Niken Dyah Ariesti , S.Farm.Apt.M.

Si
 PENGERTIAN

 Kromatografi diturunkan dari bahasa

Greek
Chromato : warna
Grafe : tulisan
 SEJARAH
 Runge,F.F ( 1834 -1843 ) melakukan spot test
campuran zat warna dari ekstrak-ekstrak tumbuhan
pada pita kain dan atau kertas.
 Goppel Scoeder,F (1868) menganalisa zat warna,
hidrokarbon, alkohol-alkohol, beer, milk pada
minuman dan air minum mengunakan kertas.
 Day DT ( 1897 – 1903 ) menggunakan kolom yang
diisi serbuk tanah untuk pemisahan.

Dengan perkembangannya nama KROMATOGRAFI

tidak sesuai lagi.
 Dasar pemisahan :
Perbedaan kecepatan migrasi komponen
( senyawa-senyawa )yang dibawa oleh fase
gerak dan ditahan secara selektif oleh fase
diam.

 Tujuan kromatografi
Pemisahan senyawa-senyawa dengan
waktu yang tidak lama.
 KEUNTUNGAN METODE
KROMATOGRAFI
 Kromatografi merupakan suatu proses berlipat ganda
Artinya : selama proses kromatografi terjadi banyak
terulang kali kontak adsorbsi dan partisi komponen
yang dipisahkan.
 Jangkauan analisis kuantitatif dan kualitatif sangat
luas dari kadar sangat tinggi sampai sangat rendah.
 Dapat dilakukan dengan mudah,cepat, perlu
operator yang ketrampilan baik,
berpangalaman, pengetahuan teori memadai.
 Biaya relatif murah dengan bahan yang
mudah didapat bahkan pelarut pengembangan
dapat dipakai beberapa kali.
 Ketelitian dan ketepatan yang memadai.
 PENGGOLONGAN
KROMATOGRAFI
 Atas dasar mekanisme pemisahan
1. Kromatografi Serapan.
2. Kromatografi Partisi .
3. Kromatografi Ekslusi.
4. Kromatografi Penukar ion.
5. Kromatografi Afinitas.
 BEBERAPA ISTILAH:
Fase Diam : Padatan atau cairan tempat untuk
menotolkan campuran zat yang akan dipisahkan
 Fase Gerak : Zat cair atau gas yang membawa
zat yang akan di-elusi-kan / didistribusikan dan
akan dipisahkan pada fase diam sehingga
masing-masing komponen dapat memisah
 Elusi : Proses terbawanya solut dari puncak
kolom sampai akhir kolom
 Apabila detektor ditempatkan pada ujung
akhir kolom, akan diperoleh signal yang
digambarkan sebagai fungsi waktu yang
disebut kromatogram.
 Waktu retensi adalah waktu yang
menunjukkan puncak signal.
 Volume retensi adalah volume fase
gerak yang dibutuhkan untuk membawa
pita solute dari titik injeksi hingga melalui
 Atas dasar bentuk fase gerak :
1. Kromatografi gas ( fase geraknya : gas )
2. Kromatografi cairan ( fase geraknya : zat cair )

 Atas dasar bentuk fase diam :

1. Kromatografi Planar
a. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
b. Kromatografi kertas
2. Kromatografi Kolom
a. Kolom terbuka.
b. Kromatografi gas
c. KCKT
 MEKANISME PEMISAHAN
1. Unsur elektronegatif
2. Ikatan kovalen
3. Momen dipol
4. Polar dan non polar
5. Ekstraksi pelarut
6. Koefisien distribusi = koefisien partisi
Kd = D
7. Counter Current Craig Extraction
( pemisahan secara partisi )
 Pelarut organik yg sering digunakan
sebagai fase gerak ( deret eluotropik )
non polar Parafin cair
PE
Sikloheksana
Karbon tetraklorida
Benzena
Toluenea
Kloroform
Dietileter
Etilasetat
Aseton
n-propanol
etanol
asetonitril
methanol
polar air
 FASE DIAM
 SILIKA
Silika gel tanpa pengikat ( silika gel H dan N )
silika gel dengan pengikat ( silika gel G )
silika gel dengan pengikat dan zat berfluorosensi
( silika gel GF )
silika gel untuk kolom kromatografi (preparatif)
 Alumina
 Selulosa
 KROMATOGRAFI SERAPAN
Untuk memisahkan suatu campuran, kolom diisi dengan
penyerap zat padat seperti alumina sebagai fase tetap dan
dialiri pelarut (benzena) sebagai fase gerak.

