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En el otro extremo, hay viveristas que, antes de efectuar una siembra en gran
escala, prefieren efectuar su propio ensayo de germinación en su vivero. Los
resultados de estos ensayos deben ser directamente aplicables a siembras
ulteriores del mismo lote en el mismo vivero, pero no tienen por qué serlo a otros
viveros. No obstante, a veces no hay tiempo suficiente para efectuar ensayos de
germinación antes de la siembra principal, y los administradores de grandes
viveros operacionales pueden ser reacios a iniciar una investigación en pequeña
escala.
Con pocas excepciones, todos los ensayos de germinación deben efectuarse con
semillas puras separadas mediante el ensayo de pureza. Se mezcla bien la semilla
pura y se cuenta aleatoriamente en réplicas. Después se espacian de manera
uniforme sobre el substrato del ensayo. Normalmente un ensayo consta de 400
semillas en 4 réplicas de 100 semillas cada una, pero, si 100 semillas son
demasiadas para el substrato de que se dispone, entonces las replicaciones
pueden subdividirse en un número mayor de réplicas más pequeñas, de 50 ó 25
semillas cada una (Bonner 1974). Se recomienda de manera general dejar entre
las semillas entre 1,5 y 5 veces la anchura o el diámetro normal de la semilla, para
reducir el riesgo de que se desarrollen mohos de hongos (Bonner 1974, Justice
1972).
Las excepciones son las especies que tienen la semilla muy pequeña, pues en
ellas es imposible (algunas especies de Eucalyptus) o muy difícil
(Alnus, Betula, Populus, Salix) separar la semilla de la materia inerte o granzas
que la acompañan. En estos casos el ensayo se efectúa con el mismo número de
réplicas, pero éstas son de igual peso y no de igual número de semillas (véase las
páginas 322–323).
Equipo de germinación
Otros inconvenientes de este equipo son que exige una gran cantidad de espacio
en superficie en relación con el número de ensayos que se pueden realizar, y
también que manipular las cubiertas y los substratos parece más pesado que
mover una ligera bandeja con substratos de papel (Justice 1972).
El aparato de Rodewald consiste en una caja de zinc con tapa de cristal en cuyo
interior las semillas están expuestas a la luz directa o difusa. La base del aparato
contiene agua, y encima de ésta hay una bandeja con una capa de arena húmeda.
El semillero está compuesto por unos platos de porcelana sin vidriar colocados en
la arena húmeda, aunque a veces se colocan directamente los platos sobre el
agua. La temperatura de ésta se controla mediante un termostato, y la arena se
humedece mediante unas mechas que llegan hasta el agua. El substrato de arena
no está indicado en las especies que necesitan una alternancia de temperaturas,
pues tarda en ajustarse a los cambios térmicos.
temperatura del aire - ajustable entre 10° y 35°C; en toda la sección de trabajo del
armario, y a lo largo de una serie de días, la temperatura ha de ser uniforme en
cada uno de los regímenes térmicos, con variaciones de más o menos 1°C;
luz - iluminación uniforme de las bandejas, con intensidad de entre 750 y 1 250 lux
al nivel de las semillas;
movimiento del aire - el mínimo posible para evitar que las semillas se sequen en
exceso;
suministro de aire fresco - escaso, del orden de un cambio de aire por hora, que
debe ser suficiente para eliminar el dióxido de carbono que producen las semillas
al germinar;
En Honduras se utilizan cajas de 178 × 117 mm, con 72 mm de fondo, cada una
de las cuales contiene una réplica de 100 semillas de pino. De esta manera entre
cada semilla y la siguiente queda como mínimo un espacio equivalente a la
anchura de una semilla. Cuando se trata de especies cuya semilla es de mayor
tamaño se colocan menos semillas por caja. Puede utilizarse cualquiera de los
substratos habituales que se describen infra en este mismo capítulo, como por
ejemplo papel filtro o arena. Añadiendo al substrato una cantidad adecuada de
agua al comienzo del ensayo y teniendo después las cajas tapadas en todo
momento, salvo cuando se va a evaluar o sacar los gérmenes, se puede mantener
alto y constante el contenido de humedad del substrato y del aire encerrado en las
cajas, sin necesidad de añadir después más agua ni de controlar la humedad en la
atmósfera que rodea las cajas. Cuando se utiliza como substrato papel filtro o
papel secante, este material puede mantenerse permanentemente húmedo
colocándolo en una plataforma elevada sobre un depósito de agua conectado con
el substrato mediante unas mechas. Esta disposición se asemeja, en miniatura, a
la del aparato de Jacobsen. Las cajas pueden colocarse en una incubadora para
controlar la temperatura y la luz conforme a las recomendaciones de la ISTA por
ejemplo, o, cuando no se dispone de incubadora, pueden almacenarse en
condiciones de temperatua y luz ambientales. En ambos casos las semillas en
germinación que se encuentran en las cajas deben disponer de las condiciones
óptimas de humedad.
