Caracterización fenotípica de los ratones

Debido a que no existen características fenotípicas precisas o moléculas de señalización de Bregs, la mejor
estrategia para identificar Bregs sería mediante tinción intracelular para IL-10. Sin embargo, este proceso implica
fijar y permeabilizar las células, lo que puede afectar la caracterización funcional de Bregs.Entonces, los fenotipos
y marcadores de superficie celular son clave para la identificación de Bregs.Algunos de los fenotipos de superficie
celular que, según los informes, son específicos de Bregs en ratones, en relación con su capacidad para producir
IL-10, se resumen en la Tabla
Las células B del bazo productoras de IL-10 estaban restringidas a un único subconjunto CD1 + hi CD5 +Breg que estaba
ausente en ratones Cd19 - / - . Este subconjunto relativamente raro de CD19 + CD5 +CD1d hi Breg se ha denominado células
B10 porque es atribuible a la producción de IL-10 (Yanaba et al., 2008 ). En estudios anteriores, se demostró que las células B
de la zona marginal esplénica (CD1d hi CD21 hi CD23 - CD24 hi IgM hi IgD lo ) producen IL - 10 e inhiben el desarrollo de la
enfermedad inflamatoria intestinal en modelos animales (Wei et al. 2005 , Mauri y Bosma, 2012 ). Además, se sabe que las
células B precursoras de 2-MZ transicionales (T2-MZP) (CD1d hi en CD21 hi CD23 + CD24 hiLg hi en IgD + ) inhiben la progresión de la
artritis. La regulación negativa de las células T2-MZP aparentemente depende de la secreción de IL-10, dado que las células T2-
MZP de ratones IL-10 - / - no protegen contra el desarrollo de artritis (Evans et al., 2007 ; Mauri y Bosma, 2012 ). Se ha
demostrado que el dominio de inmunoglobulina de células T y el dominio de mucina-1 (TIM-1) identifican más del 70% de las
células B productoras de IL-10 del bazo. TIM-1 se expresó por un gran número de células B reguladoras productoras de IL-10
en todos los subconjuntos principales de células B (Ding et al., 2011 ). Se ha demostrado que las células B TIM-1-deficientes
mejoran las respuestas Th1 / Th17 y agravan la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE, Xiao et al., 2015 ). Se cree que
los bregs ejercen su efecto supresor mediante la producción de citocinas inhibidoras. Se ha avanzado mucho en la
identificación de Bregs a través de estudios en ratones.

