19 OFICINA ESPAÑOLA DE 11 Número de publicación: 2 215 572

PATENTES Y MARCAS

51 Int. Cl. : C12N 15/54
7

C12N 15/82
ESPAÑA
C12N 15/11
C12N 9/10
A01H 5/00

12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3

86 Número de solicitud europea: 00304522 .6

86 Fecha de presentación: 26.05.2000

87 Número de publicación de la solicitud: 1055727

87 Fecha de publicación de la solicitud: 29.11.2000

54 Título: Clonación de una N-metil transferasa implicada en la biosíntesis de la cafeína.

30 Prioridad: 26.05.1999 JP 14635899
73 Titular/es: MITSUI CHEMICALS, Inc.
2-5, Kasumigaseki 3-chome
Chiyoda-ku, Tokyo, JP

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
72 Inventor/es: Mizuno, Misako;
16.10.2004 Ashihara, Hiroshi;
Mizuno, Kouichi y
Fujimura, Tatsuhito

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Roeb Díaz-Álvarez, María
16.10.2004
ES 2 215 572 T3

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Clonación de una N-metil transferasa implicada en la biosíntesis de la cafeína.

5 La presente invención trata de una N-metil transferasa, una de las enzimas que constituyen un sistema de síntesis
de cafeína, que es un polipéptido que tiene simultáneamente tres actividades de tres metil transferasas, 7-metil xantina
N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa, y variantes de la N-metil
transferasa; moléculas de ADN o moléculas de ARN que tienen secuencias nucleotídicas que codifican la N-metil
transferasa o variantes de la misma; vectores que usan estas moléculas y células transformadas con los vectores y sus
10 usos.

La cafeína es un alcaloide púrico contenido en plantas de la familia Theaceae Camellia, tales como Camellia
sinensis o plantas de Rubiaceae Coffea como Coffea arabica o similares. En la actualidad, la cafeína se produce por
extracción de las plantas productoras de cafeína, incluidas las anteriores especies de plantas, o por síntesis orgánica.
15 Además, en plantas como las de té o café, para atenuar o inducir su estímulo, se intenta una reducción o aumento del
contenido de cafeína y sus productos intermedios usando técnicas de alimentación clásicas o similares.

En Phytochemistry, 31-2575-(1992), se describe mediante experimentos usando marcador 14 C que la cafeína se

biosintetiza a partir de xantosina con tres etapas de N-metilación. Esta vía de reacción se muestra a continuación
20

25

30

35

40

45

50

La primera vez que se informó acerca de las actividades enzimáticas que catalizan esta metilación, es decir, las
55
actividades metil transferasa, fue en un estudio que usó extracción COARSE de hojas de té en 1975 (Biochem. J.
164, 87-(1975)). Aunque se han hecho intentos para purificar la metil transferasa a partir de café (Phytochemistry, 37,
1577-(1994), la concentración de la purificación es muy baja.

Este artículo presenta datos acerca de la purificación y la secuencia N terminal de S-adenosil-L-metionina: teo-
60
bromina 1N-metiltransferasa (STM), la enzima responsable de la metilación del teobromina que lleva a la formación
de la cafeína en el café. La STM se purificó a partir de endospermas en desarrollo de frutos inmaduros mediante
DEAE-celulosa, interacción hidrófoba y cromatografía de afinidad, usando como ligando S-adenosil-L-homocisteína.
Mediante filtración en gel y SDS-PAGE se mostró que la enzima tenía una Mt aparente de aproximadamente 54.000
y de aproximadamente 60.000, respectivamente. Mediante cromatoenfoque líquida se obtuvo un pI de 5,1 y de 4,8
65
mediante isoelectroenfoque en electroforesis de gel de poliacrilamida. Usando teobromina como sustrato, el valor de
Km para la S-adenosil-metionina fue 10 µM, sufriendo inhibición competitiva por la S-adenosil-L-homocisteína (Ki=
4,6 µM). La STN es una enzima bifuncional, ya que también es 7-metilxantina metilada, el precursor inmediato del

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teobromina en la ruta de la biosíntesis de la cafeína. La actividad específica de la STM con 7-metilxantina fue de
aproximadamente 55% de la determinada con teobromina. Los valores de Km obtenidos para el teobromina y la 7-me-
tilxantina fueron 0,196 y 0,946 mM, respectivamente. Asimismo, se purificó STM a partir de hojas usando los mismos
procedimientos usados para los endospermas, junto con una cromatografía adicional en una columna de Mono Q; se
5 usó teobromina como sustrato. Por último, se obtuvo la secuencia N-terminal para los primeros 20 aminoácidos para
la STM purificada a partir de endospermas. No se encontraron semejanzas con otras secuencias de metiltransferasa u
otras proteínas conocidas.

En el caso del té, se informó de la purificación parcial de la metil transferasa (Physiol. Plan., 98, 629-(1996), sin
10 embargo no se aisló ninguna proteína enzimática.

Como se ha descrito anteriormente, la secuencia de aminoácidos de la enzima en un sistema de síntesis de cafeína

es una N-metil transferasa que cataliza una reacción de metilación de dos etapas a partir de 7-metil xantina mediante
teobromina a cafeína, que es una reacción final de la biosíntesis de cafeína, ni la secuencia de aminoácidos ni el ADN
15 que codifica la secuencia de aminoácidos se conoce en la técnica anterior.

Es un objeto de la presente invención proporcionar N-metil transferasa, una de las enzimas que constituyen un
sistema de síntesis de cafeína útil para la síntesis de cafeína, que tiene simultáneamente las actividades enzimáticas
de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa, una
20 molécula de ADN o de ARN que codifica la N-metil transferasa útil para la estimulación o supresión de la producción
de cafeína en microorganismos o plantas y vectores similares usando las mismas.

Por ejemplo, toda o parte de la molécula de ADN según la presente invención se incorpora a microorganismos o
células vegetales en la forma de sentido o antisentido, por tanto haciendo posible los siguientes objetos:
25
(1) Producir de forma eficaz N-metil transferasa que pueda usarse como una enzima para uso industrial, alimentario
o médico;

(2) Producir de forma eficaz compuestos relacionados con el metabolismo de la cafeína modificando la biosíntesis
30 de la cafeína y el metabolismo de plantas productoras de cafeína, tejidos vegetales o células vegetales y

(3) Modificar la biosíntesis de cafeína y el metabolismo de plantas productoras de cafeína, tejidos vegetales, modi-
ficando por tanto la tasa de producción de los compuestos relacionados con el metabolismo de la cafeína.

35 Los presentes inventores llevaron a cabo un análisis de la secuencia de aminoácidos N terminal de una N-metil
transferasa, como un polipéptido que tiene simultáneamente las actividades de tres enzimas, 7-metil xantina N3 metil
transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa, que se ha purificado de cotiledones
de té, como resultado del estudio más serio del inventor. En función del resultado se preparó una sonda de ADN y
usando esta sonda se aisló con éxito una molécula de ADN diana mediante técnicas de PCR-RT y técnicas 5’ RACE.
40
Después, se integró la molécula de ADN en un vector y se insertó en Escherichia coli para expresar una gran
cantidad de un polipéptido derivado de una molécula de ADN. Cuando se recuperó el polipéptido expresado y se
investigaron sus propiedades enzimológicas, se observó la misma reacción que la del polipéptido que tiene las activi-
dades de las tres N-metil transferasas descritas anteriormente aisladas de los cotiledones de té, es decir, la producción
45 de cafeína a partir de paraxantina. Por tanto, se verificó que la molécula de ADN tiene un gen que codifica una N-metil
transferasa, una de las enzimas que constituyen un sistema de síntesis de cafeína, simultáneamente con las actividades
de las tres N-metil transferasas descritas anteriormente.

En las plantas en las que la N-metilación se lleva a cabo para una xantosina o un compuesto análogo, o una xantina
50 o un compuesto análogo, usando S-adenosil metionina (SAM) como donante de un grupo metilo, polipéptidos con la
actividad de la N-metil transferasa según la presente invención o la misma actividad enzimática como se estima que
contienen la transferasa y los ADN que codifican estos péptidos. Usando el procedimiento según la invención, a partir
de estas plantas se pueden obtener la N-metil transferasa o sustancialmente la misma enzima como la transferasa y las
moléculas de ADN o ARN que codifican estas transferasas.
55
Los presentes inventores lograron la presente invención en función de los hallazgos anteriores. Es decir, la presente
invención incluye los aspectos siguientes.

