LEONARDO SCOPINHO HEISE

THIAGO HIDEO ENDO

OZÔNIO COMO DESINFETANTE HOSPITALAR: TESTES

PRELIMINARES

Relatório para Estágio Integrativo

Professor Gerson Nakazato e Professora Renata K. T. Kobayashi

Londrina

2019
 1. INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, foi possível observar uma crescente problematização das
bactérias multirresistentes, que acabam surgindo frequentemente em hospitais por
todo o mundo. Com isso em mente, e sabendo que o gás ozônio apresenta ação
contra essas bactérias1, procurou-se explorar essa área ainda não muito estudada.
O ozônio, gás inerte de composição O3, tem sido bastante estudado
ultimamente como antimicrobiano em áreas diversas, principalmente na indústria
alimentícia2 e para tratamento de esgoto3. Porém, ainda não existem muitas
pesquisas feitas relacionando sua aplicação na área hospitalar e em produtos
têxteis. Nosso objetivo é avaliar o potencial do ozônio como antibactericida para
roupas hospitalares e laboratoriais.
Este relatório apresenta os testes preliminares realizados no laboratório, a
fim de determinar se a linha de pesquisa cogitada poderá ser desenvolvida ou não.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Materiais
 Bactéria Escherichia coli (ATCC 25922)
 Bactéria Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
 Béquer
 Caldo nutriente
 Escala McFarland
 Eppendorf
 Frascos de antibiótico
 Gerador de ozônio Aquapura
 Meio de cultura ágar nutriente
 Meio de cultura MacConkey
 Meio de cultura Manitol salgado
 Micropipetas
 Placas de Petri
  Ponteiras de micropipeta
 Salina
 Tubos de ensaio

2.2 Métodos
Para os experimentos, foi necessária a padronização do número de unidades
formadoras de colônia (UFC) de bactéria por mL, e isso foi realizado por meio da
escala McFarland. A escala de McFarland é utilizada como padrão de turvação para
determinar a intensidade da multiplicação bacteriana; ou seja, quanto maior o
número de bactérias, maior será a opacidade do meio de cultura4. As bactérias
utilizadas foram Escherichia coli (ATCC 25922) e Staphylococcus aureus (ATCC
25923)
Para o tratamento do grupo experimental, ozônio gasoso foi borbulhado na
solução, a uma concentração aproximada de 2500 ppm e vazão de 150 mg/h
(concentração fornecida pelo fabricante), utilizando o gerador de ozônio Aquapura
dentro da câmara de fluxo laminar para evitar possíveis contaminações.
Após o tratamento, foram empregados diferentes métodos para plaquear e
colher resultados. Em alguns experimentos, pingou-se triplicatas de 10 µL da
amostra em uma placa com ágar nutriente e observou-se o crescimento. Em outros,
apenas utilizou-se de caldo nutriente para observar o crescimento ou não das
bactérias.
Alguns experimentos necessitaram de mais testes para serem conclusivos.
Testes como a coloração de Gram, procedimento de coloração diferencial que
consiste no tratamento das bactérias com uma série de corantes, lavagens e
contracorantes, permitindo diferenciar as bactérias em 2 grupos (gram-positivas e
gram-negativas), foram utilizados. Também foram utilizados meios seletivos como
o MacConkey e meios diferenciais como o Manitol salgado (seletivo e diferencial)8.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Realizou-se testes para confirmar o que foi lido na literatura e comprovar que
o equipamento em questão produziria quantidade suficiente de ozônio para os
experimentos seguintes.
O primeiro experimento consistiu em tratar 5 mL de salina com bactéria a
uma concentração 1,5 * 108 UFC/mL com ozônio gasoso por 5 minutos, a uma
vazão de 150 mg/h. Em seguida, plaqueou-se 10 µL das diluições das bactérias E.
coli e S. aureus em placas com ágar nutriente e colheu-se os resultados. Como visto
na literatura5, todas as diluições não cresceram (pode-se afirmar que matou até 102
por causa do fator de diluição).
Para remover o fator de diluição e comprovar o fator bactericida do ozônio, o
experimento foi repetido, porém, ao invés de plaquear apenas 10 µL das amostras,
os 5 mL tratados foram separados em 5 tubos de ensaio com salina e observou-se
o crescimento. Novamente, nenhum dos tubos tratados apresentou crescimento.
Esses resultados eram esperados5, 6, já que se trabalhou com um valor de
12,5 mg de ozônio em 5 mL de solução (150 mg/h, em 5 minutos, correspondem a
12,5 mg), ou uma concentração de 2,5 g/L. Mesmo considerando uma perda de
99% para o ar ao borbulhar o gás, a concentração continuaria alta, em torno de 25
mg/L.
Após certificar-se da eficácia do equipamento, procedeu-se para a
determinação do tempo mínimo de ozônio para eliminar os dois tipos de bactérias.
Foram testados tempos diferentes de contato das bactérias com o ozônio, e,
consequentemente, a variação na concentração do gás foi examinada. Testou-se
os tempos de exposição de 5 minutos (concentração de 2,5 g/L, sem considerar a
perda de ozônio para o ar), 3 minutos (1,5 g/L sem considerar perda para o ar), 1
minuto (0,5 g/L sem considerar perda), e 30 segundos (0,25 g/L sem considerar
perda).
Com E. coli, não houve crescimento na placa de 5 minutos. Na placa de 3
minutos, uma colônia cresceu na diluição -4 (portanto, podendo haver uma
concentração inicial de bactérias de 104 a 106 UFC/mL), na de 1 minuto, uma
colônia cresceu na diluição -3 (concentração inicial de bactérias entre 105 e 107
UFC/mL) e na de 30 segundos duas colônias cresceram na diluição 0
(concentração inicial entre 108 e 1010 UFC/mL).
 Já a S. aureus não apresentou crescimento nas placas de 5 minutos, 3
minutos e 1 minuto. Na placa de 30 segundos, apresentou uma colônia na diluição
-2 (concentração inicial entre 106 e 106 UFC/mL). É importante salientar que nas
outras diluições dos grupos experimentais, tanto maiores quanto menores, não
houve nenhum crescimento, o que pode significar contaminação destas placas
especificamente.
Para conferir se houve contaminação ou não, utilizou-se de meios seletivos
e diferenciais para a identificação das bactérias. Nos testes realizados com as
bactérias encontradas nas placas de 3 minutos, 1 minuto e 30 segundos de E.coli
foi utilizado ágar MacConkey. O meio de cultura MacConkey é um meio seletivo que
isola bacilos gram negativos (enterobactérias e não fermentadores) e verifica a
fermentação ou não da lactose7. Houve crescimento de bactérias, porém nenhuma
delas apresentava coloração rosa, o que indica que as bactérias eram bacilos gram
negativos não fermentadores de lactose, indicando também que as bactérias
testadas muito provavelmente não eram E. coli, mas sim uma contaminação.
No teste realizado com as bactérias encontradas na placa de 30 segundos
de S. aureus foi utilizado o ágar Manitol salgado. O Manitol salgado é um meio salino
que contém um indicador de pH que muda de cor se o manitol do meio é fermentado
a ácido4. Houve crescimento e mudança de coloração, indicando que a bactéria foi
capaz de sobreviver no meio hipertônico e realizar fermentação do manitol, o que
indica também que a bactéria testada provavelmente era de fato a S. aureus, que
pode ter resistido ao tratamento de ozônio.
Também foram feitos dois experimentos utilizando um conceito inverso dos
experimentos acima: borbulhou-se ozônio em salina descontaminada, e essa salina
foi introduzida em meios com bactéria. Ou seja, procurou-se descobrir se o ozônio
também era capaz de agir de forma indireta, sem borbulhar o gás diretamente nas
bactérias. No primeiro experimento, houve contaminação da salina utilizada,
atrapalhando os resultados obtidos. No segundo experimento, as placas, após
tratadas com ozônio, tiveram alteração de cor em suas partes, porém não foi
possível afirmar o porquê desta mudança. Logo, estes dois experimentos não
proporcionaram resultados significativos.
 4. CONCLUSÃO

