RECONOCIMIENTO DE BIOMOLÉCULAS

I. PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

Los seres vivos y todo el material que de ellos se deriva, está formado por diferentes tipos de
compuestos que se pueden identificar (cualificar) y cuantificar. Conocer cuáles son esas sustancias,
permite generar ideas sobre la posible función, propiedades y usos que estas puedan tener. La
identificación cualitativa se realiza por medio de reacciones específicas, cuyo producto es coloreado
y de fácil detección.

En esta práctica se pretende contestar las siguientes preguntas: ¿Cuál es la composición mayoritaria
en términos de las biomoléculas del material (muestras) a estudiar en esta práctica de laboratorio?
¿Cómo actúan los reactivos (tabla1) que permiten detectar la presencia de biomoléculas en las
diferentes muestras? Para esto último usted debe hacer una investigación exhaustiva que le permitirá
establecer sus resultados esperados a partir de la naturaleza química del reactivo y del contenido de
las diferentes biomoléculas en cada una de las muestras. Así mismo es importante que en este proceso
identifique en cada caso cuales son sus patrones de comparación positivos y negativos.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Todos los organismos vivos están constituidos por compuestos químicos de tamaño y masa muy
variables denominadas biomoléculas. Estas sustancias se clasifican en inorgánicas y orgánicas,
siendo el agua la sustancia inorgánica más importante para la vida, pues la inmensa mayoría de las
reacciones bioquímicas se desarrollan en medio acuoso. Una pequeña fracción en masa corresponde
a gases, sales, ácidos y a los iones. Las biomoléculas orgánicas como las proteínas, lípidos,
carbohidratos y ácidos nucleicos, están involucradas prácticamente en todos los procesos y
propiedades fisicoquímicas de los seres vivos pertenecientes a los diferentes niveles de organización
biológica.

Proteínas

Son macromoléculas de elevado peso molecular, caracterizadas por su gran variabilidad estructural y
enorme diversidad de funciones biológicas, sin embargo, tienen en común el ser polímeros de α-
L –aminoácidos codificados genéticamente y ordenados en secuencias lineales unidas entre sí por
enlaces peptídicos. La variedad estructural se debe a las múltiples ordenaciones o secuencias que
pueden adoptar los veinte aminoácidos de los cuales están constituidas y que naturalmente se repiten
muchas veces dentro de sus estructuras moleculares espaciales. Las proteínas de cada ser vivo,
independientemente del dominio biológico al que pertenecen, son específicas, a punto de que una
célula típica posee aproximadamente unas tres mil de ellas diferentes. Se ha establecido que las
proteínas que desempeñan la misma función presentan ligeras variaciones estructurales (secuencia
de aminoácidos) en las distintas especies.

La organización espacial de una proteína se expresa en cuatro niveles, que se denominan la

estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria .

Carbohidratos

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Son la fuente primaria de energía para los seres vivos, constituidas fundamentalmente por los grupos
funcionales hidroxilo y carbonilo. De acuerdo con la naturaleza química, los azúcares más simples, de
acuerdo al número de monómeros que los conforman, son los monosacáridos como la glucosa, ribosa
y fructosa. De la misma forma, de las combinaciones de dos a diez monosacáridos se forman
oligosacáridos como la sacarosa, maltosa, lactosa, entre otros. Los polisacáridos tiene más de diez
monosacaridos y pueden ser lineales o ramificados como la celulosa, almidón y el glucógeno. La
celulosa es un polímero lineal cuya función es estructural, es el más abundante en las paredes de las
células vegetales. El almidón es la molécula de almacenamiento de glucosa (energía) en las plantas
y en los animales es el glucógeno. Estos compuestos son polímeros de glucosa que forman cadenas
lineales y ramificadas, en el almidón la cadena lineal o amilosa consta de aproximadamente 200
unidades de glucosa unidas por enlaces glicosídicos α-1,4 y la ramificada o amilopectina resulta de la
unión de glucosas por enlaces α-1,4 y α-1,6. La estructura del glucógeno es similar a la del almidón,
pero con mayor cantidad de moléculas de glucosa y más ramificado. La celulosa es un polímero lineal
con enlaces β-1,4.