La primera molécula de ADN según la presente invención se caracteriza por comprender cualquiera de las siguien-
60 tes secuencias de nucleótidos:

(a) una secuencia de nucleótidos que codifica una N-metil transferasa, como un polipéptido que tiene una secuencia
de aminoácidos de SEC ID Nº1 de la lista de secuencias y que tiene actividades enzimáticas de 7 metil xantina N3
metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa; y
65
(b) una secuencia de nucleótidos modificada obtenida mediante sustitución, deleción o inserción de nucleótidos
en la secuencia nucleotídica (a) descrita anteriormente dentro un intervalo donde un polipéptido codificado por la
secuencia de nucleótidos (a) pueda mantener la actividad enzimática.
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Es preferible que la secuencia nucleotídica modificada (b) pueda hibridar con la secuencia nucleotídica (a) en
condiciones estrictas.

Las primeras moléculas de ARN según la presente invención se caracterizan por comprender cualquiera de las
5 secuencias de nucleótidos siguientes:

(a) una secuencia de nucleótidos que codifica la N-metil transferasa, un polipéptido con una secuencia de aminoá-
cidos de la SEC ID Nº 1 de la lista de secuencias y que tiene las actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil
transferasa, teobromina N1 metil transferasa y para xantina N3 metil transferasa; y
10
(b) una secuencia de nucleótidos modificada obtenida mediante sustitución, deleción o inserción de nucleótidos
en la secuencia nucleotídica (a) descrita anteriormente dentro un intervalo donde un polipéptido codificado por la
secuencia nucleotídica (a) pueda mantener las actividades enzimáticas.

15 Es preferible que la secuencia nucleotídica modificada (b) pueda hibridar con la secuencia nucleotídica (a) en
condiciones estrictas.

Un vector para la expresión de la N-metil transferasa según la presente invención se caracteriza por comprender
la molécula de ADN descrita anteriormente y una constitución para expresar la N-metil transferasa codificada por
20 la primera molécula de ADN, en células vegetales. Las células huésped pueden transformarse usando el vector de
expresión para obtener células transformadas. Además, las células transformadas se cultivan, haciendo posible, por
tanto, producir N-metil transferasa con las actividades enzimáticas anteriores.

Otro aspecto de una molécula de ADN según la presente invención es la segunda molécula de ADN que tiene una
25 secuencia complementaria de toda o parte de la secuencia de nucleótidos de la primera molécula de ADN descrita
anteriormente, caracterizada porque la segunda molécula de ADN es capaz de inhibir las actividades enzimáticas de
las células vegetales cuando se introduce en las células vegetales con las actividades enzimáticas y se expresa en las
células vegetales.

30 Otro aspecto de una molécula de ARN según la presente invención es la segunda molécula de ARN que tiene una
secuencia complementaria de toda o parte de la secuencia de nucleótidos de la primera molécula de ARN descrita
anteriormente, caracterizada porque la segunda molécula de ARN es capaz de inhibir la expresión de las actividades
N-metil transferasa de las células vegetales cuando se introduce en las células vegetales con las actividades N-metil
transferasa y se lleva a cabo su expresión.
35
Un aspecto de un vector según la presente invención se caracteriza por comprender cualquiera de las anteriores
moléculas de ADN y moléculas de ARN. Este vector puede proporcionarse de manera que tenga una función para
hacer posible la expresión de la N-metil transferasa en un microorganismo o una planta, teniendo dicha transferasa
las tres actividades de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil
40 transferasa, como se ha descrito anteriormente.

Usando el vector pueden transformarse microorganismos, células vegetales, tejidos vegetales o cuerpos de plan-
ta y los transformantes obtenidos se incluyen en la presente invención. En plantas se puede producir un metabolito
secundario usando las células vegetales, los tejidos vegetales o los cuerpos de planta transformados. Además, la com-
45 posición del metabolito secundario en las plantas transformadas puede modificarse usando células vegetales, tejidos
vegetales o cuerpos de planta.

La N-metil transferasa según la presente invención es un polipéptido con las actividades enzimáticas de 7-metil
xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa, caracterizado por
50 tener:

(a) una secuencia amino de SEC ID Nº 1 de la lista de secuencias; o

(b) una secuencia de aminoácidos modificada obtenida por sustitución, inserción o deleción de aminoácidos por
55 la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 de la lista de secuencias dentro del intervalo en el que las
actividades enzimáticas descritas anteriormente no se pierden sino que se mantienen.

Respecto a esta secuencia de aminoácidos modificada (b), es preferible que el ADN que codifica la secuencia
aminoacídica (a) y el ADN que codifica esta secuencia aminoacídica modificada (b) puedan hibridar en condiciones
60 estrictas.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una molécula de ADN y una molécula de ARN que codifican
la N-metil transferasa, que es:

65 i) una de las enzimas que constituyen un sistema de síntesis de cafeína.

ii) Útil para la síntesis de cafeína y la modificación de la composición de la cafeína Un polipéptido que tiene
simultáneamente las producida en microorganismos o plantas; y
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iii) tres actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y
paraxantina N3 metil transferasa.

Descripción detallada de la invención y formas de realización preferidas

5
La N-metil transferasa según la presente invención es un polipéptido que tiene simultáneamente las actividades en-
zimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa.

Respecto a la N-metil transferasa puede mencionarse que teniendo una secuencia de aminoácidos indicada por la
10 SEC ID Nº 1 y que teniendo una secuencia de aminoácidos modificada obtenida llevando a cabo sustitución, inserción
o deleción dentro de un intervalo donde la actividad N-metil transferasa deseada no está dañada en la secuencia de
aminoácidos de SEC ID Nº 1. Es decir, los polipéptidos con una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1 que tiene
la actividad N-metil transferasa deseada como se ha descrito anteriormente y aquellos con una secuencia modificada
se denominan N-metil transferasa.
15
El polipéptido anterior que tiene él mismo la secuencia de aminoácidos modificada tiene funciones considerable-
mente idénticas a la N-metil transferasa de los cotiledones de té y tiene una elevada homología con una secuencia de
aminoácidos de SEC ID Nº1 en un sitio asociado con las actividades enzimáticas.

20 En general, entre una pluralidad de enzimas con funciones idénticas, es bien conocido que la homología de la
secuencia de aminoácidos en otro lugar distinto al sitio indispensable para las actividades enzimáticas es muy baja
(Kawagoe y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 12082-(1996)). Por tanto, incluso en el caso en el que toda la
homología sea baja, la transferasa que tiene una homología elevada en un sitio asociado con las actividades puede
clasificarse como N-metil transferasa.
25
Al comparar toda la secuencia de aminoácidos, puede ponerse como ejemplo una secuencia de aminoácidos mo-
dificada que puede proporcionar un polipéptido con la N-metil transferasa deseada y una homología de 15% o más,
preferiblemente una homología de 30% o más, más preferiblemente una homología de 45% o más y todavía más
preferiblemente una homología de 75% o más, la homología más preferible es de 95% o más frente a la secuencia de
30 aminoácidos de SEC ID Nº 1.

En el caso en el que la modificación frente a la secuencia aminoacídica de SEC ID Nº 1 como la base se define a
nivel de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos modificada, puede proporcionarse una
secuencia nucleotídica modificada con una homología de 40% o más, preferiblemente una homología de 60% o más,
35 más preferiblemente una homología de 75% o más, incluso más preferiblemente una homología de 90% o mas, todavía
más preferiblemente una homología de 95% o más frente a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de
aminoácidos de SEC ID Nº 1.

Una secuencia de nucleótidos que codifica la N-metil transferasa según la presente invención, es decir, un gen de
40 N-metil transferasa puede contener una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de SEC
ID Nº 1. Un ejemplo específico de la misma puede incluir una secuencia de ADN de SEC ID Nº 2 y una secuencia
de ARN de SEC ID Nº 3. Una secuencia de nucleótidos con homología RULED ABOVE frente al gen de N-metil
transferasa como base también está incluido en el gen que codifica la N-metil transferasa según la presente invención.

45 Como una secuencia de aminoácidos que mantiene las actividades N-metil transferasas deseadas, sus ejemplos
preferibles incluyen las codificadas por una secuencia de nucleótidos modificada, que puede hibridar en condiciones
estrictas con la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1 como la base.

Además, como el gen modificado de N-metil transferasa, en la práctica puede usarse preferiblemente aquel capaz
50 de hibridar con la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1 en condiciones
estrictas. Un ejemplo específico del mismo puede incluir moléculas de ADN capaces de hibridar en condiciones
estrictas para una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 2; y moléculas de ARN capaces de hibridar en condiciones
estrictas para una secuencia nucleotídica de SEC ID Nº 3.