El estado actual del conocimiento sobre los fenotipos y marcadores de Bregs humanos (Blair et al., 2010 ; Iwata et
al., 2011 ; Furuzawa-Carballeda et al., 2013 ; Daien et al., 2014 ; L. Wang et al. , 2014 ) se presenta en la Tabla 1 . Se
ha demostrado que los Bregs humanos comparten algunas de las características fenotípicas con marcadores
previamente definidos en ratones (Correale et al., 2008 ; Yanaba et al., 2008 ).Se demostró que los Bregs que
expresan IL-10 humana normalmente están presentes en números bajos pero fácilmente identificables en la sangre
periférica y el bazo, un hallazgo similar al observado en ratones (Iwata et al., 2011 ; Kalampokis et
al., 2013 ). Después de la estimulación ex vivo con forbol miristato acetato y ionomicina más brefeldin-A, se
demostró que los Bregs humanos bloquean la producción de proteínas (Candando et al., 2014 ). Este método
proporciona una evaluación indirecta de los Bregs activos asociados con trastornos autoinmunes humanos porque
Bregs no se pudo observar directamente ex vivo(Candando et al., 2014 ).
Se demostró que los pejes de sangre periférica producen más IL-10 después de la estimulación con CD40 en
comparación con el que se obtiene después de la estimulación tanto por el receptor de células B (BCR) como por
CD40. Además, se demostró que los Bregs secretan marcadamente menos IL-10 en pacientes con EM en
comparación con controles sanos en ambas condiciones (Duddy et al., 2007 ).
Iwata et al. ( 2011 ) describieron un subconjunto de Bregs humano con CD19 + CD24 hi CD27 + que desempeñaba
un papel regulador inmunitario y parecía afectar funcionalmente a pacientes con lupus eritematoso sistémico
(LES). Además, este subconjunto de Bregs mostró una capacidad reducida para secretar IL-10 después del
compromiso de CD40 en pacientes con LES en comparación con controles sanos (Iwata et al., 2011 ). Las células
B que expresan la granzima B revelaron un fenotipo CD19 + CD38 + CD1d + IgM + CD147 + en el microambiente
de varios tumores sólidos. Se demostró que el establecimiento de este fenotipo regulador en los infiltrados
tumorales sólidos suprime las respuestas inmunes antitumorales (Lindner et al., 2013 ). Se sabe que los Bregs
humanos tienen un alto nivel de expresión de marcadores CD48 y CD148. CD48 es un marcador para la activación
de las células B, y CD148 se considera un marcador para las células B de la memoria humana (Kalampokis et
al., 2013 ). Los fenotipos que son únicos de Bregs aún no se han identificado; no obstante, se cree que los Bregs
modulan la inmunidad de forma negativa a través de mecanismos complejos en los trastornos autoinmunitarios en
humanos.
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FUNCIONES DE Bregs
Existen varios mecanismos por los cuales Bregs ejerce su función reguladora durante la respuesta inmune
(Fig .1 ). IL-10 es una citocina inmunoreguladora que desempeña un papel fundamental en el control de la
inflamación excesiva y la regulación negativa de la respuesta inmune (Lemoine et al., 2009 ; Yao et al., 2013 ). Se
sabe que los Bregs productores de IL-10 regulan negativamente la activación de macrófagos y células dendríticas
(Kalampokis et al., 2013 ). De acuerdo con Flores-Borja et al. ( 2013 ), CD19 + CD24 hiCD38 hi Bregs mostraron
una regulación negativa de la respuesta Th1 / Th17. Carter et al. ( 2011 ) demostraron que los ratones que carecían
específicamente de células B productoras de IL-10 desarrollaron una artritis progresiva y exhibieron una mayor
frecuencia en las células Th1 / Th17 inflamatorias en comparación con los ratones de tipo salvaje (WT). Además,
se demostró que la transferencia adoptiva de Bregs a ratones IL-10 - / - reduce las frecuencias de las células
patogénicas Th1 / Th17 y suprime la inflamación autorreactiva. En general, los Bregs parecen suprimir la
diferenciación de las células Th1 / Th17 y potenciar la polarización de Th2, lo que resulta en una disminución de
la activación de las células T (Lampropoulou et al., 2008 ; Kalampokis et al., 2013 ).

Figura 1
Los pang juegan su papel en la respuesta inmune a través de IL-10, TGF-β y / o IL-35. a: los Bregs productores de IL-10
parecen suprimir la diferenciación de las células Th1 / Th17 y potenciar la polarización Th2. Los Bregs productores de IL-10
también suprimen la activación de macrófagos y células dendríticas. b: los Bregs productores de TGF-β parecen suprimir la
activación de Th1 y promover la expansión de Tregs. c:i35-Bregs parece suprimir la activación Th1 / Th17 y promover la
expansión de Tregs. [La cifra en color se puede ver en la edición en línea, que está disponible en wileyonlinelibrary.com .]