Lípidos

Son biomoléculas orgánicas de naturaleza química diferente, a las mencionadas anteriormente se

caracterizan por ser hidrofóbicos, es decir, insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos
como el cloroformo, benceno, alcohol, acetona, y otros. Esto último debido a su estructura donde
sobresalen los ácidos grasos de cadena larga (saturados o insaturados) y el glicerol. Las grasas
insaturadas son líquidas (aceites) y se encuentran abundantemente en los vegetales, mientras que las
saturadas (mantecas) son sólidas y están presentes en los tejidos animales. Son fuente de energía,
hacen parte de la membrana celular como responsables de la permeabilidad selectiva; algunos lípidos
complejos regulan funciones celulares y otros actúan como moléculas de señales químicas. Los lípidos
más importantes son las grasas o triglicéridos, los fosfolípidos y los esteroides como el colesterol.

Ácidos nucleicos

Son polímeros de los nucleótidos (base nitrogenada, azúcar de cinco carbonos y grupo fosfato), su
función es la de portar la información genética necesaria para que los organismos produzcan todos los
factores necesarios para la vida como lo son las proteínas y otros ácidos nucleicos como el ARN. Su
nombre se debe a que fueron aislados de los núcleos celulares. Dentro de las células los ácidos
nucleicos se encuentran combinados con proteínas básicas denominadas histonas, a estas
asociaciones supramoleculares se les denomina nucleoproteínas. Dependiendo del tipo de azúcar
(pentosa) que poseen en su estructura los ácidos nucleicos se dividen en dos clases principales, el
que tiene ribosa se llama ácido ribonucleico (ARN) y el que tiene desoxirribosa es el ácido
desoxirribonucleico (ADN). Estos ácidos nucleicos no solo se encuentran formando el material
hereditario en las células procariotas y eucariotas sino también en organelos como los ribosomas,
mitocondrias y cloroplastos lo que evidencia la versatilidad evolutiva de estas biomoleculas de acuerdo
con su localización y función.

Reconocimiento de biomoléculas

La identificación de las proteínas se hace con el reactivo de Biuret que contiene cobre en solución
alcalina, el cobre forma un complejo con los enlaces peptídicos de péptidos y proteínas, de color rosado

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en los primeros y purpura (morado) en las últimas.
Para reconocimiento de cualquier carbohidrato, oligosacárido, polisacárido o monosacárido se usa la
pruba de Molisch, los dos primeros previamente se hidrolizan con ácido sulfúrico concentrado hasta
monsacáridos , los cuáles se convierten en derivados del furfural o 5-hidroximetil furfural, que
reaccionan con α-naftol formando un producto observable como un anillo de color rosado, violeta o
morado.

En cuanto a los lípidos que contienen ácidos grasos en su estructura hay una reacción particular para
reconocerlos, la de saponificación, durante esta los compuestos se hidrolizan en un medio básico y
se obtienen las sales de los ácidos grasos, es decir jabones, detectables por agitación.

Otros lípidos fundamentales son insaponificables y tienen como núcleo estructural el ciclo
pentanoperhidrofenantreno que se identifica con la prueba de Lieberman-Burchard en esta a una
solución en cloroformo se le adiciona anhidrido acético y ácido sulfúrico, observando una reacción
coloreada que inicia rojo y progresa a verde-azul. Inicialmente los esteroides como el colesterol se
convierten a derivados sulfato y acetato que lentamente se someten a sulfonación en diferentes
posiciones, para luego eliminar los grupos SO3H, produciendo insaturaciones en forma repetitiva y
finalmente polienos y esteroides aromáticos.

El reconocimiento de los ácidos nucleicos puede realizarse con el reactivo de difenilamina, debido a
que en condiciones ácidas reaccionan las desoxirribosas de los nucleótidos de purina formando un
compuesto de color azul con el ADN.

Tabla 1 Reactivos utilizados para la identificación de diferentes moléculas de importancia biológica

BIOMOLÉCULA REACTIVO
PROTEÍNAS Biuret
CARBOHIDRATOS α-naftol, ácido sulfúrico
ÁCIDOS NUCLEICOS Difenilamina
LÍPIDOS Cloroformo, anhídrido
INSAPONIFICABLES acético y ácido sulfúrico
LÍPIDOS NaOH
SAPONIFICABLES
III. MATERIALES Y REACTIVOS.

Materiales por grupo:

2 gradillas

24 tubos de ensayo

1 pinza para tubo

3 pipetas graduadas (1, 5 y 10 mL)

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1 pipeteador

2 vasos de precipitados (50 mL y 250 mL)

3 goteros

Materiales y reactivos generales (el volumen de los reactivos está calculado para 10 grupos) todos los
reactivos con duplicado:

α-naftol (100 ml) Anhídrido acético (100ml)

Reactivo de Biuret (100ml) Ácido sulfúrico concentrado en gotero

(50ml) y en frasco sin gotero (50ml).
NaOH 15% (200ml)
Difenilamina
Cloroformo (100ml)

Reactivo de difenilamina fresco( preparado al empezar la práctica):1 g de difenilamina en 100 ml

de ácido acético glacial y se agregan 2ml de ácido sulfúrico concentrado.

