UNIVERSIDAD NACIONAL MESA

N° 1
AGRARIA LA MOLINA
FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Practica N° __6__
DETERMINACIÓN COLORIMÉTRICA DE UNA SUSTANCIA BIOLÓGICA
DETERMINACIÓN DE CREATININA

Integrantes:
- AGUILAR, ALEX

- BADAJOZ, ATHENEA

- FLORES RIVERA, ERIKA

- MURGA VILLAREAL, DENNYS

- NIQUEN CURO, JORGE

Grupo: E*

Fecha de la práctica: Jueves 11/05/2017

Fecha de entrega del informe: Jueves 25/05/2017

2017
INTRODUCCIÓN

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina

básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se
quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de
enfermedades, así como para otros muchos propósitos.

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se

basan en la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, para la formación
de derivados químicos, o la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.

En el presente informe trabajaremos por reacciones colorimétricas en las cuales los enlaces
peptídicos de ciertos aminoácidos reaccionan y los productos coloridos son los que se
cuantifican.

Para los métodos colorimétricos se necesita una: Curva patrón

Es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de una sustancia (por

ejemplo la albúmina sérica bovina) que se utiliza para determinar la cantidad de proteínas
presente en una muestra incógnita.

En determinaciones colorimétricas, se cumple una relación proporcional entre la magnitud o

intensidad de color que da una reacción y la cantidad del reactivo que la provoca.

La intensidad de color se mide con un espectrofotómetro o colorímetro en función de las

concentraciones crecientes de la sustancia se obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidad de
proteína, mayor cantidad de producto de reacción y por lo tanto, mayor intensidad de color.

La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya

concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos)
que absorben también a esa longitud de onda. Se debe descartar la absorbancia de las
interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todos los
componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la
absorbancia de éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el
blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmitancia. (Rocca
P., 2003, Bioquímica: Técnicas y métodos).
RESULTADOS

Absorbancia
Grupo
Solución blanco Solución estándar Muestra problema

M1 0,077 0,289 0,135

M2 0,085 0,229 0,131

M3 0,095 0,244 0,154

M4 0,075 0,230 0,149

M5 0,064 0,255 0,136

M6 0,063 0,225 0,108

PROMEDIO 0,459 1,472 0,813

Calculo de la concentración de creatinina en la sangre

100mg---------100ml
x -----------0,6ml x=0,6 mg

0,6mg---------100ml(solución estándar )
x -----------3ml x=1,8x10-2

1,8x10-2mg---------4,5ml
x -----------------1ml x=4x10-3

CM=(CST/AST)xAM
CM=(4X10-3 / 1.472)x0,813
CM=2,21x10-3
2,21x10-3-----------1ml
x -------------4,5ml X=9.94x10-3

9,94x10-3-----------3ml
X -------------20ml X=0,0663

0,0663---------------2ml
X ----------------100ml X=3.32mg%
DISCUSIONES

La creatinina es el resultado de la degradación de la creatina, un residuo nitrogenado

elaborado por el hígado y el riñón y finalmente almacenado en el músculo donde se utiliza
como reserva de energía celular. A medida que el musculo utiliza creatina, se forma creatinina
que, al ser soluble, pasa al torrente circulatorio y se filtra en el glomérulo junto con la
proveniente de la dieta. La creatinina no se absorbe en los túbulos y se secreta en escasa
cantidad (10 % a 15%) por lo que resulta el candidato ideal para calcular la filtración
glomerular para no tener que usar el de inulina. Debido a que el mayor productor de
creatinina es el musculo, existe una relación entre los niveles de creatinina con la edad y el
género. Por otro lado el balance de creatinina (entre aporte y excreción) puede alterarse por
causa de una dieta con alto consumo de carne y situaciones con daño o consumo muscular
endógeno. (Dvorkin, 2010).

Como el nivel de creatinina esta relacionando con la masa muscular el valor de la creatinina en
vacunos será mayor que en humanos, alcanzando 1.5 mg/dl en la práctica de laboratorio tras
la evaluación de la sangre se obtuvo como 2.3523 mg/dl de concentración de creatinina. Como
se puede observar el valor obtenido difiere bastante del valor normal.

Creatinina, nivel sanguíneo (creatinina sérica)

Resultados normales

 Adultos:
-Mujeres: 0.5-1.1mg/dl o 44-97 mmol/1 (unidades del SI)
-Varones: 0.6-1.2 mg/dl o 53-106 mmol/1 (unidades del SI)
 Ancianos:
-La disminución de la masa muscula puede producir niveles bajos
 Adolescentes: 0.5-1.0 mg/dl
 Niños: 0.3-0.7 mg/dl
 Lactantes: 0.2-0.4 mg/dl
 Recién nacidos: 0.3-1.2 mg/dl

Valores críticos posibles >4mg/dl (indican disfunción renal grave)

La creatinina, al igual que en el caso del nitrógeno ureico en sangre, se elimina por completo
por los riñones, y por tanto es directamente proporcional a la función renal excretora. Por
consiguiente, si la función excretora renal es normal, el nivel sérico de creatinina debe
permanecer constante y normal. (Deska, 2008).