55 La hibridación en estas condiciones estrictas puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el procedimiento des-
crito en Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Current Protocols in Molecular Biology; Wiley
Interscience. Como un sistema disponible comercialmente, puede ponerse como ejemplo un sistema de GeneImage
(Amersham). Específicamente, la hibridación se puede llevar a cabo mediante la operación siguiente.

60 Una membrana, a la que se han transferido las moléculas de ADN o de ARN que se van a probar, se trata para
la hibridación usando una sonda marcada en un tampón de hibridación especificado por el protocolo de acuerdo con
los protocolos del producto. La composición del tampón de hibridación consiste en 0,1% en peso de SDS, 5% en
peso de sulfato de dextrano; 1/20 de volumen de un reactivo bloqueante incluido en el kit y de 2 a 7 x SSC. Un
reactivo bloqueante se usa preparando 100 x solución de Denhardt, 2% (peso/volumen) de seroalbúmina bovina, 2%
65 (peso/volumen)de FicillTM 400, 2% (peso/volumen) polivinil pirrolidona a una concentración del quíntuple, y diluirlos
a 1/20. Respecto a 20 x SSS, es una solución de cloruro sódico 3M y ácido cítrico 0,3M. Preferiblemente, SSC se usa
a una concentración de 3 a 6 x SSC y más preferiblemente se usa a una concentración de 4 a 5 x SSC.

5
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La temperatura de hibridación varía de 40ºC a 80ºC, más preferiblemente de 50ºC a 70ºC y más preferiblemente
de 55ºC a 65ºC. Se lleva a cabo incubación durante varias horas o una noche, seguido por lavados usando un tampón
de lavado. Preferiblemente, la temperatura de lavado es igual a la temperatura ambiente y más preferiblemente es una
temperatura durante la hibridación. La composición del tampón de lavado es una solución de 6 x SSC + 0,1% en peso
5 de SDS, más preferiblemente una solución 4 x SSC + 0,1% en peso de SDS, todavía más preferiblemente una solución
2 x SSC + 0,1% en peso de SDS, todavía más preferiblemente una solución 1 x SSC + 0,1% en peso de SDS y lo más
preferible es una solución 0,1 x SSC + 0,1% en peso de SDS. Se lava una membrana con dicho tampón de lavado, por
lo cual las moléculas de ADN o las moléculas de ARN en las que la sonda se híbrida pueden identificarse usando un
marcaje empleado para la sonda.
10
La modificación se puede producir en la naturaleza o puede generarse de forma artificial mediante mutación de
sitio en la secuencia de nucleótidos.

Las moléculas de ADN con genes de N-metil transferasa de acuerdo con la presente invención pueden separarse
15 de células productoras de N-metil transferasa según la presente invención usando técnicas de PCR como se describe
en “Plant PCR test protocols” (otro volumen de ingeniería celular, ingeniería de células vegetales serie 2) Shujynsha
(1995), donde se emplea como cebador, por ejemplo, un oligonucleótido que híbrida específicamente con moléculas
de ADN que codifican N-metil transferasa.

20 Específicamente, una molécula de unión se une al ADNc sintetizado a partir del ARNm y se lleva a cabo una PCR
entre la molécula de unión y el ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que constituye la N-metil transferasa,
en el que puede aislarse la secuencia de longitud total del ADNc diana.

Las moléculas de ADN que codifican la N-metil transferasa obtenidas mediante tal técnica de hibridación o técnica
25 de PCR tienen homología con el gen de la N-metil transferasa de la SED ID Nº 2 al menos en un sitio usado para el
aislamiento. La homología usada en la presente invención denota homología de 15% o más, preferiblemente homología
de 30% o más, más preferiblemente homología de 45% o más, todavía más preferiblemente homología de 60% o más,
todavía más preferiblemente homología de 75% o más, incluso más preferiblemente homología de 90% o más y
la más preferible, homología de 95% o más, en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada por los
30 respectivos genes de N-metil transferasa. Sin embargo, incluso si la homología con la N-metil transferasa llega a 15%
o menos como resultado de una deleción, adición y sustitución de una pluralidad de residuos de aminoácidos para ser
codificados, se estima que algunos de los genes de N-metil transferasas obtenidos mantienen una región indispensable
para las funciones de N-metil transferasa y sustancialmente codifican proteínas que tienen sus funciones similares a la
N-metil transferasa.
35
Pueden usarse todos los organismos usados para aislar moléculas de ADN o moléculas de ARN que tengan se-
cuencias de nucleótidos (genes) que codifican N-metil transferasa de acuerdo con la presente invención, siempre y
cuando produzcan cafeína o su precursor. Pueden incluir plantas de Theaceae Camellia, tales como el té. Plantas de
Rubiaceae Coffea como la planta del café. Plantas de Sterculiacecae Cola, como la planta de Cola o similares.
40
Puede obtenerse una molécula de ARN que incluya un gen de N-metil transferasa de acuerdo con la presente
invención conectando un ADN que codifique la N-metil transferasa, que puede preparase mediante el procedimiento
descrito anteriormente, en la dirección deseada en la localización operable en la dirección 3’ de un promotor como
el promotor Sp6 o el promotor T7, reconocidos por la ARN polimerasa, para preparar una molécula e recombinante
45 y traduciendo la molécula recombinante mediante la ARN SP6 polimerasa o al T7 polimerasa y obtener la molécula
de ARN deseada. La molécula de ARN también puede obtenerse introduciendo un ADN o un AR>N que codifica
la N-metil transferasa en un virus vegetal o insertando un ADN o un ARN que codifica la N-metil transferasa en un
vector que lleva un cassette de expresión adecuado, como se describe más adelante, de manera que el ADN o el ARN
esté conectado al cassette de expresión en la dirección deseada en la localización operable para preparar una molécula
50 recombinante e introduciendo la molécula recombinante en un microorganismo o planta huésped para que el ARN que
codifica la N-metil transferasa pueda formarse en el huésped usando la actividad de transcripción del huésped.

Las moléculas de ADN que tienen complementariedad con todas o parte de las moléculas de ADN que tienen
los genes de la N-metil transferasa o moléculas de ARN que tienen genes de N-metil transferasa pueden usarse
55 como moléculas de ADN o de ARN para la inhibición o la supresión de la expresión de la N-metil transferasa en
células vegetales, siempre y cuando estas moléculas tengan una función en la inhibición de la expresión de la N-metil
transferasa peculiar para las células vegetales del huésped cuando estas moléculas se expresas en las células vegetales
del huésped.

60 Según la presente invención, la parte del gen de N-metil transferasa como la base para la molécula de ADN o ARN
complementaria denota un sitio que puede usarse para proporcionar una secuencia complementaria como una base
para formas ARNm para la inhibición (es decir, ARN antisentido) en las células huésped. Este ARNm para inhibición
se forma en las células huésped, el ARN se une con el ARNm para expresión de la N-metil transferasa en las células
huésped, y la expresión de N-metil transferasa en las células huésped se inhibe. Este sitio es necesario para formar
65 dicho ARNm antisentido, que tiene, por ejemplo, al menos 14 bases de longitud.

Las moléculas de ADN para formar el ARNm antisentido pueden incluir, por ejemplo, moléculas de ADN com-
plementarias a toda o parte de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 2, y las moléculas de ARN antisentido incluyen
6
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moléculas de ARN complementarias a toda o parte de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 3. Para dicho propósito
también se pueden usar moléculas de ADN o moléculas de ARN complementarias a toda o parte de la secuencia
modificada capaz de hibridar con estas secuencias nucleotídicas de SEC ID Nº 2 y 3 en condiciones estrictas.

5 También pueden usarse las moléculas de ADN que tengan una homología elevada con estas moléculas de ADN o
moléculas de ARN inhibidoras y con las funciones inhibidoras o restrictivas deseadas. En la presente, una homología
elevada denota homología de 60% o más, preferiblemente homología de 75% o más, más preferiblemente homología
de 90% o más y, lo más preferible, homología de 95% o más en la comparación de las secuencias de nucleótidos
respectivas.
10
Puede que estas mismas moléculas inhibidoras de ADN o moléculas inhibidoras de ARN no siempre codifiquen la
N-metil transferasa según la presente invención.

Otro aspecto de la secuencia de nucleótidos para inhibir la N metil transferasa según la presente invención está
15 dirigido a una secuencia de nucleótidos con uno o más sitios de homología con el gen de la N-metil transferasa,
pero que no codifican la N-metil transferasa. La N-metil transferasa peculiar para las células huésped puede inhibirse
sustituyendo esta secuencia de nucleótidos con el gen de la N-metil transferasa de las células huésped que se va a
delecionar.