Tabla 2 Soluciones patrón negativos o positivos para esta práctica

PATRONES

Solución de rafinosa 1%

Agua destilada

Caseína al 1% en bicarbonato al 0,9%

Fosfatidilcolina al 1% en cloroformo

Extracto de ácido nucleico( 1/4 de pastilla en 50mL de

agua destilada)

Solución de colesterol al 1% en cloroformo

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IV. PROCEDIMIENTO

Preparación de extractos (a cargo del auxiliar de laboratorio, no se hace diagrama de flujo de

estos procedimientos)

Extracto de papa criolla: macerar cubitos de papa adicionando 8 mL de agua, centrifugar durante 10
minutos y obtener el sobrenadante en un tubo debidamente marcado.

Extracto de harina de trigo: adicionar a 2g de harina de trigo, 100 mL de agua caliente y filtrar con
gasa doble. Obtener el filtrado en un vaso debidamente marcado.

Extracto de cebolla cabezona frescas: pelar y cortar en fragmentos pequeños 5 cebollas cabezonas
y para cada una: colocarla en el mortero y macerar con 50mL de NaCl al 5%, (mantener a 40 oC), filtrar
con gasa o muselina y recojer el filtrado en un vaso de precipitados de 100 mL, adicionar 1ml de SDS
al 1% (dodecil sulfato de sodio), colocar en tubos tapa rosca y mezclar levemente por inversión 10
veces, dejar en reposo por 10 minutos, transcurrido este tiempo, rotar lentamente cada tubo y
simultáneamente adicionar por las paredes 3 mL de isopropanol, se debe observar un precipitado
blanco, colectarlo con una pipeta pasteur o gotero y separar en un tubo marcado.

Extracto hidrofóbico de hígados de pollo: cortar en trozos pequeños 30g de hígados de pollo con poca
sangre, macerar en mortero y adicionar, en varias porciones, ATA en relación 1,5ml/g de tejido(es
decir 45 ml en total). Agregar aproximadamente 2,0g de arena lavada, macerar y centrifugar a 4000
rpm por 10 minutos, desechar el sobrenadante y tomar el residuo, pasar a cápsula de porcelana y
adicionar la mezcla de Etanol- Eter-Cloroformo 2:2:1 en 1,5ml/g de tejido( es decir 45 ml en total),
luego centrifugue a 2500 rpm por 5 minutos, tomar el sobrenadante evaporarlo hasta la mitad de su
volumen original y guardar, este es el extracto a usar.

Identificación de biomoléculas

Para cada prueba de reconocimiento (tabla1) y de acuerdo con su fundamento teórico descrito
previamente en está guía, usted debe seleccionar patrones o parámetros de comparación negativos y
positivos (tabla 2), los primeros también se llaman blancos y son sustancias en las que se espera un
resultado negativo de acuerdo con su naturaleza química, por lo tanto no cambiará el color del reactivo
utilizado para la identificación. En los segundos se espera una prueba positiva porque contienen las
biomoléculas con los grupos necesarios para que ocurra la reacción con los reactivos de
reconocimiento y se observarán productos coloreados o incoloros pero fácilmente detectables por otra
propiedad.

Además para cada prueba de identificación también se debe seleccionar 1 muestra o material de
prueba de la tabla 3, teniendo en cuenta su composición molecular, elija una muestra de alta
concentración de los compuestos de interés y tenga en cuenta la sensibilidad de los reactivos.

Realice con cuidado esta operación de elegir patrones y muestras para una correcta interpretación de
los resultados.

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A. Reconocimiento de carbohidratos
Numere tres tubos de ensayo, en un tubo adicione 2ml del patrón negativo seleccionado (tabla 2), en
otro tubo 2 ml del patrón positivo seleccionado (tabla 2), en el tercero 2 ml de una muestra elegida
de la tabla 3. Adicione 2 gotas de reactivo de Molisch y mezcle cuidadosamente. Con los tubos
inclinados agregue 1ml de ácido sulfúrico concentrado el cual forma una capa de ácido debajo de la
fase acuosa. Observe la coloración del anillo formado en la interfase, use los patrones positivos y
negativos como modelo de comparación y registre sus resultados en tablas. Para interpretar sus
resultados, en todas las pruebas no olvide tener en cuenta el color inicial de patrón o muestra y el color
esperado de la prueba positiva.

