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FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

PROGRAMA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA


LABORATORIO MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
PRÁCTICA No. 5 Página
Metabolismo Microbiano 1 de 9

OBJETIVOS
 Reconocer los diferentes procesos metabólicos que llevan a cabo las bacterias usando como
modelo la columna de Winogradsky.
 Identificar como se integran los diferentes productos y subproductos del metabolismo para permitir
el desarrollo de diferentes comunidades microbianas.
 Identificar diferentes morfologías bacterianas y asociarlas con géneros característicos de bacterias
implicadas en el ciclo del azufre.

1. INTRODUCCIÓN
El metabolismo se refiere a todas las reacciones bioquímicas que se producen en una célula u
organismo. El estudio del metabolismo bacteriano se centra en la diversidad química de las
oxidaciones del sustrato y las reacciones de disimilación (reacciones por las que se descomponen las
moléculas del sustrato), que normalmente funcionan en las bacterias para generar energía. También
dentro del alcance del metabolismo bacteriano está el estudio de la captación y utilización de los
compuestos inorgánicos u orgánicos requeridos para el crecimiento y mantenimiento de un estado
estacionario celular (reacciones de asimilación). Estas reacciones exergónicas (energéticas) y
endergónicas (que requieren energía) son catalizadas dentro de la célula bacteriana viva por sistemas
enzimáticos integrados, siendo el resultado final la auto-replicación de la célula. La capacidad de las
células microbianas para vivir, funcionar y replicarse en un medio químico apropiado (tal como un
medio de cultivo) y los cambios químicos que resultan durante esta transformación constituyen el
alcance del metabolismo bacteriano.

2. CONSULTAS PRELIMINARES

 Dibuje la columna de Winogradsky y mencione los grupos de microorganismos que se desarrollan


en cada una de las fases.
 Realice una descripción gráfica de las diferentes bacterias que se pueden encontrar en cada una
de las fases de la columna.
 ¿Qué relación hay entre los ciclos de azufre, fósforo y nitrógeno?
 ¿Qué es el biodeterioro y que papel cumplen las bacterias del ciclo del azufre?

Lectura Obligatoria: Hao T, Xiang P, Mackey H, Chi K, Lu H, Chui H, van Loosdrecht M, Chen G. A
review of biological sulfate conversions in wastewater treatment. Water research 2014; 65, 1 – 21

3. FUNDAMENTO TEÓRICO
La célula es un transformador de energía altamente especializado. La energía química generada por
las oxidaciones del substrato se conserva mediante la formación de compuestos de alta energía tales
como adenosina difosfato (ADP) y adenosina trifosfato (ATP) o compuestos que contienen el enlace
tioéster ADP y ATP representan adenosina monofosfato (AMP) más uno y dos de alta energía; la
energía se almacena en estos compuestos como enlaces de fosfato de alta energía. En presencia de
sistemas enzimáticos apropiados, estos compuestos pueden utilizarse como fuentes de energía para
sintetizar los nuevos compuestos orgánicos complejos necesarios para la célula. Todas las células
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vivas deben mantener reacciones bioquímicas en estado estacionario para la formación y el uso de
tales compuestos de alta energía.

Kluyver y Donker reconocieron que los microorganismos, independientemente de las especies, eran
en muchos aspectos químicamente similares a todas las demás células vivas. Por ejemplo, estos
investigadores reconocieron que la transferencia de hidrógeno es una característica común y
fundamental de todos los procesos metabólicos. Las bacterias, como las células de mamíferos y de
plantas, usan ATP o el enlace de fosfato de alta energía (~ P) como fuente de energía química primaria.
Las bacterias también requieren las vitaminas del complejo B como coenzimas funcionales para
muchas reacciones de oxidación-reducción necesarias para el crecimiento y la transformación de
energía. Un organismo como Thiobacillus thiooxidans, que crece en un medio que contiene solo azufre
y sales inorgánicas, sintetiza grandes cantidades de tiamina, riboflavina, ácido nicotínico, ácido
pantoténico, piridoxina y biotina. Por lo tanto, Kluyver propuso la teoría de la unidad de la bioquímica,
que establece que todas las reacciones enzimáticas básicas que soportan y mantienen procesos
vitales dentro de las células de los organismos, tenían más similitudes que diferencias. Este concepto
de unidad bioquímica estimuló a muchos investigadores a usar bacterias como sistemas modelo para
estudiar reacciones bioquímicas eucariotas, vegetales y animales relacionadas que son esencialmente
"idénticas" a nivel molecular.