9.12 Cubeta de Copenhague y rollos de papel filtro para ensayos de germinación. (Centro de Semillas
Forestales de DANIDA)
Los ensayos efectuados con esta caja de germinación han ofrecido resultados muy
comparables a los obtenidos con las placas Petri, que son mucho más pequeñas y
por lo tanto más incómodas. Se comprobó que al cabo de cuatro semanas la
menor pérdida de humedad se había producido en las cajas que tenían el depósito
de agua lleno al principio del ensayo y que no tenían orificios de ventilación. El tipo
de plástico transparente y el de plástico negro resultaron a este respecto
igualmente buenos, pero el desarrollo de mohos fue mayor en el tipo de plástico
negro (sellado) que en el de plástico transparente. Si se colocaba sobre Kimpak
(papel de celulosa) un substrato de papel secante, la pérdida de humedad era más
lenta que cuando se utilizaba únicamente Kimpak.
Elección del germinador. Casi todos los laboratorios de semillas forestales que
procesan una cantidad moderada de muestras utilizan germinadores del tipo
armario o del tipo mesa. En un informe de Boeke y otros (1969) se recomienda a
los laboratorios de ensayo de semillas pequeños que utilicen exclusivamente los
germinadores de tipo armario. Los armarios tienen, sobre las mesas de
germinación del tipo Copenhague las ventajas de que ahorran espacio y, cuando
están bien construidos, permiten un control más preciso de la temperatura y la
humedad (Oomen y Koppe 1969). Hay que señalar que un depósito de
Copenhague de un solo nivel exige una cantidad de espacio en planta entre cinco
y ocho veces mayor que la que ocupa un armario de igual capacidad (Boeke y
otros 1969). Cuando se están investigando las condiciones de germinación, o
cuando se están realizando ensayos sobre muchas semillas distintas, puede ser
muy útil la flexibilidad que ofrecen varios armarios que funcionan a diferentes
temperaturas y/o condiciones de luz.
Condiciones de la germinación
La elección del medio en el que se va a colocar las semillas para que germinen
depende del equipo, la especie, las condiciones de trabajo y la experiencia del
operario. En las Reglas de la ISTA se prescribe el material adecuado para diversos
árboles forestales (véase el Cuadro 9.2, páginas 312–313).
El papel filtro, el cartón fuerte o cualquier otro papel absorbente pueden unirse a
una mecha de papel filtro o algodón que está sumergida en agua por el otro
extremo, o pueden colocarse encima de una capa de arena o vermiculita. El papel
de celulosa se utiliza cada vez más como medio de germinación debido a que es
más fácil manipular que la arena y permite igualmente que penetre en él la
radícula, lo que facilita una mejor evaluación de la germinación anormal. Además,
el contenido de humedad no tiende a estratificarse dentro del medio de papel, a
diferencia de lo que ocurre con la arena (Belcher 1974).