20 Respecto de la expresión del gen de N-metil transferasa o de la expresión de las moléculas de ADN que tienen
funciones inhibidoras o restrictivas de la expresión del gen de N-metil transferasa o de la N-metil transferasa en las
células huésped, más adelante se describirá un ejemplo usando células vegetales como células huésped.

Para la expresión en células vegetales puede usarse un procedimiento para introducir en las células vegetales hués-
25 ped un cassette de expresión y transformar las células huésped, incluyendo el cassette de expresión: (i) un promotor
que permita la transcripción de ADN en ARNm en la célula huésped; (ii) un fragmento de ADN que contiene un gen
de N-metil transferasa unido al lado 3’ del promotor en dirección sentido o antisentido o un fragmento de ADN con las
funciones para inhibir la expresión de la N-metil transferasa; y (iii) una secuencia de terminación que contienen un si-
tio de poliadenilación requerido para la estabilización de los productos transcritos unida al lado 3’ de estos fragmentos
30 de ADN, como es necesario.

Dicho cassette de expresión y un vector que contiene este cassette son el objeto de la presente invención.

El cassette de expresión puede contener un promotor que exprese de forma constitutiva o inductiva el ADN in-
35 sertado. Además, este cassette de expresión puede tener un origen de replicación en las células vegetales, como se
requiere.

Los promotores para la expresión constitutiva incluyen, por ejemplo, un promotor 35S para el virus del mosaico de
la coliflor, un promotor de la actina del arroz y similares. Además, promotores para la expresión inductiva incluyen,
40 por ejemplo, promotores de los que se sabe que se expresan a causa de factores externos tales como infecciones
o invasiones por hongos, bacterias o virus, temperaturas bajas, temperaturas elevadas, condiciones de sequedad y
anaerobias, pulverización de compuestos específicos o similares. Tales promotores incluyen un promotor de genes de
la quitinasa de arroz expresado, por ejemplo por infecciones o invasión de hongos, bacterias o virus; un promotor de
genes de proteína PR; un promotor de genes de “lip19” de arroz inducido por las temperaturas bajas; un promotor de
45 genes de “HSP162” de Capsella bursa-pastoris inducido por las temperaturas elevadas; un promotor de genes “rab”
de arroz inducido por sequía; un promotor del gen de la alcohol deshidrogenasa de maíz inducido por condiciones
anaerobias o similares. Además, el promotor de los genes de la quitinasa de arroz y el promotor de los genes de la
proteína PR del tabaco se inducen por compuestos específicos tales como ácido salicílico o similares, y el promotor
del gen “rab” del arroz está inducido por la pulverización de ácido abscísico de hormona vegetal.
50
Por otro lado, como promotor para expresar ADN insertado en el cassette de expresión se puede usar un promotor
derivado de cualquiera de los genes de N-metil transferasa.

Un ejemplo específico de aislamiento de un promotor puede incluir un procedimiento para seleccionar fragmentos
55 de ADN genómico y especificar el ADN en la sección superior del gen usando la técnica de hibridación en la que
todos o parte de los genes de la N-metil transferasa se usan como sonda.

Para preparar la introducción en plantas de moléculas de ADN recombinante en el cassette de expresión puede
usarse un número de vectores de clonación que contienen una señal de replicación en E. coli y uno o varios genes
60 marcadores para la selección de las células de E. coli transformadas. Ejemplos de tales vectores incluyen pBR322,
sistema pUC, sistema M13mp o similares. Se puede introducir una secuencia diana en un punto de corte de enzimas
de restricción adecuado. Para aclarar las características del ADN plasmídico obtenido generalmente se usan análisis
del punto de corte de la enzima de restricción, electroforesis en gel y otros procedimientos bioquímicos, biológico-
moleculares. Después de completar cada operación, se corta el ADN plasmídico y se puede unir con otro ADN. La
65 secuencia de cada plásmido se puede clonar en el mismo plásmido o en otro plásmido.

Para introducir el cassette de expresión en células vegetales se puede usar una variedad de técnicas. Estas técni-
cas incluyen la transformación de células vegetales con ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium
7
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rhizogenes como factores de transformación; inducción directa en los protoplastos (procedimiento de inyección, proce-
dimiento de electroporación o similares), procedimiento de disparo de partículas o similar y cualquier otra posibilidad.

Para la introducción directa en los protoplastos no se requiere ningún vector en particular. Por ejemplo, puede
5 usarse un plásmido simple como un derivado del pUC. Algunos procedimientos para introducir los genes diana en las
células vegetales pueden requerir otra secuencia de ADN. Por ejemplo, cuando se usa el plásmido Ti o Ri para trans-
formar las células vegetales, es preferible conectar al menos la secuencia del extremo derecho de la región del ADN-
T para los plásmidos Ti y Ri, principalmente las secuencias de ambos extremos para que sean regiones adyacentes de
los genes que se van a introducir.
10
Cuando se usa Agrobacteriu para la transformación, se requiere introducir un cassette de expresión para su clona-
ción en un plásmido específico, es decir, en un vector intermedio o en un vector binario. El vector intermedio no se
replica en Agrobacterium. El vector intermedio se desplaza al interior de Agrobacterium con un plásmido auxiliar o
mediante electroporación. el vector intermedio tiene una región homóloga a la secuencia de ADN-T y, por tanto, se
15 incorpora en el plásmido Ti o Ri de Agrobacterium mediante recombinación homóloga. Como huésped es necesario
usar Agrobacterium para incluir la región vir y el ADN-T puede moverse a las células vegetales por medio de las
funciones de la región.

Por otro lado, el vector binario puede replicarse y mantenerse en Agrobacterium. Por tanto, cuando el vector binario
20 se incorpora en Agrobacterium por medio del plásmido auxiliar o técnicas de electroporación, el ADN-T del vector
binario puede moverse a las células vegetales mediante las funciones de la región Vir del huésped.

El vector intermedio o el vector binario que incluye el cassette de expresión obtenido y microorganismos como
Escherichia coli o Agrobacteriu que incluyen estos vectores son el objeto de la presente invención.
25
Las células vegetales transformadas pueden convertirse en un tejido vegetal o un cuerpo vegetal experimentando
un proceso de reproducción. Los métodos de reproducción dependen de los tipos de células vegetales e incluyen el
procedimiento de Fujimora y col. para el arroz (Plan Tissue Culture Lett., 2. 74-(1995)): el procedimiento de Shillito
y col. para el maíz (Bio/Technology, 7, 581-(1989)); y el procedimiento de Akama y col., para Capsella bursa-pastoris
30 (Plant Cell Rep., 12, 7-(1992)) o similares.

Según la presente invención, el término “cuerpo vegetal” se refiere a todo el organismo individual clasificado en
planta o partes orgánicas de la misma tales como hojas, tallos, raíces, flores, frutos, semilla y similares.

35 En cuanto al cuerpo vegetal producido por estos procedimientos o el cuerpo vegetal obtenido de su catalizador de
reproducción (por ejemplo, semillas, tallos, esquejes o similares), una cantidad de expresión de N-metil transferasa
según la presente invención varía en comparación con un de cuerpo vegetal de tipo salvaje productor de cafeína o de
su precursor; se produce un cambio en la cantidad de generación de compuestos del sistema del metabolismo de la
cafeína debido a la modificación del metabolismo de la planta huésped o un cambio en la tasa de producción del grupo
40 de compuestos del sistema del metabolismo de la cafeína por una modificación del metabolismo de la planta huésped.
La planta transgénica obtenida de esta manera es el objeto de la presente invención. Las plantas según la presente
invención incluyen tejidos o células específicos de plantas tales como hojas, flores, frutos, semilla o similares.