Desde el punto de vista nutricional o metabólico, existen tres tipos fisiológicos de miccroroganismo:
los heterótrofos (quimioorganotróficos), los autótrofos (quimiolitotróficos) y las bacterias fotosintéticas
(fototróficas)

 Metabolismo Heterótrofo

Los microorganismos heterótrofos, obtienen energía de la oxidación de compuestos orgánicos. Los


carbohidratos (particularmente la glucosa), los lípidos y la proteína son los compuestos más
comúnmente oxidados. La oxidación biológica de estos compuestos orgánicos resulta en la síntesis
de ATP como fuente de energía química. Este proceso también permite la generación de compuestos
orgánicos más sencillos (moléculas precursoras) que necesita las células para las reacciones
biosintéticas o asimiladoras.

Los compuestos intermedios del ciclo de Krebs sirven como moléculas precursoras (bloques de
construcción) para la biosíntesis que requiere energía de compuestos orgánicos complejos. Las
reacciones de degradación que producen simultáneamente energía y generan moléculas precursoras
para la biosíntesis de nuevos constituyentes celulares se denominan anfibólicas.

Todos los microorganismos heterótrofos requieren compuestos orgánicos preformados. Estos


compuestos que contienen carbono y nitrógeno son sustratos de crecimiento, que se usan
aeróbicamente o anaeróbicamente para generar equivalentes reductores (por ejemplo, nicotinamida
adenina dinucleótido reducido, NADH + H +); Estos equivalentes reductores a su vez son fuentes de
energía química para todos los sistemas oxidativos y fermentativos biológicos. Los heterótrofos son
los microrganismos más comúnmente estudiadas; Crecen fácilmente en medios que contienen
carbohidratos, proteínas u otros nutrientes complejos como la sangre. Además, los medios de cultivo
pueden enriquecerse mediante la adición de otros compuestos naturales tales como la leche (para
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estudiar las bacterias del ácido láctico) o los hidrocarburos (para estudiar los organismos que oxidan
los hidrocarburos).

 Respiración

La glucosa es el sustrato más común usado para estudiar el metabolismo heterotrófico. La mayoría de
los organismos aeróbicos oxidan completamente la glucosa mediante la siguiente ecuación de
reacción:
C6 H12 O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2 O + Energía
Esta ecuación expresa el proceso de oxidación celular llamado respiración. La respiración ocurre
dentro de las células vegetales y animales, generando normalmente 38 moléculas de ATP (como
energía) a partir de la oxidación de 1 molécula de glucosa. Esto produce aproximadamente 380.000
calorías (cal) por unidad de glucosa (ATP ~ 10.000 cal / mol).

La oxidación de la glucosa es la reacción disimilatoria más comúnmente estudiada que conduce a la


producción de energía o la síntesis de ATP. La oxidación completa de la glucosa puede implicar tres
vías bioquímicas fundamentales. La primera es la ruta glicolítica o Embden-Meyerhof-Parnas, la
segunda es el ciclo de Krebs (también llamado ciclo de ácido cítrico o ciclo de ácido tricarboxílico) y la
tercera es la fosforilación oxidativa.

La respiración tiene lugar cuando cualquier compuesto orgánico (generalmente hidratos de carbono)
se oxida completamente a CO2 y H2O. En la respiración aeróbica, el O2 molecular es el receptor
terminal de los electrones. Para la respiración anaeróbica, el NO3-, SO42-, CO2 o fumarato pueden
servir como receptores de electrones terminales (en lugar de O2), dependiendo del microorganismo.
El resultado final del proceso respiratorio es la oxidación completa de la molécula del sustrato orgánico
y los productos finales formados son principalmente CO 2 y H2O. El amoníaco se forma también si la
proteína (o aminoácido) es el sustrato oxidado.
Metabólicamente, las bacterias son las únicas que a diferencia de las cianobacterias (algas verde-
azuladas) y otras células eucariotas pueden llevar la oxidación de la glucosa por más de una vía. En
las bacterias, la glucólisis representa una de varias vías por las cuales pueden atacar catabólicamente
la glucosa. La vía glicolítica se asocia más comúnmente con el metabolismo anaeróbico o fermentativo
en bacterias y levaduras. En bacterias, también existen otras vías heterofermentativas menores, tales
como la vía de fosfocetolasa.