B.Reconocimiento de proteínas

Numere tres tubos, en un tubo de ensayo adicione 3ml del patrón negativo seleccionado (tabla 2), en
otro tubo de ensayo 3 ml del patrón positivo seleccionado (tabla 2), en el tercero 3 ml de una muestra
elegida de la tabla 3. Agregue a todos los tubos 2 ml de reactivo de Biuret, agite, observe lo que
sucede y regístrelo en su tabla de datos.

Tabla 3 Composición molecular de las muestras utilizadas en esta práctica

MUESTRAS COMPOSICIÓN

Harina de trigo (100 g) Proteína 10,5g. Grasa total 1g. Carbohidratos 76,1g

Extracto de papa criolla (100 g) Proteína 1,9 g. Lípidos 0,1 g. Carbohidratos 21,6 g

Leche entera (250ml) Proteína 8g. Grasa total 8 g. Carbohidratos 12 g. Colesterol

12 mg.

Leche descremada (250ml) Proteína 6g. Grasa total 0,2g. Carbohidratos 11g.
Colesterol 0 mg.

Leche deslactosada ( 250ml) Proteína 8g. Grasa total 4,5g. Carbohidratos 11g. Colesterol
13 mg.

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 Clara de huevo (100 g) Proteína 10,9g. Carbohidratos 0,73g. Triglicéridos 0,17g.
Agua 88,2g.

Aceite de cocina de soya (100 g) Grasa saturada 14,9g. Grasa moninsaturada 43,0g. Grasa
poliinsaturada 37,6g.

Gelatina sin sabor (100 g) Proteína 12,7 g.

Hígado de pollo (100 g) Grasa total 4,7g.Esteroides 492mg. Carbohidratos 1,2g.

Proteínas 22,1g.

Yema de huevo (100 g) Grasa total 30,87g. Esteroides 2,4g. Proteína 16.7g.
Carbohidratos 1,78g.

Cebolla cabezona (100 g) Agua 89,11g. Proteína 1,1g. Carbohidratos 9,34g. Ácidos
nucleicos: 0,93%. Triglicéridos 0,1g.

Fuente: Tabla de composición de alimentos Colombianos. Bogotá: Bienestar Familiar, 2005.

C. Reconocimiento de lípidos saponificables

Numere tres tubos de ensayo, en los dos primeros tubos añada 1 mL de cada patrón (positivo y
negativo de tabla 2), en el tercero 1ml de una muestra (tabla 3). Agregue 3ml de NaOH al 15% a cada
tubo y una perla para ebullición, coloque al baño maría durante 20 minutos y observe con mucha
frecuencia (POR SU SEGURIDAD Y LA DEL GRUPO EN LA CABINA DE EXTRACCIÓN), adicione
3ml de agua destilada y agite fuertemente. Observe y compare con los patrones elegidos.

D. Reconocimiento de lípidos insaponificables

Numere tres tubos de ensayo, en un tubo de ensayo adicione 2ml del patrón negativo seleccionado
(tabla 2), en otro tubo de ensayo 2 ml del patrón positivo seleccionado (tabla 2), en el tercero 2 ml de
una muestra elegida de la tabla 3. Adicione a todos los tubos 3ml de cloroformo y mezcle, luego
agregue 1ml de anhídrido acético cuidadosamente por la paredes del tubo y agite, finalmente coloque
3 gotas de ácido sulfúrico también por la paredes y observe la coloración de la interfase al minuto y a
los 15 minutos. Compare y registre sus resultados.

E.Reconocimiento de ADN

Numere tres tubos de ensayo, en los dos primeros tubos añada 1 mL de cada patrón (positivo y
negativo de tabla 2), en el tercero 1ml de una muestra (tabla 3). A cada tubo adicione 1 ml de agua
destilada, suspenda la muestra, agregue 1ml de difenilamina, mezcle bien y caliente al baño maría
por 10 minutos, sin dejar que haya ebullición, luego enfrie a baño de hielo, observe durante 10 minutos
y registre los resultados en las tablas correspondientes.

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V. BIBLIOGRAFÍA

Badui, Salvador. (2010). Química de los Alimentos. 4 ed. México: Pearson Addison –Wesley.
Curtis, Helena y Barnes, Sue. (2008). Biología. 8 ed. Buenos Aires: Médica Panamericana.Plummer,
David T. (1981). Bioquímica práctica. Barcelona: Editorial Mc Graw-Hill Latinoamericana.