Además, recientemente, a partir de estudios sobre el silencio génico postraduccional de plantas, se ha encontrado
45 que la expresión de genes diana puede restringirse usando los mecanismos de protección intrínsecos de la planta
para ácidos nucleicos exóticos tales como virus (Cell, 95, 177-187 (1998), Chemistry and Biology, 37, 532-(1999)
y enzimas proteicas de ácidos nucleicos, 44, 1396- (1999)). Según este estudio, en el caso en el que virus ADN o
virus de ARN o similares invaden la planta, las plantas transcriben ARN aberrante a partir de estos moldes y se forma
ARN bicatenario de forma secuencial específicamente con el producto transcrito de la secuencia intrínseca que las
50 plantas poseen. Esta ARN bicatenario se fragmenta por la acción de la RNasa, por tanto haciendo posible restringir
la expresión de genes diana (Cell, 96, 303-(1999)). Una de las características esenciales de este procedimiento es que
una secuencia cuya expresión se va a restringir, no siempre necesita ser transformada en la planta diana. Además,
otras características de este procedimiento son que, si se introduce un ácido nucleico diana en parte de la planta (hoja
de orden inferior o similares) por infección o similar, su efecto se extiende a la totalidad del cuerpo de la planta. Un
55 procedimiento específico de la restricción de la expresión consiste en producir la infección con la hoja de orden menor
de la planta del ARN bicatenario que incluye todo o parte de la secuencia del gen diana o la secuencia que tiene una
homología elevada o Agrobacteriu con el ADN bicatenario. En la presente, una homología elevada denota homología
de 60% o más, preferiblemente homología de 75% o más, más preferiblemente homología de 90% o más y lo más
preferiblemente, una homología de 95% o más en comparación con las secuencias de bases respectivas.
60
En el cuerpo de la planta sometido a este procedimiento, una cantidad de expresión de la proteína N-metil trans-
ferasa según la presente invención cambia en comparación con un cuerpo vegetal de tipo salvaje que produce cafeína
o su precursor. Además, se produce un cambio en la cantidad de la expresión de los compuestos del metabolismo de
la cafeína debido a la modificación del metabolismo de la planta huésped o un cambio en la tasa de producción del
65 grupo de compuestos del sistema del metabolismo de la cafeína debido a la modificación del metabolismo de la planta
huésped. La planta obtenida de esta manera es el objeto de la presente invención. Las plantas usadas en esta invención
incluyen tejidos o células específicas de plantas, tales como hojas, flores, frutos, semilla o similares.

8
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Las plantas productoras de cafeína siendo el SAM un donante de grupos metilo pueden incluir plantas productoras
de cafeína entre las que se incluyen plantas de Theacea Camellia como la planta del té; plantas de Rubiaceae coffea
tales como la planta del café; plantas de Sterculiaceae Cola tales como la planta de Cola.

5 Los microorganismos para introducir ADN que codifica la N-metil transferasa, expresando por tanto una gran
cantidad de las proteínas N-metil transferasa según la presente invención, pueden incluir bacterias tales como E. coli,
Bacillus subtilis o similares; y virus tales como Baculoviridae.

Además, cualquier planta productora de cafeína o su precursor puede usarse como planta en la cual un ADN que
10 codifica la N-metil transferasa según la presente invención, en la forma de sentido o antisentido, para obtener plantas
transformadas para los propósitos de mejorar la productividad para un compuesto específico y cambiar una proporción
de producción de un grupo de compuestos específico modificando el metabolismo en las células huésped.

La producción de metabolitos secundarios relacionados con el sistema de síntesis de cafeína y la composición de

15 los metabolitos secundarios producidos por estos transformantes pueden modificarse cultivando las células vegetales
o los tejidos vegetales transformados con el vector de la constitución descrita anteriormente o cultivando plantas trans-
formadas del mismo modo. Como metabolitos secundarios pueden mencionarse, por ejemplo, al menos un compuesto
seleccionado del grupo compuesto por 7-metil xantina, paraxantina, teobromina y cafeína.

20 Como fuentes de suministro de células vegetales, tejidos vegetales o cuerpos de plantas usados para transformación
pueden mencionarse, por ejemplo, una planta de Camellia, una planta de Coffea, una planta de Cola, una planta de
Ilex, una planta de Neea, una planta de Firmiana, una planta de Paulinia o una planta de Therbroma como cuerpos de
plantas para transformación.

25 Estas plantas pueden incluir plantas de Theaceae Camellia tales como la planta el té; plantas de Rubiaceca coffea
tales como la planta del café; plantas de Sterculiaceae Cola tales como la planta de Cola, o similares.

Además, en la N-metil transferasa según la presente invención, pueden metilarse compuestos estructuralmente
análogos tales como 7-metil xantina así como teobromina. por tanto, incluso si no son los tipos de plantas anterio-
30 res, el procedimiento según la presente invención se puede aplicar a plantas que contienen compuestos de xantina
estructuralmente análogos de la misma.

Como resultado del estudio enzimático, está claro que la N-metil transferasa según la presente invención tiene las
siguientes propiedades básicas.
35
Peso molecular: 41.000 (SDS-PAGE), 61.000 (filtración en gel)

Punto isoeléctrico: 4,5 a 5,0 (cromatoenfoque)

40 pH óptimo: 8,5

Valor Km: 21 µM (SAM) o 24 µM (paraxantina)

Inhibidor: SAH (S-adenosil homocisteína)

45
Mecanismo de la reacción: SAM + Paraxantina → cafeína SAH

Ejemplos

50 En lo sucesivo, la presente invención describirá con más detalle por medio de Ejemplos y Ejemplos Comparativos.
El alcance de la presente invención no se limita a estos Ejemplos.

Ejemplo 1

55 Preparación de fracción purificada de N-metil transferasa

Primeras, segundas y terceras hojas de té (Camellia sinensis var. Yabukita) recogidas en Makurazaki City, Kagoshi-
ma Prefecture en mayo de 1997 se congelaron usando nitrógeno líquido y se conservaron a -80ºC. Este material de 100
g se molió añadiendo 5 mM EDTA-Na2 de 1.000 ml; 2,5 mM 2-mercaptoetanol; 5% (v/v) de glicerina; 1 mg de aproti-
60 nina; 0,5% (p/v) de ascorbato sódico y 50 mM de una solución de tampón de fosfato sódico (pH 7,3) que contiene 2,5%
(p/v) de polivinil pirrolidona insoluble, y se filtró a través de un filtro de tres capas. A continuación se centrifugó el
líquido filtrado (10.000 g, 15 minutos) y se obtuvo un sobrenadante. Después, a partir del sobrenadante se preparó una
fracción de sulfato amónico saturado al 50-80%. Esta fracción se desionizó usando Sefadex G -25; se disolvió en una
solución 10 mM de tampón fosfato sódico (pH 7,2) que contiene 2 mM de EDTA-Na2; 2-mercaptoetanol 2mM; 20%
65 (v/v) de glicerina y, después, se adsorbió a una columna de hidroxiapatita (15 x 160 mm) equilibrada con la misma
solución de tampón; y se eluyó una fracción activa usando un gradiente de concentración lineal de 10-200 mM de 200
ml de la solución de tampón fosfato sódico que contienen EDTA-Na2 2 mM; 2-mercaptoetanol 2mM; 20% (v/v) de
glicerina. Se recogió la fracción activa y el precipitado se volvió a recoger mediante sulfato amónico insaturado al 80%
9
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y la fracción se disolvió en Tris 50 mM-solución de tampón de ácido clorhídrico (pH 8,4) que contiene EDTA-Na2
2 mM; 2-mercaptoetanol 2mM; KCl 20 mM; 20% (v/v) de glicerina. Tras llevar a cabo la desionización, la fracción
se adsorbió a una columna de intercambio iónico catódica Shodex IEC QA-824 (8 x 25 mm) para el uso exclusivo en
una cromatografía líquida de alto rendimiento equilibrada por la misma solución tampón. Después de lavar la columna
5 con la misma solución tampón, la proteína adsorbida se eluyó mediante un gradiente de concentración lineal de 30
ml de KCl de 20-750 mM (disuelta en la solución tampón de ácido clorhídrico-Tris 50 mM (pH 8,5) que contiene
EDTA-Na2 2 mM; 2-mercaptoetanol 2 mM; y 20% (v/v) de glicerina. Se recogió la fracción activa, se desionizó y se
adsorbió en adenosina-agarosa (1 ml) que es una columna de afinidad equilibrada por la misma solución tampón tras
haberse disuelto en una solución tampón ácido clorhídrico-Tris 50 mM (pH 8,5) que contiene EDTA-Na2 2 mM; 2-
10 mercaptoetanol 2mM y 20% (v/v) de glicerina. La fracción activa se eluyó mediante una solución de tampón de ácido
clorhídrico-Tris 50 mM (pH 8,5) que contiene NaCl 0,2M; EDTA-Na2 2mM; 2-mercaptoetanol 2mM y 20% (v/v) de
glicerina. La fracción obtenida se sometió a filtración en gel usando H1Load Superdex 200 (16 x 600 mm) equilibrada
por la solución tampón de ácido clorhídrico-Tris 50 mM (pH 8,5) que contiene 2-mercaptoetanol 2 mM; KCl 150 mM;
20% (v/v) de glicerina y se obtuvo una muestra finalmente refinada. La tabla 1 resume un cambio en la actividad del
15 procedimiento de refinado de la N-metil transferasa.

