Eksklusi Ukuran)
 Kromatografi Afinitas
 Kromatografi Kiral

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat

digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis
kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit
dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar. Pada prakteknya,
pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu
standar. Oleh karena itu, maka pembandingaan dilakukan dengan menggunakan teknik
kurva kalibrasi.
Ada dua cara pengelusian dalam kromatografi cair kinerja tinggi, yaitu elusi
isokratis dan elusi gradien. Elusi yang menggunakan pelarut tunggal dengan komposisi
tetap atau campuran beberapa pelarut yang komposisinya dibuat tetap disebut elusi
isokratik. Sedangkan pada elusi gradien, digunakan dua atau lebih pelarut dalam suatu
sistem yang memiliki perbedaan kepolaran yang besar / signifikan. Perbandingan dari
kedua atau lebih pelarut ini divariasikan melalui cara yang telah ditentukan dengan
program saat pemisahan berlangsung. Pengubahan perbandingan ini kadang dilakukan
secara terus-menerus dan kadang secara bertahap. Elusi gradien seringkali
meningkatkan efisiensi pemisahan, seperti halnya pemrograman suhu pada GC.
Instrumen HPLC modern biasanya dilengkapi dengan katup yang berpotongan sehingga
dapat memasukkan cairan dari dua atau lebih reservoir dengan perbandingan yang
dapat divariasikan secara terus menerus (Skoog, 2004)
  Fasa gerak
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fasa gerak adalah salah
satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas
pada solven yang digunakan untuk KCKT/HPLC, tetapi ada beberapa sifat umum fasa
gerak yang digunakan, yaitu:

 Murni, tidak terdapat kontaminan

 Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
 Sesuai dengan defektor
 Melarutkan sampel
 Memiliki visikositas rendah
 Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
 Diperdagangan dapat diperoleh denganharga murah (reasonable price)

Menghilangkan gas/gelembung udara dari solven pada HPLC yang

menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat diperlukan, terutama bila
detektor tidak tahan kinerja sampai tekanan 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak
dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga data
yang diperoleh tidak dapat digunakan. Menghilangkan gas juga sangat baik bila
menggunakan kolom yang sangat sensitif terhadap udara (contoh :kolom berikatan
dengan NH2) (Effendy De Lux Putra, 2004).

Komponen dalam instrumen HPLC diantaranya yaitu:

 Reservoir (wadah pelarut / cairan)
 Pompa
 Sistem injeksi sampel
 Kolom, terdiri dari : Kolom analitik / kolom utama, kolom guard, dan termostat
 Detektor
 Komputer

Reservoir merupakan wadah yang menampung cairan-cairan yang akan digunakan

dalam pemisahan. Cairan-cairan tersebut berupa pelarut. Masing-masing reservoir
dihubungkan kepada katup berpotongan, dimana katup ini berfungsi untuk mengatur
cairan-cairan yang masuk / dipompa kedalam kolom.
 Pelarut dimasukkan ke kolom melalui pipa atau selang menggunakan pompa.
Pelarut dipompa dari reservoir sehingga dapat membawa sampel menuju kolom. Pompa
yang digunkan dalam HPLC harus memenuhi kriteria sebagai berikut:
 Harus memiliki aliran terkontrol yang reproducible
 Harus menghasilkan aliran yang ‘pulse-free’ (bebas pulsa, tidak menghasilkan
gelembung)
 Hold-up volume (volume tampungan) kecil
(R.P. Budhiraja, 2004)

Karena HPLC menggunakan tekanan yang cukup tinggi, tidak mungkin sampel
dapat diinjeksikan dengan cara yang sama seperti pada kromatografi gas. Maka dari itu,
sampel dimasukkan melalui loop injector. Sampling loop dapat diganti dan tersedia
pada volume 0,5 mikroliter sampai 2 mililiter. Pada posisi terisi, sampling loop
terisolasi dari fasa gerak dan terbuka terhadap atmosfer. Sebuah syringe dengan
kapasitas beberapa kali dari loop sampling digunakan untuk menempatkan sampel ke
dalam loop.
Kolom yang paling umum digunakan untuk HPLC dibuat dari stainless steel
dengan diameter internal antara 2,1 mm dan 4,6 mm dengan panjang mulai dari sekitar
30 mm sampai 300 mm. kolom-kolom ini dipak dengan 3-10 mikrometer partikel-
partikel silika berpori yang dapat berbentuk irregular atau spherical. Kolom ini
berfungsi sebagai tempat pemisahan berlangsung.
Terdapat dua masalah yang menyebabkan kolom analitik berkurang masa
hidupnya. Pertama, zat terlarut yang mengikat fasa diam secara irreversible
menurunkan performa kolom karena fasa diam yang tersedia menjadi berkurang.
Kedua, material partikulat yang diinjeksikan bersama sampel dapat menyumbat kolom
analitik. Maka dari itu, kolom guard ditempatkan sebelum kolom analitik untuk
meminimalisasi masalah-masalah tersebut. Kolom guard biasanya berisi material
partikulat packing dan fasa diam yang sama dengan kolom analitik, namun jauh lebih
pendek dan murah. Panjangnya 7,5 mm dan harganya satu persepuluh dari kolom
analitik.
Selanjutnya sampel yang telah terpisahkan dibawa menuju detektor. Detektor ini
berfungsi untuk memberikan sinyal sehingga data dapat diolah dan ditampilkan.
Detektor-detektor yang dapat digunakan dalam HPLC diantaranya:
 Detektor Spektroskopi (adsorpsi sinar UV)
 Detektor elektrokimia
Selain itu, ada juga detektor yang menggunakan pengukuran pada perubahan
indeks refraksi dari fasa gerak, namun kurang berguna untuk elusi gradien kecuali
komponen-komponen fasa gerak memiliki indeks refraksi yang mirip (Harvey David,
2000).