Los mejores substratos de papel para la germinación son el papel secante, las
toallas de papel, el papel filtro de laboratorio y el papel de celulosa plisado que se
utiliza como relleno (Bonner 1974). Siempre que se utilice un substrato de papel
debe comprobarse que no están presentes en él sustancias químicas tóxicas. En
las Reglas de la ISTA de 1976 figuran especificaciones pormenorizadas sobre
tipos de papel y toallas, incluidos aspectos como el peso, la resistencia al estallido,
la ascensión capilar y la acidez.
Las semillas que no tienen una necesidad de luz específica pueden colocarse
encima del papel o dentro del papel plegado. Este incrementa la superficie de
contacto entre las semillas y la fuente de humedad. Las semillas grandes pueden
enrollarse en toallas de papel que después se colocan en vertical; esto hace que
las raíces puedan crecer hacia abajo y evita que se enreden (MacKay 1972). Estos
paquetes de papel enrollado o plegado pueden mantenerse húmedos sin
necesidad de una mecha sumergida en agua. Los rollos de papel con semillas
pueden almacenarse en platos de vidrio colocados encima de un depósito de
agua, pero no en contacto con ésta, y después se cubre el conjunto con polietileno
(Knudsen 1982). Los rollos en los que se adviertan signos de desecación pueden
rociarse con agua. La utilización de papel enrollado es un método muy rápido y
cómodo, pero puede hacer que las radículas se encrespen. Esto no importa
cuando tras el ensayo no se van a utilizar las semillas germinadas. En casos de
germinación operacional de grandes cantidades de semilla, en cambio, es
preferible el método de papel plegado, aunque sea algo más lento. En Tailandia se
utiliza con éxito este método como práctica habitual con Pinus y Eucaliptus
spp. (Sirikul 1975).
Luz. Las semillas de muchas especies arbóreas necesitan luz para germinar. La
luz fluorescente es tan eficaz como la luz diurna natural, y se prefiere en los
ensayos debido a que, dentro de unos límites, pueden normalizarse la longitud de
onda y la intensidad. Se recomiendan, por la calidad de su luz y el poco calor que
emiten, las lámparas fluorescentes de luz blanca y fría. La luz debe estar
distribuida, de manera uniforme por toda la superficie del ensayo, y su intensidad
debe oscilar entre 750 y 1 250 lux. Las semillas deben tener luz únicamente
durante una parte del período de ensayo, por lo general 8 horas de cada 24, pero
en el caso de las semillas de algunas especies puede ser conveniente alargar o
acortar ese tiempo.
Lucha contra los hongos en los ensayos de germinación. Entre las prácticas de
laboratorio que están encaminadas a reducir el mínimo la difusión de hongos
figuran las consistentes en colocar las semillas en el espaciamiento adecuado,
controlar la temperatura, retirar las semillas podridas, ventilar adecuadamente y
mantener el substrato con un nivel de humedad que no sobrepase el necesario
para que se produzca la germinación. También es útil esterilizar el equipo de
laboratorio y desinfectar periódicamente los armarios de germinación y otros
aparatos. Como norma general, la semilla no se desinfecta, pues las semillas que
presentan podredumbre suelen ser de escasa calidad. Magini (1962) afirma que en
diversos experimentos efectuados con distintos métodos de desinfección de la
semilla un poco antes de la germinación o durante ella no se obtuvo una mejora
fiable del porcentaje de germinación. Al ensayar semillas de coníferas en
Dinamarca se comprobó, en cambio, que era beneficioso añadir una pequeña
cantidad de fungicida al agua que se utiliza para humedecer los rollos de papel
(Knudsen 1982). En Australia, al ensayar las semillas de eucalipto en papel de
filtro humedecido sobre una capa de vermiculita, resultó también eficaz rociar con
fungicida Karathane a una concentración de 0,8 g en un litro de agua destilada
(Boland y otros 1980).
Cuadro 9.1
Cuadro 9.2
Tomado de ISTA (1976), Cuadro 5A. Métodos de germinación. Parte II, Semillas
de Arboles. (Comprende las modificaciones introducidas en ISTA 1978).