TABLA 1

20

25

30

35

40

45

Ejemplo 2
50 Análisis de la secuencia de aminoácidos de N-metil transferasa

Fracción refinada

La muestra finalmente purificada se transfirió a una membrana de PVDF usando un aparato de Transferencia
55 Semiseca tras electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Se cortó un sitio al cual se transfirió la N-metil transferasa y
se analizó una secuencia de aminoácidos de un extremo N-terminal usando un secuenciador proteico ABI. El resultado
se muestra en la SEC ID Nº4.

Ejemplo 3
60
Como sonda se empleó un oligonucleótido NMT-1 de 19 residuos y un cebador Not I-(dT) 18 (Pharmacia Biotech)
basado en 7 residuos aminoacídicos del extremo N-terminal del oligonucleótido para la clonación del ADNc de la N-
metil transferasa. La secuencia de NMT-1 se muestra en la SEC ID Nº5.
65

10
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Ejemplo 4

Síntesis de un ADNc monocatenario para la clonación del gen de la N-metil transferasa

5 (1) Aislamiento de ARN total

Se molieron hojas jóvenes de té de 5 g en presencia de nitrógeno líquido usando una vara (ROD) o un mortero.
Tras la sublimación del nitrógeno líquido se añadieron 50 ml de LiCl 3M y urea 8M y se molieron más con politron.
Después, las hojas molidas se colocaron estáticamente una noche a 4ºC y se centrifugaron a 12.000 rpm durante 15
10 minutos. El precipitado se suspendió en 0,5% de SDS, una solución tampón clorhídrico-Tris 10 mM (pH 7,6) hasta
una cantidad total de aproximadamente 10 ml. El precipitado suspendido se mezcló añadiendo 10 ml de una solución
de cloroformo de fenol y se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 minutos. Al sobrenadante se añadió 1/10 volumen
de una solución de acetato sódico 3M (pH 4,8) y después 2 volúmenes de etanol, la mezcla se colocó estáticamente
a -80ºC durante una hora. La centrifugación se llevó a cabo a 4ºC y 12.000 rpm durante 10 minutos, al precipitado
15 separado del sobrenadante se añadió un 70% de etanol para formar una suspensión y se volvió a centrifugar. Se eliminó
el sobrenadante y el residuo se secó mediante una bomba de vacío. El precipitado obtenido de esta manera se disolvió
en 1,5 ml de agua, se añadieron 150 µl de solución de acetato sódico 3M (pH 4,8) y posteriormente se añadieron 1,5
ml de solución de fenol/cloroformo para vertirse y mezclarse. Después, se llevó a cabo la centrifugación a 12.000 rpm
durante 10 minutos. Al sobrenadante se añadieron 2 volúmenes de etanol y se colocó estáticamente a -80ºC durante 20
20 minutos. Después se llevó a cabo la centrifugación a 4ºC y 12.000 rpm durante 10 minutos. Al precipitado obtenido
de esta manera se añadió etanol al 70% y se volvió a centrifugar. El precipitado se secó mediante la bomba de vacío,
se disolvió en 200 µl de agua y, por tanto, se obtuvo una fracción de ARN total.

(2) Aislamiento de ARNm

25
El ARN total (2 mg) obtenido mediante el procedimiento descrito anteriormente se sometió a tratamiento térmico
a 65ºC durante 5 minutos y después se mezcló con la solución A del mismo volumen que dos veces la concentración
(solución tampón ácido clorhídrico-Tris 10 mM (pH 7,5); EDTA-Na2 1mM; 0,1% de SDS; NaCl 0,5M).

30 Se sumergieron 0,1 g de oligo(dT)-Celulosa tipo 7 (Pharmacia) en 2 ml de solución B (solución tampón ácido

clorhídrico-Tris 10 mM (pH 7,5); EDTA-Na2 1mM; 0,1% SDS; NaCl 0,1 M) y la suspensión se vertió en una punta
azul rellena con lana cristalina en su extremo y se lavó con 2,5 ml de NaOH 0,1 N. Después, se vertieron 5 ml de la
solución A y se equilibró. A esta columna se aplicó el ARN total y se vertieron 3 ml de solución A y 4 ml de solución
B. A continuación se eluyó el ARNm mediante 3 ml de solución C (solución tampón clorhídrico-Tris 10 mM (pH
35 7,5), EDTA-Na2 1 mM y 0,05% de SDS). La solución eludida se condensó mediante precipitación en etanol y se secó.
Después, la solución se disolvió en agua y se conservó a -80ºC.

(3) Síntesis de ADNc monocatenario

40 Durante 3 minutos se enfriaron de forma aguda 190 de ARNm inmediatamente después del tratamiento térmico
a 65ºC durante 10 minutos. Esta muestra se usó como molde y se sintetizó un ADNc monocatenario usando el First-
Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia). El ADNc sintetizado se conservó a -20ºC.

Ejemplo 5
45
Clonación de genes de N-metil transferasa usando la técnica de PCR-RT

Se preparó la siguiente solución de reacción que contenía el ADNC monocatenario preparado mediante el proce-
dimiento descrito anteriormente y se usó como molde. Esta solución de reacción se hizo reaccionar a 95ºC durante 1
50 minuto usando un ciclador térmico Peltier PTC-200 (Funakoshi),la PCR se llevó acabo en condiciones en las que un
ciclo incluía las etapas de 95ºC/1 minuto, 45ºC/1 minuto y 72ºC/2 minutos, respectivamente y se realizaron 30 ciclos,
y se obtuvo el producto de la reacción.

ADNc molde: 3 µl
55
Tampón 10 x: 5 µl

NTP 2,5 mM: 8 µl

60 NMT-1: 1 µl (50 pmol)

NotI- (dT) 18: 1 µl (50 pmol)

H2O: 31 µl
65
ExTaq (TAKARA): 1 µl

11
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Ejemplo 6

Subclonación en un vector plásmido

5 La electroforesis del producto de reacción obtenido en el Ejemplo 5 se llevó a cabo en TAE usando gel de agarosa
al 0,8%, una banda del producto diana obtenido se cortó y el ADN se recogió de un gel usando GENE CLEAN
(Funakoshi). El ADN recogido de transformó en Escherichia coli DH5α tras la unión con el vector pT7blue (Novagen).
Después de llevar a cabo la selección de color usando X-gal, el cultivo líquido se realizó en el medio de cultivo LB con
ampicilina y se extrajo y aisló un plásmido usando la técnica álcali-SDS. La presencia o ausencia del inserto de verificó
10 mediante electroforesis en agarosa. Por tanto, un fragmento de ADN que incluía el gen de la N-metil transferasa se
aisló en el plásmido.

Ejemplo 7

15 Determinación de la secuencia de bases

La extensión del cebador se llevó a cabo en la siguiente solución de reacción usando plásmido aislado. Las condi-
ciones de reacción son las siguientes. Tras la reacción a 96ºC/1 minuto, la PCR en la que un ciclo incluía las etapas
de 96ºC/0,2 minutos, 50ºC/0,1 minuto y 60ºC/4 minutos, respectivamente y se realizaron 25 ciclos. Se llevó a cabo
20 precipitación en etanol para la solución de la reacción y el ADN obtenido se disolvió en reactivo de supresión de
molde y se analizó usando el analizador genético ABI-310. Para determinar una secuencia en el centro del ADN diana
se usó un plásmido en el que el fragmento de ADN obtenido tratando el ADN con Styl se subclonó en pUC19. Estas
secuencias cebadoras se muestran en las SEC ID Nº 6 y 7.

25 Composición de la solución de la reacción de extensión del cebador

ADN plasmídico (20 ng): 2 µl

Premix: 4 µl
30
Cebador: 1 µl

H2O: 3 µl

35 Ejemplo 8

Aislamiento de la región 5’ del ARNm de la N-metil transferasa usando la técnica de RACE en 5’

Para el aislamiento de la región 5’ se usó el equipo Full RACE Core (Takara). Se muestran las secuencias de los
40 cebadores usados para las SEC ID Nº 8 a 17.

Con la primera hebra de ADNc sintetizada por el procedimiento descrito en el Ejemplo 4, tras la descomposición
del ARN cíclico y el ciclado del ADNc monocatenario con una reacción de ligación, se llevó a cabo la reacción de
PCR en función de la técnica normal usando los cebadores de las SEC ID Nº 8 a 12 o SEC ID Nº 13 a 17, y se obtuvo
45 el producto de la reacción. Una banda del producto de la reacción se separó mediante electroforesis en acrilamida y
se recogió ADN de un gel, y se subclonó en el vector pT7blue. Después, se determinó la secuencia de bases del ADN
insertado mediante la técnica similar a las de los Ejemplos 6 y 7.