En un estudio experimental, los ratones con células B deficientes en IL-10 no se recuperaron completamente de la
EAE, lo que provocó la idea de que los Bregs productores de IL-10 podrían suprimir la inflamación en los
trastornos autoinmunes (Wolf et al., 1996 ). La transferencia de Bregs que producen WT IL-10 mejoró la
inflamación y la gravedad de EAE, mientras que la transferencia de Bregs de ratones IL-10 - / - no tuvo tal
efecto. En consecuencia, la recuperación de la enfermedad se atribuye predominantemente a Bregs productores de
IL-10 autoantígenos (Wolf et al., 1996 ). Estos Bregs específicos productores de IL-10 también se
denominan células B10 (Kalampokis et al., 2013 ). Varios estudios han demostrado una disminución significativa
de las células B10 en los trastornos neuroinmunológicos humanos (Knippenberg et al., 2011 ; Quan et al., 2013 ;
Sun et al., 2014 ).
Las señales inducidas por BCR parecen ser esenciales para que las células B10 funcionen eficazmente. Los
primeros estudios de ratones transgénicos CD19 mostraron que los ratones Cd19 - / - habían alterado la señalización
BCR y disminuido las células B10, mientras que la sobreexpresión de CD19 en ratones dio como resultado un
mayor número de células B10 (Yanaba et al., 2008 ). Se demostró que la inhibición inmune mediada por células B
implica la activación de células B específicas de antígenos a través de la señalización de BCR y CD40 (Hilgenberg
et al., 2014 ). No obstante, estas señales fueron inadecuadas para estimular la producción de IL-10, dado que las
células B vírgenes no produjeron citocina IL-10 inhibitoria, lo que sugiere que no fueron responsables de la
supresión de la enfermedad después de la estimulación por BCR y CD40 (Lampropoulou et al. al., 2008 , 2010 ).
Varios estudios mostraron aumentos marcados en la secreción de IL-10 por células B vírgenes después de la
estimulación con agonistas de señalización de receptor Toll-like (TLR), que también se sabe que desencadena la
respuesta inhibidora (Lampropoulou et al., 2008 , 2010 ). Los ratones portadores de deficiencia restringida de
células B en la vía de señalización MyD88, una proteína adaptadora de señalización esencial para la mayoría de
recaídas crónicas de EAE desarrolladas en TLR, eran clínicamente indistinguibles de los ratones que carecían de
producción de IL-10 por las células B. La señalización de TLR en células B parece ser un requisito para la función
supresora mediada por células B en la patogénesis de enfermedades (Lampropoulou et al., 2008 ). Se cree que la
función supresora de las células B se inicia mediante un proceso de dos pasos, la señalización de TLR y la
posterior amplificación a través de señalización BCR y CD40 (Yao et al., 2013 ). En otro descubrimiento crucial
reciente, Yoshizaki et al. ( 2012 ) mostraron que las señales de CD40 podrían inducir la expansión de Breg en la
generación de células efectoras productoras de IL-10 funcional a través de interacciones análogas dependientes de
IL-21.

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Función de ejercicio Bregs a través de IL-35
IL-35, una citocina recientemente identificada que pertenece a la familia IL-12, es una potente citocina
antiinflamatoria producida por Tregs y Bregs (Collison et al., 2010 ; Mauri y Nistala, 2014 ; Xiang y
Xie, 2015 ). Se demostró que una nueva subpoblación i35-Breg regula negativamente la respuesta inmune al
inhibir las células Th1 / Th17 (Choi et al., 2015 ). Este nuevo jugador clave parece prometedor y podría abrir
nuevos horizontes para el tratamiento de trastornos autoinmunes en el futuro (Shen et al., 2014 ; RX Wang et
al., 2014 ; Egwuagu y Yu, 2015 ).
Se cree que la IL-35 derivada de células B es un importante regulador de la autoinmunidad mediada por células
T. En un estudio, los ratones que carecían de expresión de IL-35 en las células B perdieron su capacidad de
recuperarse completamente de EAE en contraste con los ratones WT (Shen et al., 2014 ). Este estudio también
demostró la secreción de IL-35 por las células B después de la estimulación de TLR4 . Aunque TLR4 desencadenó
la formación de Bregs productores de IL-10, tal efecto no fue observable después de la coestimulación por TLR4 y
CD40 (Shen et al., 2014 ).
Se ha demostrado que el tratamiento de ratones con IL-35 limita las respuestas inmunes dañinas en un modelo
animal de uveítis. Además, los ratones que carecían de IL-35 o tenían señalización de IL-35 disfuncional (que
comprende las subunidades IL-12Rβ2 / IL-27Rα) mostraron una pobre expansión de Bregs y manifestaron
progresión de uveítis. Sin embargo, después de la transferencia adoptiva de IL-35 recombinante, los Bregs
inducidos por IL-35 suprimieron la uveítis, inhibieron las células Th1 / Th17 patógenas y promovieron la
expansión de Tregs. Además, IL-35 indujo la conversión de células B humanas en Bregs, lo que sugiere que IL-35
podría ser una molécula posible para tratar trastornos autoinmunes en virtud de su efecto en la mejora de la
función de Bregs (RX Wang et al., 2014 ).

