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Determinación de aminoácidos terminales con grupo alfa amino libre. Método SECCIÓN II
de Sanger
Introducción:
Método de Sanger
En 1945, el problema del estudio del
orden exacto de los aminoácidos en
una proteína era muy complejo, que
muchos científicos de la época
pensaban que no llegarían a
conocerlo. El progreso técnico que
permitió adquirir este conocimiento se
debió a Frederick Sanger, quien
identificó el aminoácido del extremo de
las cadenas peptídicas marcando
dicho extremo libre con un grupo
dinitrofenilo (DNP). Después de
hidrolizar la proteína, identificó por
cromatografía de papel el derivado de
DNP-aa.
Cuya utilidad de dicha reacción
depende de la estabilidad del grupo
DNP frente a la hidrólisis ácida Por
fortuna este enlace es estable en la
mayor parte de derivados
dinitrofenilados con DNP.
El reactivo empleado para este fin fue
el 1-fluor, 2,4-dinitrobenceno(FDNB), y
desde que comenzó el estudio de este
se han probado muchos otros
reactivos entre las técnicas más
prometedoras y provechosas, se
encuentra el método creado en 1950
por Edman. en este caso se hace
reaccionar feniltiocianato con el
aminoácido del extremo N, alm tratar
con H+ el feniltiocarbamato que se
obtiene, aparece un compuesto
cíclico, formándose un derivado de
tipo feniltiohidantoina del aminoácido
del extremo N. L a feniltiohidantoina
puede hidrolizarse e identificarse
posteriormente.
La gran ventaja de esta técnica con
respecto a Sanger es que puede
repetirse la maniobra, lo que permite
el análisis sucesivo de 5-8
aminoácidos en el extremo N de un
polipéptido.
Hemoglobina
La hemoglobina tiene múltiples
funciones:
Transporte de oxígeno desde los
pulmones a los tejidos, principalmente
para facilitar la fosforilación oxidativa
en la mitocondria.
El transporte de dióxido de carbono
desde los tejidos hasta los pulmones
en forma de carbaminohemoglobina.
Los compuestos carbamino pueden
formarse por una reacción entre el
dióxido de carbono y la hemoglobina,
en donde el primero se combina con
cualquier grupo amino disponible en
las cadenas globina para formar
carbamatos, sin embargo los grupos
amino solo se encuentran dispònibles
en el grupo alfa amino N-terminal de
cada cadena de globina y en las
cadenas laterales de los residuos de
valina.
La amortiguación de iones hidrógeno
formados en el eritrocito por la
conversión de dióxido de carbono en
bicarbonato.
Aproximadamente un 89% de dióxido
de carbono en la sangre se encuentra
en forma de iones bicarbonato otra
parte es disuelta
Metabolizaciòn de óxido nítrico. Ya
que se une a este para desactivar la
molécula fisiológica vasoactiva(que
tiene características vasoconstrictoras)
reaccionando rápidamente con el
grupo hemo y también puede
reaccionar con grupos sulfhidrilo de
residuos de cisteína en las cadenas β-
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de Sanger

Globina. DNP-VAL 0.7286

Objetivo: Identificación de
DNFB 0.5429
aminoácidos con grupos amino alfa
terminal a partir de la hemoglobina MUESTRA 0.7289

bovina.
Análisis técnica Comparación entre reacción de
Se realiza el marcaje del aminoácido Sanger y Edman
terminal con DNFB observando un Reacción Sanger Reacción Edman
color amarillo. Se acidifica
No permite el análisis Permite el análisis
cuidadosamente con HCl 6 N. Se sucesivo (no puede sucesivo(puede repetirse)
repetirse)
extrae la solución acidificada con éter
sin peróxido (conservado en FeSO4) Empleo de ácido fuerte Se emplea un ácido débil
HCl TFA (Ácido
se añaden volúmenes pequeños y se trifluoroacético)
realiza la extracción con pipetas hasta
Aplicar Temperatura y
que el éter es incoloro, Presión
Tabla de resultados Se emplea el compuesto Se emplea
Rf = Movimiento de banda soluto / FDNB Fenilisotiocianato

movimiento del frente del solvente Derivado DNP Derivado PTH

sustituyendo valores para nuestra
muestra Rf = 28.5 / 39.1 = 0.7289 Discusión:
y de esa forma para los demás casos. La Valina es el aminoácido terminal de
las 4 cadenas de aminoácidos que
posee la hemoglobina, teóricamente el
aminoácido problema que debimos
observar en la cromatografía, debió
de haber sido la Valina pero
comparando el Rf de la primera franja
de nuestro problema no concuerda
con el Rf de la Valina patrón, esta
tiene una correlación mayor con el Rf
del DNFB lo cual nos dice que existe
contaminante del DNFB, esto podría
deberse a que la extracción con el
éter no fue tan satisfactoria, se
encuentra una segunda banda a un Rf
mayor al de los patrones esto podría
deberse a otro contaminante en el
Compuesto Rf problema.
El método de Sanger es tardado,
DNP-ASP 0.8213
laborioso y además solo podemos
DNP-AL 0.6467 determinar el aminoácido terminal.
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Determinación de aminoácidos terminales con grupo alfa amino libre. Método SECCIÓN II
de Sanger

Conclusión:
Consideramos los resultados
obtenidos de Rf similares entre
nuestra muestra y la valina por lo que
podemos decir que son iguales, de
acuerdo a la investigación realizada
los resultados fueron los esperados.
El método de sanger es un método
básico pero práctico para la
determinación de aminoácido de
cadena terminal N, ya que como
sabemos existen métodos mucho más
convenientes para realizar este tipo de
determinaciones, sin embargo no le
quita importancia y el mérito a
Frederick Sanger quien fue el que lo
desarrolló y a partir de su trabajo,
permitió mejorar nuestro
entendimiento de las proteínas como
estudiantes de la carrera de ingeniería
bioquímica.
Bibliografía:
Reginald H.G, Charles M.G
Biochemistry 2nd Edition Saunders
College 1999 USA .pp.132-134

Caroline Thomas, Continuing

Education in Anaesthesia Critical Care
& Pain, Volume 12, Issue 5, 1 October
2012, Pages 251–256, Physiology of
haemoglobin Consultado el 19 de
febrero 2019 en:
https://doi.org/10.1093/bjaceaccp/mks
025

Rendina, George Técnicas de

Bioquímica aplicada Nueva Editorial
Interamericana 1974 México pp. 74-79