Además, se encuentran otras dos vías de catabolización de la glucosa en las bacterias: la vía oxidativa
de pentosa fosfato (derivación de hexosa monofosfato) y la vía de Entner-Doudoroff, que se encuentra
casi exclusivamente en bacterias aeróbicas obligada. El género Azotobacter es altamente oxidativo y
la mayoría de las especies de Pseudomonas, por ejemplo, utilizan el camino de Entner-Doudoroff para
catabolismo de glucosa, porque estos organismos carecen de la enzima fosfofructoquinasa y por lo
tanto no pueden sintetizar fructosa 1,6-difosfato, un compuesto intermedio clave en la vía glicolítica.
(La fosfo-fructoquinasa es también sensible al O 2 molecular y no funciona en aerobios obligatorios).
Otras bacterias, que carecen de aldolasa (que divide la fructosa-1,6-difosfato en dos trifosfatos),
tampoco pueden tener una vía glicolítica funcional. Aunque el camino de Entner-Doudoroff se asocia
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generalmente con las bacterias aerobias obligatorias, está presente en el metabolismo anaerobio
facultativo de Zymomonas mobilis.

 Fermentación

La fermentación es otro ejemplo de metabolismo heterotrófico, que requiere un compuesto orgánico


como aceptor terminal de electrones (o hidrógeno). En las fermentaciones, los productos finales
orgánicos simples se forman a partir de la disimilación anaeróbica de glucosa (o algún otro compuesto).
La energía (ATP) se genera a través de las reacciones de deshidrogenación que se producen cuando
la glucosa se descompone enzimáticamente. Los productos orgánicos formados a partir de este
proceso de oxidación biológico incompleto también sirven como receptores finales de electrones y de
hidrógeno. En la reducción, estos productos finales orgánicos se secretan en el medio como
metabolitos de desecho (normalmente alcohol o ácido). Los compuestos de sustrato orgánico están
incompletamente oxidados por bacterias, pero proporcionan suficiente energía para el crecimiento
microbiano. La glucosa es la hexosa más común usada para estudiar las reacciones de fermentación.

A finales de la década de 1850, Pasteur demostró que la fermentación es un proceso vital asociado al
crecimiento de microorganismos específicos y que cada tipo de fermentación puede definirse por el
producto final orgánico principal formado (ácido láctico, etanol, ácido acético o ácido butírico). Sus
estudios sobre la fermentación con ácido butírico condujeron directamente al descubrimiento de
microorganismos anaerobios. Pasteur concluyó que el oxígeno inhibía a los microorganismos
responsables de la fermentación del ácido butírico debido a que la movilidad bacteriana y la formación
de ácido butírico cesaron cuando se burbujeó aire en la mezcla de fermentación. Pasteur también
introdujo los términos aeróbico y anaeróbico. Sus puntos de vista sobre la fermentación se desprenden
de sus estudios microbiológicos sobre la producción de cerveza.

Para la mayoría de las fermentaciones microbianas, la disimilación de glucosa se produce a través de


la vía glicolític. El compuesto orgánico simple más comúnmente generado es el piruvato, o un
compuesto derivado enzimáticamente de piruvato, tal como acetaldehído, α-acetolactato, acetil-SCoA
o lactyl-SCoA. El acetaldehído puede entonces ser reducido por NADH + H + al etanol, que es
excretado por la célula. El producto final de la fermentación con ácido láctico, que se produce en
estreptococos (por ejemplo, Streptococcus lactis) y muchos lactobacilos (por ejemplo, Lactobacillus
casei, L. pentosus), es un ácido orgánico.

Muchos de los fermentadores de glucosa generalmente producen CO 2 y H2 con diferentes


combinaciones de productos finales ácidos (formiato, acetato, lactato y succinato). Otras bacterias
como Enterobacter aerogenes, Aeromonas, Serratia, Erwinia y Bacillus también forman CO2 y H2, así
como otros productos finales neutros (etanol, acetilmetilcarbinol [acetoin] y 2,3-butilenglicol). Muchos
clostridios obligatoriamente anaeróbios (por ejemplo, Clostridium saccharobutyricum, C.
thermosaccharolyticum) fermentan la glucosa con la producción de butirato, acetato, CO 2 y H2,
mientras que otras especies de Clostridum (C. acetobutylicum y C. butyricum) también forman estos
extremos de fermentación Productos más otros (butanol, acetona, isopropanol, formiato y etanol).

 El ciclo de Krebs
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También llamado ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo de ácido cítrico) funciona oxidativamente en
la respiración y es el proceso metabólico mediante el cual el piruvato o acetil-SCoA se descarboxila
completamente a CO 2. En bacterias, esta reacción se produce a través de acetil-SCoA, que es el
primer producto en la descarboxilación oxidativa de piruvato por la enzima piruvato deshidrogenasa.

