NOMBRE: CARLOS HUMBERTO LANDA No.

CONTROL 162T0397 12 DE FEBRERO DE 2019

MOTA
ACT 4: INVESTIGAR Y APLICAR TECNICAS MATERÍA: MICROBIOLOGÍA DOCENTE: ING. IRMA
ACTUALES DE AISLAMIENTO, CASTILLO CARMONA
PURIFICACION, PROPAGACION,
CONSERVACION Y IDENTIFICACION DE
MICROORGANISMOS
BIBLIOGRAFIA:

Arencibia, Daniel & Gámez, Rafal & Alfredo Rosario, Luis. (2008). Métodos generales de conservación de
microorganismos.

Prescott, L.; Harley, J.; Klein, D. 1999. Microbiología. Cuarta edición. McGraw-Hill Interamericana.

Gutierrez, S. (Enero, 2002). Identificacion microbiana. Febrero 12, 2019, de desconocido Sitio web:
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/08_Tema_12_identificaci%C3%B3n.pdf
TECNICAS DE AISLAMIENTO, PURIFICACION, PROPAGACION,
CONSERVACION E IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS.

INTRODUCCIÓN
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos
métodos que permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es
posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de
microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de
microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente
determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. Al
efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo,
existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar
precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en
estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también
las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo
se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la incubación
condiciones tales como la temperatura, aireación, la luminosidad. La aplicación de
estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos
mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de
este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La
forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito
específico del estudio.

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de

éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población
de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando éste
contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o
axénico, cuando contiene más de una especie de microorganismos se denomina
cultivo mixto.

Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es

conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. Un cultivo
axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula.
Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por
ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-existen cultivos mixtos. En un
cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta.

Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener

un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los
microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en
los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos
microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un
cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso para obtener un cultivo
axénico es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un
medio sólido o líquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo
microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Un clon
está constituido por una población de células descendientes de un solo
microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser
visible sobre la superficie de un medio sólido. Un cultivo microbiano que ha estado
creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un
medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden
continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos básicos
referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y
concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar.

Imagen 1: Cultivo axenico

Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas
Los utensilios utilizados para la transferencia de muestras son los siguientes:

Hisopo, pipeta (para uso microbiológico son terminales y la parte superior o

boquilla debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta pasteur, cable de Kolle
o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o
gancho.

En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación,

hisopos, pipetas o pipetas pasteur que deberán esterilizarse previamente. La
utilización de estos dispositivos, así como de los diferentes medios de cultivo tiene
aplicaciones específicas. Por ejemplo:

Los medios líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con

tapones de algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser transferido
mediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inóculo se
deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo de cultivos los
microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la
superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que presenta este tipo
de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de
microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las
poblaciones se encuentran suspendidas y es fácil homogenizarlas, lo que permite
estandarizar la concentración del inóculo. La desventaja que presentan, es que en
ellos e difícil detectar contaminación a simple vista.

Imagen 2: medio de cultivo liquido

Los medios semisólidos se preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra
(asa recta) o pipeta pasteur; en este último caso es necesario calentar el medio y
cuando se encuentra en estado líquido y a una temperatura de aproximadamente
42ºC se agrega el inóculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se
emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la
separación de microorganismos con diferentes requerimientos de oxígeno.

Imagen 3: medio de cultivo semisólido

Los medios sólidos se preparan en tubos o matraces dependiendo de la

cantidad o de las necesidades, después de esterilizarlos, estos se inclinan o
vierten en cajas de petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie
del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al
multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos
agregados se les denominan colonias, las que presentan características que
varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado. En
cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aun
cuando la mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos
requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se
favorecerá el crecimiento del microorganismo de interés y la obtención del cultivo.
Con este mismo propósito durante la incubación se deben proporcionar las
condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento óptimo
de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría de las veces
están relacionadas con la de su hábitat natural. Algunos microorganismos crecen
por debajo de 15ºC, otros requieren temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) y
algunos hasta 80ºC. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar
una incubadora microbiológica o un baño de agua a temperatura constante, en
tanto que para lo microorganismos que presentan su crecimiento óptimo a
temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del
laboratorio, a temperatura ambiente. En general las incubadoras microbiológicas
satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por
los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan
con aíre seco, lo que determina la deshidratación de los medios de cultivo. Por lo
tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en
incubadora no debe prolongare por más de nueve días.