Entonces de darse el caso de que una persona tenga una concentración de 2.3523 mg/dl de
creatinina, se presentarían como consecuencia, severos trastornos renales como la
glomerulonefritis, pielonefritis, necrosis tubular aguda y obstrucción urinaria.
CONCLUSIONES

- El ensayo del laboratorio nos permitió determinar la concentración de una muestra

no conocida, a partir de una solución estándar de concentración conocida y de su
absorbancia, este método es el de factor de calibración.

- Para poder determinar la concentración de cualquier compuesto en la sangre, es

necesario realizar una desproteinización, ya que la presencia de proteínas perturba la
medición.

BIBLIOGRAFIA

 Roca, Maria del Pilar. Oliver, Jordi. Rodriguez, Ana María. Bioquímica: Técnicas y
métodos. Editorial Hélice. Primera Edición. 2003.
 Kathleen Deska Pagana, 2008, Guía de pruebas diagnósticas y de laboratorio, 8va
edición, editorial pagana, España, pág. 313-314.
 Mario A. Dvrokin, Daniel P. Cardinali, 2010, Bases Fisiológicas de la Practica Medica,
14va edición, editorial Panamericana, España, pág. 31.

CUESTIONARIO

1. Una suspensión de E.Coli da una absorbancia de 0,793 a 260 nm en una celda de 1

cm a ph 4,5. Si el E1 cm1% es 197, calcular la concentración en mg/mL.

A= 0,793
E1 cm1%= 197 = Absorbancia específica de 1%(p/v) en una celda de 1cm.

E1 cm1%= A%C*b

197= 0,793%C x1 → % C=0,00403

0,00403 g_______100ml
0,0000403g______1 ml

0,0000403g/ml x 1000mg1g = 0,0403

2. Calcule el coeficiente de extinción molar a 361nm para la acuobalamina en tampón

fosfato 0.1M a pH 7,0 a partir de los siguientes datos obtenidos en una celda de 1cm
Solución Conc. X 10-5M Io I

A 2.23 93.1 27.4

 B 1.90 94.2 32.8

Solución A

A: -log(27.4/93.1) = 0.531

C: 2.23 10-5M

I: 1cm

A=εx C x I

0.531 = ε x 2.23 10-5M x 10-2

ε = 23.811

Solución B

A: -log(32.8/94.2) = 0.458

C: 1.90 10-5M

I: 1cm

A= εx C x I

0.458 = ε x 1.90 10-5M x 10-2

ε = 24.105

3. En una determinación de glucosa se obtuvieron los siguientes resultados:

Glucosa (mg%) 50 75 100 125 150 175 200 250

Transmitancia % 92,9 89,9 86,3 84,3 81,3 78,7 73,8 70,5

Hallar el factor de calibración promedio y la concentración de dos muestras de suero

que resultaron con transmitancia de 88,3 y 85,1.

Absorbancia 0,032 0,0462 0,064 0,074 0,09 0,1040 0,132 0,152

A= 2-logT

Fc1 = 0.50 mg/ 0.032 = 15.625 mg

Fc2 = 0.75 mg/ 0.046 = 16.304 mg
Fc3 = 1.00 mg/ 0.064 = 15.625 mg
Fc4 = 1.25 mg/ 0.074 = 16.892 mg
Fc5 = 1.50 mg/ 0.090 = 16.667 mg
 Fc6 = 1.75 mg/ 0.104 = 16.827 mg
Fc7 = 2.00 mg/ 0.132 = 15.152 mg
Fc8 = 2.50 mg/ 0.152 = 16.447 mg
FcPromedio = (Fc1+ .........+ Fc8 ) / 8 = 16.0565
Cálculo de la concentración:
Amp = 2 - T%
Amp1 = 0.054
Amp2 = 0.070
Cmp = Fc x Amp
Cmp1 = 16.0565 x 0.0540 = 0.8611 mg/mL
Cmp2 = 16.0565 x 0.0700 = 1.1239 mg/mL

4. Para evaluar un metabolito “x”, una muestra fue sometida a dilución tomando una
parte de ella con 4 partes de agua y luego fue comparada espectrofotométricamente
con un estándar de 10 mg/mL obteniéndose las siguientes lecturas de absorbancia
blanco = 0.023 estándar 0.357 muestra 0.677. Calcule la concentración de la muestra
en mg%.

Ablanco = 0.023
AST = 0.357
AM = 0.677
[st] = 10 mg/mL
[M] = 0.25 mg / mL

Ast corregido = Ast - Ablanco = 0.357 - 0.023 = 0.334

Amp corregido = Amp - Ablanco = 0.677 - 0.023 = 0.654
volumen = 0.2
Cmp = Cst x Amp /Ast = 10 mg/mL x (0.654/0.334) = 19.5808 mg/mL

5. ¿Qué es el factor de dilución? Explique mediante un ejemplo

El factor de dilución se puede definir como el número de veces que una disolución es más
diluida que otra y se calcula dividiendo la concentración de la disolución más concentrada por
la más diluida.