Función de ejercicio de Bregs a través de TGF-β

Se ha demostrado que los bregs regulan negativamente la respuesta inmune a través de la producción de la citocina
antiinflamatoria TGF-β (Holan et al., 2014 ; Vadasz y Toubi, 2014 ). Se demostró que los Bregs regulan
negativamente la inmunidad Th1 patogénica de manera efectiva a través de TGF-β antiinflamatorio (Tian et
al., 2001 ). Además, se demostró que Bregs promueve la supervivencia del injerto mejorando la expansión de
Tregs, posiblemente a través de la producción de TGF-β (Lee et al., 2014 ). El TGF-β puede inhibir la inmunidad
de las células T suprimiendo directamente la producción de citoquinas por las células T efectoras o indirectamente
regulando negativamente la actividad de las células presentadoras de antígenos (Tian et al., 2001 ; Holan et
al., 2014 ; Lee et al., 2014 ). . Es interesante observar que la transferencia adoptiva de Bregs productores de TGF-
β, generada in vitro por estimulación con lipopolisacáridos, pareció inhibir el desarrollo de diabetes en ratones al
inducir la apoptosis de las células T efectoras (Tian et al., 2001 ).
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Bregs EN TRASTORNOS NEUROIMMUNOLÓGICOS

EAE encefalitis alérgica experimental y MS
El modelo de animal MS establecido EAE es una enfermedad autoinmune desmielinizante mediada por Th1 del
sistema nervioso central (SNC). Se sabe que las células B están involucradas en la patogénesis de EAE. La EAE
puede inducirse en ratones mediante inmunización con antígenos de mielina tales como glicoproteína de
oligodendrocitos de mielina (MOG) o mediante transferencia adoptiva de células T CD4 + específicas de
autoantígenos (Ray et al., 2011 ; Robinson et al., 2014 ). En este sentido, la EAE se ha utilizado ampliamente para
estudiar la patogénesis y los tratamientos potenciales para la EM (Ray et al., 2011 ; Duffy et al., 2014 ; Pierson et
al., 2014 ; Robinson et al., 2014 ). Los efectos reguladores de las células B sobre la EAE se demostraron hace casi
20 años. Los ratones con deficiencia de células B no pudieron recuperarse completamente de EAE (Wolf et
al., 1996 ). Cuando las células B de ratones WT habían sido agotadas por el anticuerpo monoclonal (mAb) CD20 7
días antes de la inducción de EAE, se descubrió que el número total de células T CD4 + en el SNC se expandió
significativamente y los síntomas de la enfermedad se exacerbaron. Sin embargo, la transferencia adoptiva de
CD5 + CD1d productor de IL-10 en células B potentes, pero no de otras células B, suprimió los síntomas de la
enfermedad (Fillatreau et al., 2002 ; Matsushita et al., 2008 ). Datos experimentales adicionales apoyaron efectos
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similares en EAE que se habían tratado con un mAb dirigido a B que bloquea CD22 (Matsushita et
al., 2010 ). Además, el agotamiento de las células B durante la progresión de la EAE mejoró dramáticamente los
síntomas y la respuesta inflamatoria (Matsushita et al., 2008 ). Otro estudio identificó plasmablastos en los
ganglios linfáticos de drenaje como los Bregs productores de IL-10 que regulan negativamente la inflamación de
EAE. La progresión de EAE se mejoró por su deleción en ratones que carecían de plasmablastos (Matsumoto et
al., 2014 ). Además, las células T infiltrantes se redujeron significativamente en ratones deficientes en células B
que habían sido tratados con E2 y Bregs. Por lo tanto, la administración concomitante de Bregs y E2 podría
proporcionar una futura inmunoterapia prometedora para el tratamiento de la EAE (Zhang et al., 2015a , 2015b ).
La caracterización fenotípica de Bregs en trastornos neuroinmunológicos humanos se presenta en la Tabla 2 . La
EM es principalmente una enfermedad desmielinizante autoinmune progresiva crónica, causada por la migración
de células T en el SNC. La evidencia acumulada enfatiza la importancia de los subconjuntos de células B en la
patogénesis (Lucchinetti et al., 2000 ) y la terapia (Keegan et al., 2005 ) de la EM. Específicamente, los Bregs
desempeñan un papel importante en la base fisiopatológica de la EM (Krumbholz y Meinl, 2014 ). La infección
por helmintos en pacientes con EM indujo más Bregs capaces de atenuar la respuesta inmune mediante la
producción de altos niveles de IL-10 (Correale et al., 2008 ; Correale y Equiza, 2014 ). En un estudio reciente, se
encontraron menos células B productoras de IL-10 en la sangre periférica de pacientes con EM durante la recaída
y la remisión en comparación con controles sanos (Knippenberg et al., 2011 ).
Tabla 2
Caracterización fenotípica de los pechos en los trastornos neuroinmunológicos humanos