Con relación a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en

presencia de oxígeno atmosférico; los que sólo crecen en presencia de aíre se
llaman aerobios obligados; los que sólo crecen en ausencia de oxígeno se
denominan anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las
dos condiciones y se le conoce como facultativos. Existe una cuarta categoría
que comprende bacterias que requieren oxígeno, pero sólo lo utilizan cuando éste
existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaerofílicos.

El desarrollo de estos diferentes grupos se favorece mediante la agitación de los

cultivos o mediante la exclusión de oxígeno para lo que se emplean sustancias
reductoras o equipos especiales. Las bacterias son organismos procarióticos, se
encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, el suelo,
en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre.
Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como
parásitos, comensales o mutualistas. Fisiológicamente este grupo presenta
características muy variables, hay bacterias móviles e inmóviles fotosintéticas y
quimiotróficas, autótrofas y heterótrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de
temperatura, pH y condiciones gaseosas. En el estudio de cultivos bacterianos
algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño,
morfología celular, forma de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación
de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y características
culturales en medios líquidos y sólidos en los que presentan patrones de
desarrollo en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.

Imagen 4: medio de cultivo solido

Técnicas de siembra

Método de siembra por estría en placa

Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello,
con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a
continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en
una placa Petri (a las placas Petri también se les denomina simplemente placas).
Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van
depositando en la superficie del medio menos microorganismos.

Se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y
se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar
aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. A
continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las
células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar
colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado
de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron
depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para
asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el
procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las
colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad,
cultivos axénicos.

Métodos de vertido en placa y extensión en placa

En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de
su siembra en placa. Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene tantos
microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. Por
ejemplo, una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser diluida
10 veces para obtener una suspensión con un centenar de células por mililitro, Por
tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en
diez, pero a veces de cien en cien.

Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión

bacteriana a 9 ml (de medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita
vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea
necesario. A continuación, se puede proceder de dos maneras diferentes.

En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar

fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y
otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán
más grandes.

En el segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se siembran

directamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con ayuda de un
asa de Diralsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las
células microbianas sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban
hasta la aparición de las colonias. Como en el método de siembra por estría, no
existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por
extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido en placas
sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso.
Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten
obtener un mayor número decolonias aisladas que el método de siembra por
estría, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una
mezcla con varios tipos de microorganismos.

Para obtener un cultivo axénico mediante este método:

(a) Hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener una
muestra con sólo unos pocos cientos de bacterias-

(b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusión, mezclar y verter el

contenido en una placa Petri.

(c) Después de la incubación, se desarrollan colonias en el agar (más pequeñas)

y en su superficie (más grandes).

Método de aislamiento por siembra por estría en placa: Para obtener un cultivo
axénico:
(a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero.

(b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra.

(c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa
Petri, y

(d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer

un segundo grupo de estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso
una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan
y se separen células aisladas.

(e) Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro

de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia
aislada y sembrar por estrías una segunda placa.
El crecimiento de los cultivos axénicos
Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le
hace crecer de nuevo). Seguramente, el investigador deseará obtener más células
para poder trabajar con ellas. Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se
ha de preparar un medio de cultivo, líquido o sólido, con todos los nutrientes
necesarios para su crecimiento. Los medios sólidos se hacen generalmente,
añadiendo agar a los líquidos.

TECNICAS DE CONSERVACION

Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y

se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el
agua se congela. De esta forma, al no disponer las células de agua en forma
líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así
conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de
conservación desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de
requerir aparatos especiales, y además existe el peligro de que algún fallo del
sistema produzca una subida no deseada de la temperatura durante el
almacenamiento. También resulta ser el método más molesto para realizar el
envío de las cepas. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad
de las células conservadas por este método son los siguientes:

- Edad de las células: En la mayoría de los casos conviene utilizar células

maduras del inicio de la fase
estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que
presenten en su ciclo vital algún estado que les prepare para la resistencia a
condiciones adversas, es preferible alcanzar este estado. Esto sucede en el caso
de microorganismos que esporulan, en algunos pleomórficos e incluso en algunos
más sencillos.

- Velocidad en la congelación y descongelación: Aunque hay programas de

congelación bien estandarizados para determinados casos o circunstancias, en
general es mejor que las variaciones de la temperatura sean rápidas, tanto para la
congelación como para la descongelación, por lo que para descongelar conviene
poner las células a 37ºC.

- Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo más baja posible. Lo mejor es

guardar tubos cerrados o sellados, que contengan las células microbianas,
sumergidos en nitrógeno líquido, que tiene una temperatura de –195ºC, o bien en
la fase gaseosa del nitrógeno líquido, con una temperatura de –140ºC. En el
mercado existen variados tipos de armarios congeladores, de los cuales los más
aconsejables son los que alcanzan temperaturas por debajo de –70ºC. Aquellos
que sólo alcanzan temperaturas entre –20ºC y – 40ºC, como ocurre con la
mayoría, no son aconsejables, entre otras cosas porque debido a la gran
concentración de solutos que existen en la suspensión celular, su punto de
congelación baja. El daño que se produce en las células es debido a que a
estas temperaturas hay frecuentes congelaciones y descongelaciones. Si se
añade un crioprotector no iónico, como por ejemplo el glicerol, se reduce la
cantidad de hielo que se produce y se evita el aumento de la concentración iónica.

Para la conservación en armarios congeladores, las células se almacenan en

criotubos (tubos de plástico esterilizables resistentes a la congelación que
cierran herméticamente), preparando lotes de varios tubos para cada cepa a
conservar y utilizando en su totalidad un tubo para cada ocasión. De esta manera
se evita que las cepas se congelen y se descongelen varias veces. Esto también
se puede evitar empleando tubos con criobolas (bolas de tipo abalorio que se
impregnan con la solución celular a congelar), ya que para tomar una muestra
basta con emplear una o varias bolitas sin necesidad de descongelar el resto.

Este método no se debe emplear para la conservación de microorganismos

anaerobios, como por ejemplo el género bacteriano Clostridium, ya que al estar
las células en una superficie hay un mayor contacto con el oxígeno y puede
afectarse la viabilidad.
- Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del daño que se
pueda producir en las células microbianas en el momento de la congelación.
Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores, pero el
que se utiliza con más frecuencia es el glicerol, a una concentración del 15 al 20%.
También se pueden utilizar el dimetilsulfóxido, la leche descremada y
carbohidratos como glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, etc. En su elección influye
el tipo de microorganismo que se quiera conservar.
La temperatura de almacenamiento seleccionada depende de las facilidades
disponibles, pero las temperaturas más bajas favorecen la viabilidad y la
estabilidad genética. La mayoría de los microorganismos (bacterias, hongos,
virus, bacteriófagos) sobreviven largos períodos el almacenamiento en estado de
congelación por la reducción marcada de su ritmo metabólico. Algunos protozoos,
algas y células humanas también pueden ser preservados por este método.
Existen muchos factores que pueden afectar la viabilidad y estabilidad de los
cultivos durante el proceso de congelación, por lo que deben realizarse
pruebas de ajustes del grado de enfriamiento y calentamiento, además de la
adición de crioprotectores a la suspensión celular. El almacenamiento de
microorganismos por el método de congelación a temperaturas extremadamente
bajas es muy simple y se ha logrado estandarizar para la preservación de un
amplio rango de microorganismos. Con él se obtiene la más reducida pérdida
de viabilidad, un alto grado de estabilidad y períodos de sobrevivencia de
más de 30 años. El costo inicial del equipamiento puede ser alto pero la seguridad
de este método justifica su costo, sobre todo en cultivos difíciles de preservar por
otros métodos. Sin embargo, el nivel de nitrógeno líquido de los contenedores
debe chequearse diariamente y mantenerse constante la distribución del mismo
en todo el recipiente. Este tipo de método se hace difícil y costoso; y la
penetración de nitrógeno líquido en ámpulas mal selladas puede provocar
explosiones cuando se trasladen del contenedor a otro lugar, por lo que se
recomienda utilizar recipientes de plástico o almacenamiento en la fase de vapor
del nitrógeno. Cuando se utiliza este método debe utilizarse protector para la cara,
bata y guantes de laboratorio como medidas de seguridad contra las salpicaduras
y derrames de nitrógeno líquido y la explosión de las ámpulas de vidrio.