Si se obtienen 2 moléculas de piruvato a partir de la disimilación de una molécula de glucosa, se


generan en total 30 moléculas de ATP. La descarboxilación de piruvato, isocitrato y α-cetoglutarato
explica todas las moléculas de CO2 generadas durante el proceso respiratorio. La energía química
conservada por el ciclo de Krebs está contenida en los compuestos reducidos generados (NADH + H
+, NADPH + H + y succinato). La energía potencial inherente a estos compuestos reducidos no está
disponible como ATP hasta que se produce el paso final de la respiración (transporte de electrones y
fosforilación oxidativa).

El ciclo de Krebs es por lo tanto otra etapa preparatoria en el proceso respiratorio. Si 1 molécula de
piruvato se oxida completamente a 3 moléculas de CO 2, generando 15 moléculas de ATP, la oxidación
de 1 molécula de glucosa producirá hasta 38 moléculas de ATP, siempre que la glucosa sea disimilada
por el glucólisis y el ciclo de Krebs. Las reacciones de transporte de electrones o fosforilación oxidativa
son bioenergéticamente idénticas a las de las mitocondrias eucarióticas.

 Respiración Anaerobia

Algunas microroganismos exhiben un modo único de respiración llamado respiración anaeróbica.


Estos microorganisos que no crecen de anaerobia a menos que un componente químico específico,
que sirve como aceptor de electrones terminal, se añade al medio. Entre estos aceptores de electrones
están NO3-, SO42-, el compuesto orgánico fumarato, y CO 2. Un pareja grande de respiradores
anaeróbicos son los reductores de nitrato. Los reductores de nitrato son predominantemente bacterias
heterotróficas que poseen un sistema o sistemas de transporte de electrones complejos que permiten
que el ion NO3- sirva anaerobiamente como aceptor terminal de electrones

 Autotrofía

Las bacterias que crecen únicamente a expensas de compuestos inorgánicos (iones minerales), sin
utilizar la luz solar como fuente de energía, se llaman autótrofos, quimiotróficos, quimioautótrofos o
quimiolitotróficos. Al igual que los organismos fotosintéticos, todos los autótrofos utilizan CO 2 como
fuente de carbono para el crecimiento. Curiosamente, la fuente de energía para tales organismos es
la oxidación de compuestos inorgánicos específicos. El compuesto inorgánico que se oxida depende
de los microorganismos en cuestión. Muchos autótrofos no crecen en medios que contienen materia
orgánica, incluso agar.

También se encuentran entre los microorganismos autotróficos las bacterias oxidantes de azufre u
oxidantes de compuestos de azufre, que rara vez exhiben un modo de metabolismo estrictamente
autotrófico como las bacterias nitrificantes obligatorias. Los compuestos de azufre representativos
oxidados por tales bacterias son H2S, S2 y S2O3. Entre las bacterias del azufre se encuentran dos
organismos muy interesantes; Thiobacillus ferrooxidans, que obtiene su energía para el crecimiento
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autotrófico oxidando el azufre elemental o el hierro ferroso, y T. denitrificans, que obtiene su energía
oxidando S2O3 de forma anaeróbica, utilizando NO3- como el único aceptor terminal de electrones.
Todas las bacterias autotróficas deben asimilar el CO2, que se reduce a la glucosa a partir de la cual
se sintetiza la materia celular orgánica. La energía para este proceso biosintético se deriva de la
oxidación de compuestos inorgánicos discutida en el párrafo anterior. Obsérvese que todas las
bacterias autotróficas y fototróficas poseen esencialmente los mismos constituyentes celulares
orgánicos que se encuentran en las bacterias heterotróficas; Desde el punto de vista nutricional, sin
embargo, el modo autotrófico del metabolismo es único, ocurriendo sólo en bacterias.

4. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA

4.1 Normas de seguridad:

El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.

4.2 Equipos de protección personal:

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

• Bata de laboratorio.
• Guantes de nitrilo.
• Gafas de seguridad.

Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su
intercambio con los demás compañeros de laboratorio.

4.3 Manejo de residuos químicos:

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los
residuos generados en las prácticas del laboratorio de química en forma adecuada. Por ello el
estudiante debe:

 Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los cuales
están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.

 Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no


controladas y potencialmente peligrosas.

 No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el desarrollo de la
práctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le
indicará la forma correcta de hacerlo.