Ejemplo 9
50
La siguiente operación se llevó a cabo para volver a incorporar el gen aislado de N-metil transferasa en el vector
de expresión pET23d (Novagen).

La PCR se llevó a cabo en las siguientes condiciones usando el vector pT7blue, en el que se obtuvieron el ADN
55 del gen aislado de la N-metil transferasa obtenido en el Ejemplo 6 como un molde y los cebadores de las SEC ID Nº
18 y 19, respectivamente, y el producto de la reacción.

Condiciones de la reacción

60 Tras la reacción a 95ºC/1,5 minutos, se llevó a cabo la PCR en la que un ciclo incluía las etapas de 95ºC/1 minuto,
52ºC/1 minuto y 72ºC/1 minutos, respectivamente y se repitieron 30 ciclos.

Por otro lado, un fragmento obtenido tratando el fragmento de ADN del gen de la N-metil transferasa aislado con
NcoI y EcoRI se insertó en el vector pET23d. A continuación, el producto de la PCR citado anteriormente se insertó
65 en el sitio Ncol de este vector pET23d para formar un plásmido de expresión de N-metil transferasa. Este plásmido se
transformó en Escherichia coli BL21 (DE3). Después de cultivar la Escherichia coli obtenida a 37ºC durante 2 horas,
se añadió IPTG hasta llegar a una concentración final de 0,3 mM y se llevó a cabo un cultivo adicional de 3 horas
a 30ºC. Después de completar el cultivo, se recogieron las células y las células de la solución de cultivo de 3 ml se
12
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sometieron a tratamiento con ultrasonidos durante 1 minuto con intervalos en 0,2 ml de Tris 10 mM-solución tampón
de ácido clorhídrico (pH 7,5), NaCl 0,1M, EDTA-Na2 1mM. Después se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 minutos
y el sobrenadante obtenido se usó como una solución enzimática.

5 En cuanto a la secuenciación de los Ejemplos 7 y 8, la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN que incluye
el gen de N-metil transferasa obtenido en este ejemplo tiene la secuencia de SEC ID Nº 2 y la correspondiente tiene la
secuencia de SEC ID Nº 3. secuencia de nucleótidos del ARN. La correspondiente secuencia de aminoácidos de la N-
metil transferasa se muestra como la SEC ID Nº1.

10 La solución de la reacción para la determinación de N-metil transferasa se preparó de la siguiente manera. A

Tris 100 mM-solución tampón de ácido clorhídrico (pH 8,5), MgCl2 0,2 mM, paraxantina 0,2 mM, [metil-14C]S-
adenosilmetionina 4 µM (0,9 kBq) se añadieron 10 µl de la solución enzimática y el volumen de la solución de
reacción fue 100 µl. La reacción se llevó a cabo a 27ºC durante 10 minutos, la cafeína-14 C se extrajo añadiendo 1
ml de cloroformo a la misma y se midió la radioactividad de una capa de cloroformo. Como control a la solución
15 de reacción se añadió xantosina en vez de para xantina o se retiró paraxantina. Como resultado de la medición de la
actividad, se encontró que se produjeron 1,56 pmol de cafeína sólo cuando se añadía paraxantina como sustrato.

La reacción enzimática anterior se repitió, a excepción de que a la solución de reacción se añadió 7-metil xantina
o teobromina en vez de paraxantina. Como resultado de la medición de la actividad enzimática, la producción de
20 teobromina se observó en la solución de reacción a la cual se añadió 7-metil xantina en vez de paraxantina, mientras
que la producción de cafeína se observó en la solución de reacción a la cual se añadió teobromina en vez de paraxantina.
Respecto de estos resultados, se reveló que la enzima aislada en el procedimiento anterior tenía tres actividades N-
metil transferasa diferentes usando otros dos sustratos además de paraxantina, respectivamente.

25 Ejemplo 10

Supresión de la síntesis de cafeína según un procedimiento de antisentido

Mediante el siguiente procedimiento de creó un vector recombinante que llevaba un gen antisentido de N-metil
30 transferasa:

Mediante PCR se amplificaron fragmentos de ADN usando como molde la longitud total del gen de la N-metil
transferasa aislado como se usó en el Ejemplo 9 y los cebadores con las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº
20 y 21, respectivamente. Los extremos de los fragmentos de ADN amplificados de esta manera se convirtieron en
35 extremos romos con el kit BKL (TAKARA) para obtener los fragmentos amplificados por PCR de extremos romos.

De forma independiente, el vector pBI (Clontech), al que se había unido un gen de resistencia a la higromicina, se
cortó con XbaI y SacI para eliminar el gen de la β-glucuronidasa, y los extremos del vector linear obtenidos de esta
manera se convirtieron en extremos romos.
40
El vector lineal de extremos romos se ligó con los fragmentos de extremos romos amplificados por PCR para
obtener vectores recombinantes con el kit Ligation (TAKARA) y después el vector que llevaba el gen de la N-metil
transferasa deseado que se había insertado en dirección inversa a la localización del operador en el lado 3’ del promotor
CaMV35S en el vector pBI se seleccionó de los productos de reacción mediante secuenciación. Por tanto, se obtuvo
45 el vector recombinante deseado, que tenía insertado el gen antisentido de la N-metil transferasa, y se usó la siguiente
transformación:

Se han publicado muchos artículos respecto de los procedimientos convencionales de síntesis biológica de cafeína
usando cultivos tisulares de café, tales como Plants, 108, 339 (1972), Plant Cell Reports, 2, 109 (1983). Se indujo
50 la formación de un callo de café a partir de un ápice de brote de café o de una hoja joven según los procedimientos
convencionales. El vector recombinante se introdujo en el callo obtenido de esta manera mediante el procedimiento de
disparo de partículas. Por otro lado, se prepararon protoplastos del callo mediante procedimientos convencionales y el
vector recombinante se introdujo en los protoplastos por electroporación. Después de la introducción, se seleccionaron
las células con la resistencia marcador. Las células seleccionadas de esta manera se cultivaron en condiciones de luz
55 y la actividad enzimática de las células transformadas se midió según el procedimiento descrito en el Ejemplo 9.
Como resultado, se descubrió que la producción de cafeína por las células transformadas en las se había introducido
el gen antisentido de la N-metil transferasa se había reducido significativamente en comparación con la de las células
normales en las que no se había introducido el gen antisentido de la N-metil transferasa.

60 Se llevó a cabo la rediferenciación de las células de café transformadas para obtener una planta joven de café,
por la cual la rediferenciación se llevó a cabo mediante procedimientos convencionales descritos en los artículos,
incluidos Z. Pflanzenphysiolo. Bd., 81, 395 (1977) y Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 8, 243 (1987). Se midió
la actividad de cada una de las enzimas en las hojas de la planta joven de café. Como resultado, se descubrió que la
producción de cafeína de la planta joven de café, en la que se había introducido la N-metil transferasa antisentido,
65 estaba significativamente reducida en comparación con la de la planta joven de café en la que no se había introducido
el gen antisentido de la N-metil transferasa.

Las secuencias definidas por los números de SEC ID son las siguientes:
13
 ES 2 215 572 T3

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

14
 ES 2 215 572 T3

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

15
 ES 2 215 572 T3

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

16
 ES 2 215 572 T3

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

17
 ES 2 215 572 T3

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

18
 ES 2 215 572 T3

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ADN que comprende cualquiera de las siguientes secuencias de nucleótidos:
5
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica la N-metil transferasa, que es un polipéptido que tiene una secuencia
de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 de la lista de secuencias y que tiene actividades enzimáticas de 7-metil
xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa; o

10 (b) una secuencia modificada de nucleótidos obtenida llevando a cabo sustitución, deleción o inserción de nucleó-
tidos en dicha secuencia nucleotídica dentro de un intervalo en el que un polipéptido codificado por dicha
secuencia nucleotídica tiene las actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1
metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa.

15 2. La molécula de ADN según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos (a) y dicha secuencia
de nucleótidos modificada (b) puede hibridar en condiciones estrictas.

3. La molécula de ADN según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha secuencia de nucleótidos (a) bien:

20 i) consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2 de la lista de secuencias, o

ii) consiste en una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar en condiciones estrictas con una secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº 2 de la lista de secuencias, o

25 iii) consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% o al menos 90% o al menos 95% de
homología con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2.