 Keuntungan HPLC
HPLC dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (GC). Dalam
banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang
sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada GC, namun pada HPLC zat-zat
yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan
atau tidak menguap maka digunakan HPLC. Namun bukan berarti HPLC menggantikan
GC, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para analis laboratorium.
Derivatisasi juga menjadi populer pada HPLC karena teknik ini dapat digunakan untuk
menambah sensitivitas detektor UV-Vis. Menurut Effendy De Lux Putra
(2004)Keuntungan HPLC dibandingkan dengan kromatografi cair klasik, yaitu:
 Cepat
Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated), waktu analisis kurang dari 5 menit.
 Resolusi
Berbeda dengan GC, Kromatografi cair mempunyai dua rasa dimana interaksi
selektif dapat terjadi. Pada GC, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan
zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
 Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa
gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan
yang diinginkan.
 Sensitivitas detektor
Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat mendeteksi
kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-
detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai
picogram(10-12 gram). Detektor-detektor seperti spektrofotometer massa, indeks
refraksi, radiometri, dll dapat juga digunakan dalam HPLC.
 Kolom yang dapat digunakan kembali
Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom HPLC dapat digunakan
kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum
dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang
digunakan ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik zat – zat yang tidak
 bisa dianalisis dengan GC karena volatilitas rendah, biasanya diderivatisasi
untuk menganalisi spesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion
ideal sekali untuk mengalisis zat –zat tersebut.
 Mudah recovery sampel
Umumnya detektor yang digunakan dalam HPLC tidak menyebabkan kerusakan
pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel
tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor.
Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan, kecuali untuk kromatografi
penukar ion memerlukan prosedur khusus.

E. Alat dan Bahan

 Alat :
1. Gelas kimia 100 mL 2 buah
2. Gelas ukur 10 mL 1 buah
3. Tabung reaksi 6 buah
4. Pipet tetes 6 buah
5. Instrumen HPLC 1 set
6. Labu ukur 100 mL 3 buah
7. Neraca analitik 1 buah
8. Spatula 1 buah

 Bahan :
1. Aspirin 0,1 gram
2. Larutan baku aspirin
3. Aquades secukupnya

F. Prosedur percobaan
1. Penentuan Kadar Aspirin
a. Penyiapan larutan baku

Larutan baku aspirin

1. Dilakukan pengenceran bertingkt

untuk didapatkan larutan standar 10,
20, 30, 40, 50 ppm

Larutan standar aspirin (10, 20, 30,

40, 50 ppm)

1. Diuji dengan instrumen HPLC

2. Dibuat kurva
Persamaan kurva
 b. Pembuatan sampel

0,1 gram aspirin

1. Dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml
2. Diecerkan dengan aquades sampai
tanda batas
3. Diuji dengan HPLC
Panjang gelombang (λ) optimuum larutan

G. Daftar Pustaka
Budhiraja, R.P. 2004. Separation Chemistry. New Delhi : New Age International Ltd.
David, Haervey. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York : McGraw-Hill.
De Lux Putra, Effendy. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang
Farmasi Jurnal, hlm. 5-8.
Ellis, Frank dkk. 2002. Paracetamol-a curicullum resource. United Kingdom : Royal
Society of Chemistry.
Muhlisin, Ahmad. 2016. Aspirin: Kegunaan, Dosis, dan Efek Samping.
https://mediskus.com/aspirin diakses pada tanggal 18 Februari 2018.
Nissa, Maizan Khairun. 2017. Manfaat dan Efek Samping Aspirin, Si Obat Serbaguna.
https://hellosehat.com/hidup-sehat/fakta-unik/baik-buruknya-aspirin-obat-sejuta-
umat/ diakses pada tanggal 18 Februari 2018.
Skoog, dkk. 2004. Fundamentals of Analytical Chemistry. USA : Thomson
Brooks/Cole.