Kmd sejumlah kecil cuplikan dari campuran dimasukkan

melalui sebelah atas kolom yang kemudian membentuk
jalur-jalur serapan senyawa.

Kecepatan bergerak dari suatu komponen tergantung

pada berapa besarnya zat terhambat / tertahan oleh zat
penyerap di dalam kolom.
 Pemisahan terjadi karena perbedaan laju
turun masing-masing komponen dalam
kolom, yang ditentukan oleh kekuatan
adsorpsi atau koefisien partisi antara fasa
mobil dan fasa diam (stationer).

 Elusi aliran fasa gerak terus menerus

hingga campuran terpisah sempurna
menjadi komponen-komponennya
Mekanisme pemisahan secara adsorbsi
 Jika lebih terikat pada fase diam
senyawa akan lebih lama terikat
 Jika lebih terikat fase gerak
senyawa akan terlarut
MEKANISME SECARA PARTISI

(HB) faseatas
Kd 
(HB) fasebawah
 jika Kd = 1 , berat Hb total = 1000 mg
Maka yang terlarut dalam air : 500 mg
dalam eter : 500 mg
( HB ) eter
Kd 
( HB ) air
( HB ) eter
1 
( HB ) air

(HB) air = ( HB ) eter

 Pemisahan:

1. Penggojokan ke sekian kali

2. Terpisahnya senyawa – senyawa yang

mempunyai Kd berbeda
 kd  0,2

kd 1,0
kd  5,0

20 40 60

Jika lebih dari 1 senyawa dengan kd

berbeda-beda , semakin besar kd maka
perpindahan akan lebih cepat
 MEKANISME PEMISAHAN
SECAR EXKLUSI
 Prinsip : pemisahan komponen oleh gel didasarkan pada
perbedaan ukuran besar atau kecil molekul-molekul
komponen

 Molekul-molekul ( larut ) , komponen kecil masuk dalam

jaringan polimer ( gel ) sehingga gerakan dihambat .
Sedangkan molekul besar tidak dapat memasuki jaringan
polimer dan keluar kolom lebih cepat dibawa fase gerak.
 Fase diam ( dalam kolom )
Gel ionik : berpori banyak dan sama rata ukuran
bentuk.
misal : sephadex
Dibedakan 2 gel :
1. Gel Filtrasi : polimer sukrosa atau dextran yang
membengkak dalam air.
2. Gel permeasi : polimer membengkak dalam
pelarut organik.
Mekanisme Pemisahan Penukaran ion
 Dasar pemisahan :
perbedaan kekuatan interaksi ion terlarut dengan
resina ( fase diam ).
 Senyawa terlarut ( linarut ) yang berinteraksi lemah
akan keluar lebih cepat, dan senyawa yang berinteraksi
kuat akan ditahan lebih lama di dalam kolom, maka
keluar kemudian.
 Proses dimana solut ion dalam fase gerak dapat
bertukar dengan ion yang bermuatan sama yang terikat
secara kimiawi pada fase diam.
 Fase diam : resin buatan organik atau an organik.
Contoh : polistirena kation
polistirena anion
polidextran : pemisahan protein

 Fase gerak
contoh : air + anion
air + kation
PEMISAHAN SECARA AFINITAS
 Prinsip : interaksi yang sangat spesifik antara solute
dengan molekul yang terikat secara kovalen pada fase
diam.
 Memisahkan senyawa yang sangat spesifik.
 Contoh :
molekul antibodi terikat secara kovalen dengan fase
diam . Jika campuran berisi 500 protein yang dilewatkan
kolom , hanya satu protein yang bereaksi dengan
antibodi yang terikat pada kolom.
 Setelah pencucian ( 500 – 1) protein keluar dari
kolom .
 Protein yang diinginkan dilepaskan dari antibodi
dengan perubahan PH fase gerak atau kekuatan
mengionkan fase gerak.
 Contoh :
Mol Coplanar mempunyai ggs Cis-diol dapat
dipisahkan dari campuran kompleks ( nukleotida)
dengan cara melewatkan pada kolom dengan asam
fenil buronat terikat.
 Nukleotida yang tidak ada gugus cis-diol akan
keluar

 sedangkan nukleotida dengan gugus cis-diol

akan ditahan . Setelah dielusi buffer sitrat
nukleotida cis diolakan keluar.
TERIMA KASIH