5. PROCEDIMIENTO
5.1 MATERIALES
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Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por grupo:

ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES


15mL de caldo para Tiobacilos
1 1 mL
acidófilos
15mL de caldo para Tiobacilos
2 1 mL
neutrófilos
3 50Ml de Caldo Api 1 mL
4 Caja de Láminas portaobjetos 1 UN Por mesón de trabajo
5 Caja de Laminillas cubreobjetos 1 UN Por mesón de trabajo

5.2 REACTIVOS

Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por grupo:

ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES


NA NA NA NA NA

5.3 EQUIPOS

Tabla 3. Listado de equipos necesarios para el desarrollo de la práctica por grupo:

ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES


1 Microscopio 1 UN
2 Micropipeta 100 – 1000uL 1 UN

5.4 SOLUCIONES
Tabla 4. Listado de soluciones que requieren estar listas para el día de la práctica:

ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES


1 Kit Tinción de Gram 1 UN Por mesón de trabajo

5.5 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

5.5.1 Preparación de la columna


 Cortar con cuidado la parte superior de una botella de plástico.
 Dibujar dos líneas cortas en la botella: una a un cuarto del fondo de la botella, la otra un cuarto del
camino desde la parte superior.
 Adicionar una porción abundante de papel periódico (sin tinta) en la parte inferior de la botella
seguido de cáscaras de huevo y 10g de sulfato de magnesio hasta la primera marca de marcador.
 Adicionar lodo proveniente de una PTAR, lago, río o cualquier otra fuente hasta la segunda marca
de la botella.
 Adicionar agua residual o agua de lago, río o cualquier otra fuente (no use agua potable) hasta la
parte superior de la botella.
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 Cubrir la superficie con papel vinipel.


 Incubar durante 15 días a 1 mes con fotoperiodos de 12 horas.

5.5.2 Identificación de Morfologías


 Retire cuidadosamente la parte líquida de la columna.
 Realizar cortes transversales en las diferentes secciones de la columna.
 Preparar láminas en fresco de las diferentes fases.
 Realizar tinción de Gram para diferenciar las diferentes bacterias presentes.

5.5.3 Aislamiento de Bacterias Sultato Reductoras


 Tomar una porción del cultivo de la parte inferior y adicionarla en 25mL de caldo API.
 Homogenizar todo el cultivo.
 Cubrir con parafina liquida toda la superficie del medio de cultivo.
 Incubar durante 5 días a una temperatura de 30°C.
 Finalizado el tiempo de incubación realizar la caracterización macroscópica del cultivo. La aparición
de una coloración negra en el cultivo indica la presente de Bacterias Sultato Reductoras

5.5.4 Aislamiento de Thiobacillus sp acidófilos


 Tomar aproximadamente 1g/1mL de la parte media de la columna y adicionarlas en el medio
Tiobacilos acidófilos.
 Incubar durante 5 días a una temperatura de 30°C en oscuridad.
 Finalizado el tiempo de incubación realizar la caracterización macroscópica del cultivo. La
presencia de turbidez indica la presencia de Tiobacilos acidófilos.

5.5.5 Aislamiento de Thiobacillus sp neutrófilos


 Tomar aproximadamente 1g/1mL de la parte media de la columna y adicionarlas en el medio
Tiobacilos neutrófilos.
 Incubar durante 5 días a una temperatura de 30°C en oscuridad.
 Finalizado el tiempo de incubación realizar la caracterización macroscópica del cultivo. La
presencia de turbidez indica la presencia de Tiobacilos neutrófilos.

5.6 PAUTAS PARA EL ANÁLISIS DE RESULTADOS


 ¿Cómo influyen la cáscara de huevo, la puntilla y el papel en el desarrollo de los diferentes
microorganismos de la columna?
 Mencione que reacciones están ocurriendo en cada una de las fases de la columna de
Winogradsky. Tenga en cuenta los donadores y aceptores de electrones.

6. BIBLIOGRAFÍA

 Brock T.D. Madigan M.T. Martenko J.J. y Parker J. (Eds) Biología de los microorganismos. 13ª
Edición. Prentice Hall International. (2014).
 Hao T, Xiang P, Mackey H, Chi K, Lu H, Chui H, van Loosdrecht M, Chen G. A review of biological
sulfate conversions in wastewater treatment. Water research 2014; 65, 1 – 21
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 Tang K, Baskaran V, Nemati M. Bacteria of the sulphur cycle: An overview of microbiology,


biokinetics and their role in petroleum and mining industries. Biochemical Engineering Journal 2009;
44, 73 – 94.
 Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. Microbiology: an introduction. Harlow: Pearson. (2016).

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