En este cuadro figuran los substratos, temperaturas y períodos de tiempo que se
pueden utilizar, así como otras recomendaciones, como por ejemplo tratamientos
especiales para muestras durmientes. En el caso de las especies de la sección 1,
los métodos de las columnas 2–6 son prescriptivos, y no pueden utilizarse otros.
Con las especies de la sección 2 pueden utilizarse otros métodos siempre que el
método elegido se indique en el Certificado Internacional de Análisis.
Cupressus
sempervirens
PSP 20 L 7 28
Evaluación
En los Cuadros 9.1 y 9.2 puede observarse que lo habitual es que los ensayos
duren entre dos y cinco semanas, pero en este tiempo no está incluido el posible
período de tratamiento previo para romper la latencia (véase el Capítulo 8). Son
muchas las especies que no necesitan un tratamiento previo, y algunos tipos de
latencia de la cubierta seminal pueden tratarse satisfactoriamente en cuestión de
horas. El tratamiento previo que se prescribe para Tectona, en cambio, dura 18
días, y en algunos casos el enfriamiento previo que está prescrito debe
prolongarse durante 3–9 meses. Al planificar un programa de ensayos es
necesario tener en cuenta no sólo el tiempo del ensayo propiamente dicho, sino
también el del tratamiento previo. En casos extremos puede ser necesario sustituir
el ensayo de germinación por uno de los ensayos indirectos de viabilidad que se
describen infra.
Energía de germinación
Valor de germinación
El concepto de valor de germinación, tal como lo define Czabator (1962), tiene por
finalidad combinar en una sola cifra una expresión de la germinación total al
término del período de ensayo y una expresión de la energía o velocidad de
germinación. La germinación total se expresa en forma de germinación diaria
media (GDM) (final), que se calcula como el porcentaje acumulado de semillas
llenas germinadas al final del ensayo dividido por el número de días que
transcurren desde la siembra hasta el término del ensayo. La velocidad de
germinación se expresa en forma de valor máximo (VM), que es la germinación
diaria media máxima (porcentaje acumulado de germinación de semilla llena
dividido por el número de días transcurridos desde la fecha de siembra) que se
alcanza en cualquier momento del período del ensayo. El valor de
germinación (VG) puede por tanto calcularse mediante la fórmula siguiente:
VG = GDM (final) × VM
donde:
VG = Valor de la germinación
PG = Porcentaje de germinación al final del ensayo
VGD = Velocidad de germinación diaria, que se obtiene dividiendo
el porcentaje de germinación acumulado por el número de
días transcurridos desde la siembra
ΣVGD = Total que se obtienen sumando todas las cifras de VGD
obtenidas en los recuentos diarios
N = Número de recuentos diarios, empezando a contar a partir
de la fecha de la primera germinación
Los cálculos que se requieren son algo más largos que los del método de
Czabator, y, en el caso de muchas modalidades de germinación, es probable que
el método más sencillo permita establecer comparaciones entre lotes
suficientemente exactas. En las páginas 344–345 se ofrecen ejemplos de cálculo
del VG con uno y otro método.
“Tomar 400 semillas puras y dividirlas en cuatro muestras, cada una de 100
semillas. Tomar cuatro cajas de madera o plástico (son muy aconsejables las cajas
de varias capas de plástico flexible opaco) de 30 × 30 cm y unos 10 cm de fondo y
llenarlas al máximo, casi un poco en exceso, de arena cernida, hasta llegar al
límite superior de las paredes. Mojar la arena poniendo en cada caja medio litro de
agua. Nivelar la arena enrasándola con la parte superior de la caja y hacer a
intervalos de 2,5 cm unos orificios de 6 mm de profundidad (en el caso de P.
oocarpa los orificios deben tener sólo 3 mm de profundidad). Sembrar las semillas
(100) a intervalos de 2,5 cm y, presionando suavemente, introducirlas en los
orificios abiertos en la arena. Cubrir con una capa de 6 mm (3 mm en P. oocarpa)
de arena que pase por un tamiz del No 12 (4,76 mm de malla) pero no por uno del
No 8 (3, 18 mm). Mojar ligeramente con un nebulizador fino. Tapar con polietileno
transparente de 0,2 mm de grosor montado sobre la parte superior de un bastidor
de madera cuadrado, perfectamente ajustado, de 5 cm de grosor. A las 24 horas
se apreciará condensación por la parte interior de la tapa de polietileno. Si durante
los siete días siguientes se observa en algún momento que ha desaparecido la
humedad, rociar ligeramente con un nebulizador y volver a tapar. Lo normal es que
la germinación se inicie el séptimo día, momento en el que se puede quitar la tapa.