Conservación por liofilización

La liofilización consiste en la eliminación del agua de una sustancia congelada por
sublimación del hielo bajo vacío. Este proceso consta de tres etapas, la
precongelación del producto para asegurar una estructura completamente
congelada; el secado primario con el que se elimina la mayor parte del
agua por sublimación; y el secado secundario con el que se remueve el agua que
queda ligada. En las células conservadas por este método no hay crecimiento
puesto que la actividad de agua es cero igual que en la congelación pero a
diferencia de la primera, los liófilos no tienen agua en el medio debido a la
sublimación. Para este proceso se emplean los aparatos denominados
liofilizadores, de los que hay muchos modelos en el mercado. Sin embargo, este
es un método muy recomendable por su comodidad para el almacenamiento y
para el envío de las cepas, pues una vez conseguidos los liófilos pueden
almacenarse a una temperatura ambiente de 18ºC-20ºC. El medio de preservación
es esencial para proteger las células de los daños producto de los procesos de
congelación y sobresecado. La elección del medio depende del microorganismo
de manera que se logre mantener la viabilidad y permitir un buen recobrado
posterior al proceso de liofilización. Usualmente el medio de preservación contiene
altos niveles de suero, proteínas, aminoácidos (ej: glutamato monosódico),
carbohidratos (ej: glucosa, sacarosa) o leche descremada. Entre los
crioprotectores recomendados se encuentran el inositol, para la mayoría de las
bacterias; la leche descremada para hongos y actinomicetos, pero para algunos
microorganismos pueden ser más convenientes otros crioprotectores, como por
ejemplo el glutámico-glutamato para las bacterias lácticas, mezclas de glucosa
con caldo hígado o chopped meat (sin carne) para bacterias anaerobias, etc. El
éxito de la liofilización para la preservación de los microorganismos no sólo
depende de los pasos de esta técnica (congelación y deshidratación) sino
también de las características físico-químicas del medio de suspensión, el tipo
de microorganismo, el estado fisiológico del cultivo, las condiciones del cultivo,
la concentración de los microorganismos, entre otros. Los factores que influyen
específicamente en la eficacia de la liofilización como medio de conservación
son:
1. Tipo de microorganismo. Hay algunos microorganismos que no resisten la
liofilización y lógicamente serán aquellos que contengan más agua en su interior.
Algunos hongos filamentosos, especialmente los no esporulados, no se pueden
guardar liofilizados y hay que recurrir a otros métodos.

2. Concentración celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una

concentración del orden de 108-109 células/ml en el caso de las bacterias y
algo inferior en el caso de hongos filamentosos y levaduras, debido a que
siempre se pierde alrededor de 102 unidades formadoras de colonia (UFC)
durante el proceso.

3. Temperatura durante la sublimación. Debe ser lo más baja posible, sin subir por
encima de –50ºC.

4. Grado de deshidratación alcanzado. Debe ser lo más alto posible, aunque la

concentración de solutos puede conllevar una pequeña cantidad de agua
remanente que no es perjudicial.

5. Atmósfera de oxígeno en el tubo. Las células liofilizadas se guardan en tubos

cerrados al vacío para evitar, tanto la rehidratación como la presencia de algún
gas dentro del tubo, como el oxígeno que puede dañar a las células.

6. Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante,

preferentemente a 18ºC y sin bajar de los 0ºC. Los liófilos se deben guardar en la
oscuridad. Este método es uno de los más eficaces para la conservación de
muchos tipos de microorganismos, como: bacterias, hongos, bacteriófagos y
virus; algunos de ellos pueden sobrevivir por períodos de más de 40 años.30
Es conveniente para la producción y distribución masiva de cultivos, la
viabilidad, pureza y estabilidad de los cultivos se mantenga por largos
períodos de tiempo, no se requiere de una atención constante después de
almacenarse los cultivos liofilizados y cientos de éstos pueden guardarse en
un pequeño espacio. Otro método dentro de la liofilización es utilizando capilares
de vidrio mediante el cual se reduce el espacio de almacenamiento y el costo de la
distribución de los cultivos. Sin embargo, el proceso es complejo y caro, pues
aunque no necesariamente requiere de un equipo sofisticado, se necesita al
menos de un sistema de vacío, por lo que no se puede aplicar en laboratorios con
recursos limitados.

Imagen 5: cepas liofilizadas

2. Métodos de conservación a corto plazo. Son los que se utilizan cuando no

se pueden emplear los métodos de elección, fundamentalmente por carecer de
los equipos necesarios, porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de
la conservación por estos métodos o porque las cepas contengan
construcciones genéticas trayendo consigo que estas pierdan elementos,
determinadas características especiales que se utilicen para medir el efecto
del medicamento o fármaco en la misma, desde el punto de vista tóxico. Conviene
tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que se
recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.