Trastornos
neuroinmunológicos Cambios en varios fenotipos Bregs Referencias

SRA ↑ CD19 + CD25 + Bregs en EM recidivante vs. EM Knippenberg et al., 2011 ; de Andres et
remitente al., 2014 ; Michel et al., 2014

↑ CD19 + CD25 + Bregs en MS remitente vs. HC

-CD19 + CD24 hi CD38 hi Bregs en MS vs. HC

↓ CD19 + IL10 + Bregs en MS vs. HC

NMO ↓ CD19 + CD24 hi CD38 hi Bregs en NMO vs. MS Quan et al., 2013 ; Yang et al., 2015

↓ CD19 + CD24 hi CD38 hi Bregs en NMO vs. HC

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Trastornos
neuroinmunológicos Cambios en varios fenotipos Bregs Referencias

↓ CD19 + CD5 + CD1d hi Bregs en NMO vs. MS

↓ CD19 + CD5 + CD1d hi Bregs en NMO vs. MS

MG ↓ CD19 + CD24 hi CD38 hi Bregs en MG vs. HC Sun et al., 2014

↓ CD19 + CD5 + CD1d hola Bregs en MG vs. HC

Abrir en una ventana separada

Sin embargo, los investigadores han informado hallazgos contradictorios que describen otros estudios en los que
se observó frecuencia y fenotipo normales de Bregs en la sangre periférica de pacientes con EM (Michel et
al., 2014 ). No se observaron diferencias entre pacientes con EM y controles sanos en la frecuencia y función de
CD19 + CD24 hi CD38 hi Bregs, lo que sugiere que la falta de Bregs periféricos puede no contribuir a la
fisiopatología de la EM (Michel et al., 2014 ). Sin embargo, estas discrepancias podrían deberse a diferencias en
los protocolos en términos de tiempo de cultivo celular y naturaleza de la estimulación, y ambos han demostrado
tener un impacto en la secreción de citoquinas por las células B.
Los investigadores identificaron un nuevo tipo de Bregs (CD19 + CD25 + ), en números bajos pero fácilmente
apreciables, en la circulación periférica humana de pacientes con EM y controles sanos. En un estudio, los
pacientes con EM tuvieron una mayor frecuencia de células B circulantes CD19 + CD25 +durante la recaída en
comparación con aquellos en remisión. La frecuencia de circulación de CD19 + CD25 + Bregs también fue mayor
en pacientes con EM en remisión en comparación con controles sanos (de Andres et al., 2014 ). Comprender el
complejo papel de Bregs ayudará a iluminar la inmunopatogenia de la EM, que puede ofrecer nuevas
oportunidades para atacar a la EM.