4. Una molécula de ARN que comprende cualquiera de las siguientes secuencias de nucleótidos:

30 (a) una secuencia de nucleótidos que codifica N-metil transferasa, que es un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº 1 de la lista de secuencias y que tiene actividades enzimáticas de 7-metil xantina
N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa; y

(b) una secuencia de nucleótidos modificada obtenida llevando a cabo sustitución, deleción o inserción de nucleó-
35 tidos en dicha secuencia nucleotídica (a) dentro de un intervalo donde un polipéptido codificado por dicha
secuencia de nucleótidos tiene las actividades enzimáticas 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1
metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa.

5. Una molécula de ARN según la reivindicación 4, en la que dicha secuencia de nucleótidos (a) y dicha secuencia
40 de nucleótidos (b) puede hibridar en condiciones estrictas.

6. La molécula de ARN según la reivindicación 4 ó 5, en la que dicha secuencia (a) bien:

i) consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 de la lista de secuencias; o

45
ii) consiste en una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar en condiciones estrictas con una secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº 3 de la lista de secuencias; o

iii) consiste en una secuencia de nucleótidos que tienen al menos 75% o al menos 90% o al menos 95% de
50 homología con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3.

7. Un vector de expresión que comprende la molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y
una constitución para expresar dicha N-metil transferasa codificada por la molécula de ADN en células vegetales.

55 8. Una célula transformada obtenida transformando una célula huésped, tal como un microorganismo, con el vector
de expresión según la reivindicación 7.

9. Un procedimiento para producir N-metil transferasa que comprende: cultivar las células transformadas de la
reivindicación 8, presentando de ese modo las actividades enzimáticas.
60
10. Una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a toda o parte de:

i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº1 y con las actividades enzimáticas 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa
65 y paraxantina N3 metil transferasa; o

ii) una secuencia de nucleótidos modificada obtenida llevando a cabo sustitución, deleción o inserción de un
nucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, en la que

19
 ES 2 215 572 T3
el polipéptido codificado por dicha secuencia de nucleótidos modificada tiene las actividades enzimáticas
7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa,
opcionalmente en el que dicha secuencia de nucleótidos y dicha secuencia de nucleótidos modificada puede
hibridar en condiciones estrictas; o
5
iii) que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2,

y en la que las actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y
paraxantina N3 metil transferasa de las células vegetales pueden inhibirse en células vegetales con dichas actividades
10 enzimáticas cuando dicha molécula de ADN se introduce y expresa en dichas células vegetales.

11. Una molécula de ARN que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a toda o parte de la
secuencia de nucleótidos de:

15 (i) un nucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 y que
tiene las actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa
y paraxantina N3 metil transferasa; o

(ii) una secuencia de nucleótidos modificada obtenida llevando a cabo sustitución, deleción o inserción de nu-
20 cleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, en el que
el polipéptido codificado por dicha secuencia de nucleótidos modificada tiene las actividades enzimáticas
de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transfe-
rasa, opcionalmente en la que dicha secuencia de nucleótidos y dicha secuencia de nucleótidos modificada
puede hibridar en condiciones estrictas; o
25
en la que las actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y
paraxantina N3 metil transferasa de células vegetales puede inhibirse cuando dicha molécula de ARN se introduce y
expresa en dichas células vegetales.

30 12. Un vector que comprende una molécula de ADN o una molécula de ARN según cualquiera de las reivindi-
caciones 1 a 6, 10 y 11, y el vector es capaz de expresar N-metil transferasa con las actividades enzimáticas de 7-
metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa en células
de al menos uno de los microorganismos o plantas o tiene una función de inhibición de la expresión de la N-metil
transferasa.
35
13. Un microorganismo en el que el microorganismo se transforma con el vector según la reivindicación 12.

14. Una célula vegetal, tejido vegetal o cuerpo de planta, en la que la célula vegetal, el tejido vegetal o el cuerpo
de planta se transforma con el vector según la reivindicación 12, que, por ejemplo, se introduce mediante infección.
40
15. Un procedimiento para producir un metabolito vegetal secundario o un procedimiento para modificar una
composición de un metabolito vegetal secundario que comprende: usar la célula vegetal, el tejido vegetal o el cuerpo
de planta según la reivindicación 14.

45 16. Un procedimiento para producir un metabolito vegetal secundario que comprende: cultivar la célula vegetal o
el tejido vegetal según la reivindicación 14, y producir el crecimiento del cuerpo de la planta.

17. Un procedimiento para modificar una composición del metabolito vegetal secundario que comprende: cultivar
la célula vegetal o el tejido vegetal, o producir el crecimiento del cuerpo de la planta según la reivindicación 14.
50
18. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que (a) el metabolito vegetal secundario
es al menos uno o más compuestos seleccionados del grupo compuesto por 7-metil xantina, paraxantina, teobromina
y cafeína; o (b) en el que un cuerpo de planta transformado es una planta de Camellia, un planta de Coffea, una planta
de Cola, una planta de Ilex, una planta de Neea, una planta de Firmiana, una planta de Paullinia o un cuerpo de planta
55 de Therbroma.

19. Una N-metil transferasa que tiene las actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobro-
mina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa, comprendiendo dicha N-metil transferasa:

60 (a) una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1 de la lista de secuencias; o

(b) una secuencia de aminoácidos modificada obtenida llevando a cabo sustitución, inserción o deleción de ami-
noácidos en la secuencia aminoacídica de la SEC ID Nº 1 de la lista de secuencias, dentro de un intervalo en el
que dichas actividades enzimáticas no se alteran.
65
20. La N-metil transferasa según la reivindicación 19, en la que dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicha
secuencia de aminoácidos (a) y dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicha secuencia de aminoácidos modifi-
cada (b) puede hibridar en condiciones estrictas.
20
 ES 2 215 572 T3

LISTA DE SECUENCIAS

<110> MITSUI CHEMICALS, INC.

5
<120> Enzima asociada al sistema de síntesis de cafeína codificada en un gen y su uso
<150> JP 146358/1999
<151> 1999-05-26
10 <160> 21

<210> 1
<211> 356
15 <212> PRT
<213> Camellia sinensis

<400> 1
20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

1
 ES 2 215 572 T3
<210> 2
<211> 1427
<212> ADN
5 <213> Camellia sinensis

<400> 2

10

15

20

25

30

<210> 3
35 <211> 1427
<212> ARN
<213> Camellia sinensis

40 <400> 3

45

50

55

60

65

2
 ES 2 215 572 T3
<210> 4
<211> 20
<213> Camellia sinensis
5
<400> 4

Phe Met Asn Arg Gly Glu Xaa Glu Ser Ser Tyr Ala Gln Asn Ser Gln
1 5 10 15
10 Phe Thr Gln Val
20

<210> 5
15 <211> 19
<212> ADN

<400> 5
20
ttYatgaaYM gIggIgaRg 19

<210> 6
25 <211> 19
<212> ADN

<400> 6
30
caaaagggtc agtgctgca 19

<210> 7
35
<211> 17
<212> ADN

<400> 7
40
atgaccatga ttacgcc 17

<210> 8
<211> 20
45
<212> ADN

<400> 8

50 gccggtacct ttctggggcc 20

<210> 9
<211> 22
55 <212> ADN

<400> 9

60 ccgctgcgtt aagagcttga ag 22

<210> 10
<211> 21
65 <212> ADN

3
 ES 2 215 572 T3
<400> 10

gccaaacact ggaacttcag g 21
5
<210> 11
<211> 23
<212> ADN
10
<400> 11

ccattgaggc cacttgttgc gtg 23

15 <210> 12
<211> 22
<212> ADN

20 <400> 12

ggcctgtcgt ctgaggttat tg 22

25 <210> 13
<211> 22
<212> ADN

30 <400> 13

cagcaatggc catagctaat ag 22

35 <210> 14
<211> 22
<212> ADN

40 <400> 14

ccgctgcgtt aagagcttga ag 22

<210> 15
45
<211> 21
<212> ADN

<400> 15
50

gccaaacact ggaacttcag g 21

<210> 16
55 <211> 23
<212> ADN

<400> 16
60
ccattgaggc cacttgttgc gtg 23

<210> 17
65 <211> 22
<212> ADN

4
 ES 2 215 572 T3
<400> 17

ggcctgtcgt ctgaggttat tg 22
5
<210> 18
<211> 17
<212> ADN
10
<400> 18

gccatggttt acgcgca 17

15 <210> 19
<211> 20
<212> ADN

20 <400> 19

cggccatgga aagaccccgg 20

25 <210> 20
<211> 21
<212> ADN

30 <400> 20

tgatatcact gctgtggcag c 21

35 <210> 21
<211> 21
<212> ADN

40 <400> 21

aaaatttcat gttcaacttc t 21

45

50

55

60

65