Conservación por transferencia periódica o subcultivo. La cepa microbiana

se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha
crecido, consiste en la transferencia del cultivo a un medio de cultivo fresco a
intervalos que aseguren la viabilidad del mismo. Estos intervalos varían
dependiendo de las características del microorganismo en cuestión, algunas
especies requieren ser transferidas a nuevos medios después de días o semanas,
y otras después de meses o años. Esta frecuencia puede reducirse con el
almacenamiento del subcultivo a temperaturas relativamente bajas.

Es conocido que el riesgo de contaminación y de cambios genéticos se

incrementa a mayor número de transferencias; así como el peligro de pérdida del
cultivo sobre todo cuando se trabaja con microorganismos delicados y la
posibilidad de que ocurra deshidratación del medio de cultivo, a estos
inconvenientes se suma además que cuando hay muchos microorganismos el
trabajo es muy intenso y se requiere un espacio grande para el almacenamiento.

Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril. Es

un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad
en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como
levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender en agua estéril unas
cuantas células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en
criotubos de los anteriormente mencionados. En este caso la concentración celular
no debe ser superior a 104-105 células/ml en el caso de bacterias. Los resultados
obtenidos en laboratorios de microbiología en la conservación de microorganismos
por este método muestran altos porcentajes de viabilidad en períodos a veces
superiores a 5 años. La estabilidad para caracteres morfológicos y fisiológicos es
buena, pero no se ha comprobado para caracteres específicos como la
virulencia, el poder fermentativo y la preservación de transformantes
genéticos.

Desecación sobre sustratos inertes. El método de almacenamiento de

microorganismos en estado de secado ha sido aplicado como un método de
preservación particularmente para bacterias y hongos que consiste en la
separación del agua y la prevención de la rehidratación. Para el desarrollo de
los métodos de desecación se han empleado como sustratos inertes: arena,
tierra, zeolita, sílica gel, discos y tiras de papel, tapones de algodón, discos de
gelatina y cuentas de vidrio y de porcelana.

Desecación en papel de filtro. Se utiliza un papel bastante absorbente

(Whatmann nº 3) que se impregna con una solución muy densa de células y se
deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible desecarlos por el
procedimiento que se llama desecación líquida (L-Dry) porque se utiliza para ello
el liofilizador, pero sin que haya habido congelación previa de las células.38 El
vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que un
vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición.

Desecación en suelo, arena, silicagel, etc. Se añaden las células a estos

sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos productores de
esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método y se sigue
el método anteriormente descrito.

Desecación en bolitas de alginato. Este es un procedimiento bastante eficaz.

Las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación del
agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior
desecación al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas
bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados herméticamente y a
temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC debido al
bajo contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de
alginato.

Desecación en sal gorda para halobacterias. Para su conservación por este

método se mezclan las células con sal y se dejan desecar espontáneamente.
Debido a la higroscopicidad de la sal, la desecación no es total, pero las células
dejan de multiplicarse por ser insuficiente el nivel de agua disponible. La
desecación es un método simple para la preservación de microorganismos, el
trabajo no es muy intenso, el costo es pequeño y la contaminación de los
subcultivos es menos probable que con los subcultivos periódicos. Además,
puede utilizarse para el almacenamiento de un gran número de cultivos. A pesar
de esto, resulta difícil evaluar detalladamente su confiabilidad, ya que en la
mayoría de los casos, la información apropiada no está disponible y en
otros está restringida a un número limitado de microorganismos.40 De
cualquier modo, los cultivos no deben ser preservados solamente por este método
sin una investigación previa.

Recobrado de las células. Cualquiera que haya sido el método empleado en la

conservación de las cepas microbianas, cuando éstas se recuperan para hacer
nuevos lotes para su conservación o para trabajar con ellas, se recomienda no
utilizar directamente las células que se han estado guardando, porque éstas
vienen de una situación de estrés más o menos fuerte (sobre todo cuando se han
conservado por liofilización) y por lo tanto no son adecuadas para ningún tipo de
prueba. Primero habría que revitalizarlas o rejuvenecerlas sembrándolas en un
medio no selectivo, es decir, un medio que asegure lo más posible el crecimiento,
y a partir de este primer crecimiento ya se puede trabajar con ellas, cultivándolas
en medios selectivos cuando sea necesario.