NMOSD neuromielitis optica

La NMO es un trastorno desmielinizante inflamatorio grave del SNC que se caracteriza por ataques típicos de
neuritis óptica y mielitis transversa extendida longitudinalmente (Wingerchuk et al., 2007 , 2015 ).Varios estudios
han indicado un papel crucial de las células B en la patogénesis del trastorno del espectro de la NMO (NMOSD,
Krumbholz y Meinl, 2014 ; Bennett et al., 2015 ). El papel central de los autoanticuerpos contra la proteína acuosa
del canal aquaporin 4 (AQP4, Lennon et al., 2004 ) y MOG (Probstel et al., 2015 ) en la patogénesis de NMOSD
ha proporcionado una nueva esperanza para el tratamiento de este trastorno rápidamente incapacitante.
Algunos investigadores han informado sobre el papel de Bregs en la patogénesis de NMOSD.Recientemente, dos
artículos de investigadores chinos indicaron frecuencias significativamente más bajas de diferentes subconjuntos
de Bregs en pacientes con NMOSD en comparación con pacientes con EM y controles sanos (Quan et al., 2013 ;
Yang et al., 2015 ). Uno de estos estudios demostró frecuencias significativamente más bajas de
CD19 + CD24 hi CD38 hi Bregs e IL-10 en NMOSD. Además, la frecuencia de CD19 + CD24 hi CD38 hi Bregs fue
incluso menor en los pacientes con NMOSD que arrojaron resultados positivos para el anticuerpo AQP4 en
comparación con aquellos que dieron negativo para el anticuerpo AQP4 (Quan et al., 2013 ).

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Otro estudio pareció reflejar estos hallazgos en el sentido de que la proporción de CD19 + CD5 + CD1d hiBregs fue
significativamente menor en pacientes NMOSD en comparación con aquellos en pacientes con EM y controles
sanos. Además, la proporción de CD19 + CD5 + CD1d hi Bregs en células CD19 + B fue menor en pacientes
NMOSD con anticuerpos AQP4 positivos que en pacientes con anticuerpos negativos (Yang et al., 2015 ). Estos
hallazgos parecen implicar la expresión reducida de Bregs en la patogénesis de los trastornos neuroautoinmunes.

MG
La MG es un trastorno neuroautoinmune mediado por células B en el que los autoantígenos principales son la
tirosina cinasa específica de músculo (MuSK) o el receptor de acetilcolina (AchR) en la membrana postsináptica
de la unión neuromuscular, lo que produce debilidad muscular y fatiga ( Vincent et al., 2001 ; Guptill et
al., 2015 ). Se ha demostrado que CD72 actúa como un receptor inhibidor de células B en varios trastornos
autoinmunes (Smith et al., 2004 , Nakano et al., 2007 ). Los estudios preliminares han demostrado que CD72
parece estar significativamente disminuida en pacientes con MG y negativamente se correlaciona con niveles anti-
AchR-IgG. Esto sugiere un efecto inhibidor de CD72 sobre la activación de células B en MG e implica CD72 en la
causación de MG (Lu et al., 2013 ).
Recientemente se ha demostrado que la frecuencia y la función de Bregs (CD19 + CD24 hi fenotipo CD38 hi así
como CD19 + CD5 + CD1d hi fenotipo) se redujeron en pacientes con MG en comparación con controles
sanos. Además, la frecuencia y la función de Bregs se asociaron con la actividad de la enfermedad (Sun et
al., 2014 ). Otro estudio pareció reflejar estos hallazgos en el sentido de que se detectó un menor porcentaje de
células B10 en pacientes con MuSK MG (Guptill et al., 2015 ). Por lo tanto, Bregs puede servir como un marcador
de la actividad de la enfermedad en pacientes MG y es un posible objetivo terapéutico futuro.
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CONCLUSIONES
La evidencia disponible indica que los Bregs pueden regular a la baja las respuestas inflamatorias excesivas en los
trastornos neuroinmunológicos. Debido a las obvias limitaciones de la obtención de muestras de sangre periférica
humana, solo se han publicado algunos estudios sobre células B reguladoras, a excepción de las enfermedades
neuroinmunológicas más comunes, como la EM, NMOSD y MG. Sin lugar a dudas, habrá avances significativos
en otras enfermedades neuroinmunológicas importantes en los próximos años.Igualmente anticipamos la
identificación precisa de subpoblaciones de Bregs adicionales que producen diferentes citoquinas o median
funciones distintas. Sin embargo, aún no se sabe si las células B productoras de i35-Bregs e IL-10 se superponen a
las subpoblaciones o simplemente representan diferentes etapas de las células B, y esto debe abordarse en el
futuro. Debemos entender cómo expandir Bregs eficientemente in vitro y cómo lograr la máxima función
reguladora de las células B. Este conocimiento crucial abrirá las puertas para un enfoque prometedor y novedoso
para el tratamiento de los trastornos relacionados con el sistema inmune humano.

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