El factor de dilución es el inverso de la dilución; inverso significa que invierte los dos números
de la fracción. Cuando se realiza por ejemplo un recuento de bacterias aerobias mesófilas, el
factor de dilución indica el número por el cual hay que multiplicar el número de bacterias
encontradas en las placas, para conocer cuánto hay en 1 mL original de la suspensión
bacteriana.

6. ¿Qué es el factor de calibración? Explique mediante un ejemplo

La ecuación simplificada de la ley de Lambert-Beer

A = ε.d.c

Comprende la mínima ecuación que relaciona la concentración (c), la absorbancia de la

muestra (A), el espesor recorrido por la radiación (d) y el factor de calibración (ε). El factor de
calibración relaciona la concentración y la absorbancia de los estándares. Es una constante
propia de la sustancia absorbente, cuyo valor numérico depende de la longitud de onda de la
luz incidente y de la naturaleza química del solvente en que está disuelta la sustancia en
estudio. Por ejemplo: Se puede determinar la concentración o la abrsorbancia a partir del
factor de calibración.
 El coeficiente de extinción molar del NADH es 6220 cm-1 M-1 ¿Cuál será la
concentración de una muestra que tiene una absorbancia de 0.720 diluida la mitad y
puesta en una cubeta de 1 cm de espesor?

A = axbxc 0.720 = 6220x1xc

c = 1.16 mg/ml

8.-Diferencias entre una solución stock, solución estándar y solución trabajo.

Solución stock Solución estándar Solución trabajo

 Se denomina solución  Son soluciones de  Solución de

madre o stock a
composiciones
concentradas de
nutrientes las cuales están
formuladas por sales
minerales que se emplean
en un medio particular.
 Debido al elevado número
de compuestos que
incluye y a que algunos de
ellos se emplean a muy
baja concentración,
resulta más práctico
preparar soluciones
madre o "stocks"
concentrados.
 Hace más rápida la futura
preparación de medios y
minimiza los errores, ya
que La composición de
una solución se debe
concentración conocidas. concentración no
 Suficientemente estable conocida.
en el tiempo para  Realización de
determinar su operaciones
concentración una vez (no matemáticas en
se necesita determinar función de la
nuevamente su concentración
concentración cada vez conocida de otra
que se utilice) solución para la
 Reacción rápida con el determinación de la
analito concentración
 Reacción más o menos desconocida.
completa para alcanzar el
punto final.
 Reacción con el analito
por medio de una
reacción selectiva que
pueda ser descrita por
una ecuación química
balanceada.
 medir en términos de
volumen y masa.

9.- ¿Qué función bioquímica cumple la creatinina? Escriba su formula

El mejor parámetro bioquímico sanguíneo de la función renal es la creatinina. En principio,

cuanto mayor es el descenso de la función renal, tanto más elevado es el valor de la creatinina
sérica.

Los aminoácidos glicina, arginina y metionina forman en el hígado creatina, que por
fosforilacion da la fosfocreatina, que circula por la sangre hacia el musculo y cerebro, y
solamente en cantidades traza se elimina por la orina. La fosfocreatina acumulada en el
musculo es un depósito de energía y con la pérdida del fosforo se convierte en creatina, la cual
por deshidratación pasa a creatinina. La creatinina es, por tanto, el anhídrido de la creatina, la
cual una vez que pasa a sangre no vuelve a ser utilizada y se excreta de forma constante por la
orina.

Formula:C4H7N3O

10.- ¿Qué papel cumplen los siguientes reactivos en la cuantificación de creatinina?

Tungstato de sodio: Utilizado en el método de desproteinizacion .Este ácido es utilizado como

desproteinizante al desnaturalizar y precipitar la proteína por cambio brusco de pH

Ácido sulfúrico: Utilizado en el método de desproteinizacion: agregado de ácido sulfúrico en la

mezcla de la sangre con el tungstato de sodio.

Ácido pícrico: Reacción de Jaffe: formación de ácido picramico (compuesto coloreado)

formado por reducción, al ponerse en contacto la creatinina con el ácido pícrico en medio
alcalino. La intensidad de la coloración es directamente proporcional al contenido de
creatinina cumpliendo con la ley de Lambert y Beer, así de esta manera se podrá obtener la
absorbancia requerida.

11.- El coeficiente de extinción molar de un complejo yodo-glucógeno a 450nm es 0.20.Calcule

la concentración del glucógeno en una solución de complejo en yodo que tiene una
absorbancia de 0.36, medida en una cubeta de 3cm.

A = ξ.l.c

0.36 = 0.20. 3. C

C= 0.6