METODOS DE IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS

Métodos basados en criterios morfológicos

Los rasgos morfológicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas por
muchos años a clasificar organismos. Los organismos superiores tienen rasgos
anatómicos tan diferentes que pueden ser fácilmente utilizados en su clasificación,
pero con respecto a los microorganismos, éstos lucen bajo el microscopio tan
similares que se dificulta su clasificación. Es decir, que estos microorganismos que
se ven tan parecidos bajo un microscopio, pueden diferir en propiedades
bioquímicas, fisiológicas y/o serológicas. Sin embargo, aun cuando la morfología
celular dice poco sobre las relaciones filogenéticas, sigue siendo útil para la
identificación bacteriana. Por ejemplo: la presencia de endosporas y su
localización resulta de mucha utilidad en la identificación de bacilos esporulados.

Imagen 6: identificación por criterio morfológico

Métodos basados en tinción diferencial

Es posible sacar conclusiones en relación con la morfología de una bacteria,
examinando una lámina que fue sometida a un proceso de tinción diferencial.
Estos criterios morfológicos encabezan las primeras etapas del proceso de
identificación bacteriana. La mayor parte de las bacterias, teñidas con Gram, las
podemos clasificar como gram positivas o gram negativas, otras tinciones
diferenciales, como la ácido resistente, se aplican a otro tipo de bacterias, como
por ejemplo micobacterias. Un examen microscópico de una lámina teñida por
medio de gram o de una tinción diferencial es útil para obtener una información
rápida sobre la calidad de un ambiente clínico. Por otro lado, un médico también
puede obtener suficiente información de un reporte técnico de laboratorio para
comenzar el tratamiento apropiado de un paciente.

Imagen 7: identificación por tinción

Métodos basados en pruebas bioquímicas
Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar
bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es
capaz de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de
compuestos, la producción de compuestos coloreados, etc. Aun bacterias
fuertemente relacionadas pueden separarse en dos especies diferentes con base
a pruebas bioquímicas. Por ejemplo, las bacterias entéricas gram negativas,
forman un grupo muy grande y heterogéneo cuyo hábitat natural es el tracto
gastrointestinal de humanos y otros animales. Esta familia, Enterobacteriaceae,
incluye a varios patógenos que causan síndromes diarreicos. Un gran número de
ensayos han sido desarrollados de manera de identificar rápidamente al patógeno,
para que posteriormente el médico, con base al reporte, indique el tratamiento
adecuado, o para que los epidemiólogos puedan localizar la fuente de la infección.

Imagen 8: identificación por pruebas bioquímicas

Métodos basados en tipificación con fagos

La interacción entre un virus bacteriano (fago) y su célula bacteriana sensible es
sumamente específica, ya que el proceso de adsorción se encuentra mediado por
receptores específicos tanto en el virus como en la célula bacteriana. A una placa
con medio de cultivo sólido inoculado con un cultivo puro de una determinada
bacteria, se le añade una alícuota de un fago específico; éste puede ocasionar la
lisis de las bacterias, hecho que se evidencia en el cultivo como zonas claras
definidas, denominadas placas, que indican que hubo infección y lisis celular. El
uso de fagos específicos permite identificar y subclasificar bacterias dentro de una
misma especie.
 Imagen 8: identificación por fagos

Métodos basados en ensayos serológicos

Los métodos serológicos, implican la utilización de preparaciones de
inmunoglobulinas específicas provenientes del suero o de un reactivo, y que
pueden ser de gran utilidad en la identificación microbiana en muestras puras o en
muestras biológicas. Cada uno de los métodos tiene su fundamento particular,
pero en líneas generales, todos se basan en la reacción de un antígeno presente
en el agente microbiano con su anticuerpo correspondiente. La solución que
contiene los anticuerpos se denomina antisuero.

Imagen 9: identificación por muestras serológicas

Métodos basados en biología molecular

Modernamente adquiere más importancia el uso de métodos basados en biología
molecular donde, a través de procedimientos y reactivos, se pueden detectar
determinadas secuencias de ADN que son propias de un determinado agente
microbiano. El método que se está utilizando ampliamente en los laboratorios de
diagnóstico es el PCR (Polymerase Chain Reaction), que se aplica generalmente
para la identificación de- microorganismos que no pueden ser cultivados por los
métodos convencionales. A través de este método, puede aumentarse la cantidad
de ADN hasta niveles detectables mediante electroforesis o mediante sondas de
ADN.

Imagen 10: Identificación molecular (por DNA)