COLORANTES Y TECNICAS DE COLORACIÓN

I. FUNDAMENTO TEÓRICO

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el
microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la
rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.

Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas,
paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso
llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede
fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si
se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma.
La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando
después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción.

1.1.- Colorante

Es una sustancia que tiene la propiedad de teñir ceder al cuerpo con el cual entra en contacto .Un
colorante se puede definir como la sustancia o un compuesto orgánico que tiene los grupos
cromoforos y auxocromos ligados a un núcleo bencénico, el grupo cromoforo comunica al cuerpo
a la propiedad del color Y el grupo auxocromo les comunica la propiedad de disociación
electrolítica necesaria para unirse al cuerpo formando sales.

1.2.- Pasos Generales Para Una Coloración

a.) Preparación de un frotis

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra

o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si
aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y
nítida.Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder
aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio
de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados

Pasos

- Con el asa bacteriológica se va a desarrollar un frotis en un portaobjetos de cristal.

- Se toma el asa bacteriológica se pone en la flama del mechero dejándola al rojo vivo para
que se esterilice,

- Se retira del fuego se toma una pequeña gota de agua destilada y se coloca sobre el
portaobjetos, con esta misma asa se extrae una cantidad muy pequeña de una de las
colonias que creció en las placas petri.

- Una vez teniendo ese material en el asa de acude a ponerlo en el portaobjetos en la parte
central desplazando de izquierda a derecha hasta que nos quede delgada, una vez
teniéndola verificamos si ya está lista para el frotis de la muestra del cultivo.

- Por último, se toma el porta de forma lateral para pasarlo por la flama nunca se debe dejar
de forma directa en la flama., también se puede secar a temperatura ambiente Una vez
fijado el frotis queda listo para el proceso de tinción.
 b.) Fijación: temperatura ambiente, mechero

c.) Tinción: Es un método utilizado para estudiar microorganismos. (No vivos); en estas
tinciones se observa morfología, estructura y agrupamientos de microorganismos

1.3 Los colorantes se pueden clasificar:

Según Su Origen:

 NATURALES: como la hematoxilina, el carmín .

 SINTETICOS O ARTIFICIALES: como el azul de metileno, la safranina, azul de anilina, el
naranja G, etc.

Según Sus Propiedades Químicas

La mayoría de los colorantes empleados en histología actúan como ácidos o bases y tienden a
formar uniones salinas con radicales ionizables presentes en los tejidos.

 Colorantes ácidos: como por ejemplo la eosina, colorante cargado en forma negativa,
se une a componentes celulares cargados positivamente. Estos componentes cargados
positivamente se denominan acidófilos, porque tienen afinidad por los colorantes ácidos.
 Hematoxilina
 Verde de malaquita

 Colorantes básicos: como por ejemplo el azul de metileno, colorante cargado

positivamente, se une a componentes celulares cargados negativamente. Estos
componentes cargados negativamente se denominan basófilos, porque tienen afinidad
por los colorantes básicos.
 Eosina
 Azul de metileno
 Cristal violeta

 Colorantes neutros: son colorantes en los que la porción ácida y la básica colorean.
Tiñen las partes básicas de una célula de un color y las partes ácidas de otro. Tiñen el
núcleo de un color y el citoplasma de otro.
 Colorantes indiferentes: tiñen aquellas estructuras o sustancias que los disuelven más
fácilmente que el líquido en que están preparados. Un ejemplo es el colorante sudan, un
colorante de lípidos.

Los Colorantes Se Pueden Agrupar

 Coloración simple:
En esta tinción se utiliza un solo colorante y sirve para determinar forma, tamaño y
agrupación de las bacterias, una de las más comunes es la del Azul de Metileno.

 Coloración doble:
En esta tinción se utiliza más de un colorante .Mediante esta técnica es posible observar
estructura celulares como el citoplasma y el núcleo que toman colores diferentes.
 Coloración diferencial:
 Es aquella que permite distinguir dos coloraciones dependiendo de la diferente
composición y estructura de las bacterias, ejemplo. La coloración de gram, que permite
diferenciar a las bacterias gram positivas y gram negativas y la coloración de Ziehl
Neelsen que permite reconocer a las bacterias acido alcohol resistente.

 Coloraciones especiales:
Son aquella que nos permite reconocer estructuras específicas de los microorganismos,
ejemplo la coloración de esporas, flagelos, cápsulas, granulos meta cromáticos e
inclusiones, etc.

d.) Lavado:

Dejando correr el agua no poniendo de frente al chorro la muestra, para evitar que se
desprenda la muestra

e.) Secado:

Temperatura ambiente.

f.) Observación

Al microscopio

II. OBJETIVOS :

Realizar una tinción gram

Conocer el fundamento del a tinción gram y otras tinciones.
Conocer alguna clasificación de colorantes
Diferenciar formas y algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas
de acuerdo a la tinción de Gram.
Aprender las técnicas más utilizadas de tinción de microorganismos
Adquirir conocimiento teórico_ práctico sobre la realización de esta técnica de
coloración
III. MATERIALES :

 Laminas portaobjetos  Papel toalla

 Cultivo de bacterias
 Mechero

 Fósforos

 Asa de siembra

 Alcohol
 Microscopio
  Colorantes
 Aceite de inmersión

IV. PROCEDIMIENTO :

En el laboratorio se realizo la tinción Gram y se observó las tinciones con Ziehl Neelsen y la
coloración de esporas.