Mantener la arena húmeda. Se considera que una semilla ha germinado cuando
ha alcanzado una altura de 1 cm en total, con la cubierta que recubre los
cotiledones. Llevar un registro distinto para cada una de las cuatro cajas y
consignar en él toda la germinación que se produce entre el séptimo y el vigésimo
octavo día. Sacar los gérmenes nada más registrarlos, y sacar también todos los
gérmenes enfermos, aunque no hayan alcanzado la altura de 1 cm, para evitar que
infecten a otros.
Cuadro 9.3
En este cuadro se indica el intervalo máximo (es decir, la diferencia máxima entre
el valor más alto y el más bajo) de porcentaje de germinación que es tolerable
entre réplicas, lo que permite una variación de muestreo aleatorio solamente con
una probabilidad de 0,025. Para hallar el máximo intervalo tolerado en un caso
determinado, hay que calcular el porcentaje medio, redondeado al número entero
más próximo, de las cuatro réplicas: en caso necesario, se formarán réplicas de
100 semillas combinando las subréplicas de 50 ó 25 semillas que estaban más
próximas en el germinador. Después se localiza el promedio en la columna 1 ó 2
del cuadro y se lee el intervalo máximo tolerado correspondiente en la columna 3.
Ensayo de corte
En este método se tiñen de rojo las células vivas mediante la reducción de una sal
de tetrazolio, que es incolora, para formar un formazano rojo. Se hace hincapié en
la necesidad de conocer la viabilidad de las distintas partes del embrión para
predecir el desarrollo de embriones y su conversión en gérmenes que se puedan
contar (Moore 1973).
Moore (1973) admite que para que este “ensayo de sentido común” funcione
perfectamente es necesario contar con un analista experimentado. Es indudable
que puede ser útil para determinar la viabilidad de algunas especies, siempre que
se disponga de personal capacitado para preparar las semillas y evaluar los
resultados.
Este método consiste en dejar las semillas en remojo durante 1–4 días y después
excindir los embriones de las semillas y colocarlos en papel filtro o discos secantes
humedecidos en placas Petri. Se colocan después a la luz, con una temperatura
constante de 20°C. Todos los días se examina el estado de los embriones. Según
la especie y el lote de que se trate, el ensayo puede concluir en unos pocos días,
prolongarse hasta un máximo de 14 días o mantenerse hasta que es posible
diferenciar claramente los embriones viables de los no viables.
Métodos radiográficos
Hace más de 70 años que se utilizaron por vez primera las radiografías para
determinar la calidad de las semillas (Lundstrom, 1903, citado por Kamra 1964).
Los estudios de Simak y Gustafsson (1953) destacaron la importancia de la técnica
de rayos X como método de diagnóstico en el análisis de las semillas arbóreas. Se
desarrolló así el método de contraste con rayos X, que utiliza diversos agentes de
contraste o radiopacos y que se ha aplicado con éxito a especies
de Pinus y Picea (Simak 1957; Kamra 1963a, b).
Cuadro 9.4
Especie CD
IA II A III A IV A II P II B III B IV B
Pinus sylvestris 0 50 88 99 0 5 43 68
Picea abies 0 36 82 97 0 15 71 92
La clave de las distintas clases de desarrollo (CD) puede encontrarse en la Figura
9.16.
Peróxido de hidrógeno
9.18 Semillas
de Quercus cortadas
por la mitad para pasar
a la estufa, a fin de
determinar su
contenido de humedad.
(Servicio Forestal,
Dpto. Agric. EE.UU.)