É possível concluir que o ozônio, a uma concentração de 2,5 g/L, sem

considerar a perda de gás para o ambiente, é capaz de reduzir a concentração de
bactérias E. coli e S. aureus em 100%. Em tempos de exposição menores (e
consequentemente concentrações menores), de 3 minutos, 1 minuto e 30
segundos, também houve redução de 100%, embora, por conta das contaminações,
seja interessante refazer o experimento para garantir a eficácia.
Ao utilizar o inverso, e borbulhar ozônio na salina antes da introdução das
bactérias, os resultados foram inconclusivos, necessitando de mais experimentos
para chegar a uma conclusão definitiva.
Também se conclui que é necessário, no futuro, buscar testes padronizados
para experimentos semelhantes.
 REFERÊNCIAS

1. LÜDDEKE, F. et al. Removal of total and antibiotic resistant bacteria in

advanced wastewater treatment by ozonation in combination with different
filtering techniques. Water Research, 2015.
2. ÖLMEZ, H.; AKBAS, M. Y. Optimization of ozone treatment of fresh-cut green
leaf lettuce. Journal of Food Engineering, 2009.
3. LEE, Y.; GUNTEN, U. V. Oxidative transformation of micropollutants during
municipal wastewater treatment: Comparison of kinetic aspects of selective
(chlorine, chlorine dioxide, ferrateVI, and ozone) and non-selective oxidants
(hydroxyl radical). Water Research, 2010.
4. CASTRO, Vera Lúcia S. S. de. Validação de testes de biopesticidas em
mamíferos: princípios e identificação de fatores componentes da incerteza.
Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, 2008.
5. CARDOSO, Claudia Catelani et al. Disinfection of Hospital Laundry Using
Ozone Microbiological Evaluation. Infection Control and Hospital
Epidemiology, 2000.
6. YEARGIN, Thomas et al. The survival and inactivation of enteric viruses on
soft surfaces: A systematic review of the literature. American Journal of
Infection Control, 2016.
7. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de
Saúde. 1 ed. Brasília (DF): Editora Agência Nacional de Vigilância Sanitária,
2000.
8. TORTORA, Gerald J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia.
10 ed. Porto Alegre: Artmed, 2012.