4.1 Coloración De Gram:

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio

bacteriológico y con el que se debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es
indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las
referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se
basan justamente en la tinción de GRAM.

Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló
en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en
dos grupos, gram positivas y gram negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no
tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos
distintos de bacterias).

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana
sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El
material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano.

 La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas

de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de
la célula gram-positiva es peptidoglicano.
 Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de ácidos
teicoicos. Ácido Lipoteicoico que está en la superficie, empotrado en la capa de
peptidoglicano y unido a la membrana citoplásmica. Y ácido teicoico de la pared
que está en la superficie y se une sólo a la capa de peptidoglicano. El ácido
Teicoico es el responsable del determinante antigénico del organismo.

 La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada,
únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de
fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula
gram-negativa es peptidoglicano.

Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por
lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.
En el lipopolisacárido, la porción de lípido está embebida en el fosfolípido y el antígeno O
polisacárido está en la superficie. El lípido se llama Lípido A y es tóxico, pero el
lipopolisacárido entero se llama Endotoxina. La pared de la célula tiene poros llamado
Porinas para el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana
citoplásmica y la pared celular hay un espacio periplásmico con enzimas hidrolíticas,
enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas de transporte.

 También existen diferencias en la composición de la pared entre las células de las diversas
especies.
 Estructuras Citoplasmáticas
 Citoplasma
Membrana Citoplásmica (citoplasmática o protoplasmática)
 Endosporas
 Ribosomas
 Plásmidos
 Nucleoide
4.1.1 Formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una
tinción GRAM:

COCOS

Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división celular. Diplococos, aparecen por
pares. Estreptococos, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en
grupos irregulares, a veces de gran tamaño

BACILOS

Grandes variaciones morfológicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

ESPIRALES
4.1.2 Procedimiento Para Una Tinción Gram:

a) Preparar la muestra

Si es una colonia tomada de un placa primero debemos tomar una gota de agua y luego
una pequeña colonia bacteriana aislada .Luego realizamos el frotis lo más delgado posible.

 Se toma el asa bacteriológica se pone en la flama del mechero dejándola al rojo vivo
para que se esterilice

 Se retira del fuego se toma una pequeña gota de agua destilada y se coloca sobre el
portaobjetos, con esta misma asa se extrae una cantidad muy pequeña de una de las
colonias que creció en las placas petri.

 Hacemos una extensión sobre una lamina portaobjeto lo más delgada posible

 Fijar a la muestra a temperatura ambiente o calor suave

b) Aplicación De Colorantes

 Cubrimos el preparado con cristal violeta por 2 minutos(colorante primario)

El cristal violeta penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram
negativas) a través de la pared bacteriana

 Eliminamos el exceso de colorante con agua corriente

La decoloración debe realizarse a chorro pero no fuerte para evitar que pierdan la
tinción las células bacterianas .EI proceso de decoloración debe ser corto y es
esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios

 Cubrir el preparado con lugol por 2 minutos

El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de

potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo, y actúa de mordiente,
haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula
bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución
acuosa con el cristal violeta.

 Eliminamos el exceso de colorante con agua corriente

 Decolorar con alcohol acetona

Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona,

sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos
(grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La
diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a
la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso
de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico
abre poros y el colorante sale de la célula (y también puede dañar la membrana
citoplásmica a la que se une peptidoglicano).en el caso de las gram positivas el
numero de lípidos es muy pequeña para generar que el colorante se escape el
peptidoglicano se deshidrata y las porinas se cierran.

 Eliminamos el exceso de colorante con agua corriente

 Contrastar con safranina 30 segundos(coloración de contraste)

Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram
negativas. Al término las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram
negativas, se verán rosas

 Eliminamos el exceso de colorante con agua corriente

 Secamos a calor suave o a temperatura ambiente
 Observar
4.1.3 Fundamento de la tinción gram:

El fundamento de la técnica se basa en las diferencias entre las paredes celulares de las
bacterias Gram positivas y Gram negativas

Las bacterias gramnegativas tienen una gruesa capa de péptidoglicano que es capaz de
retener al complejo colorante mordiente (cristal violeta) .durante la decoloración con alcohol
acetona se provoca una deshidratación de esta gruesa pared y se reduce a la porosidad,
atrapando entonces al complejo en el interior de la célula.

Las bacterias gram negativas poseen una delgada capa de peptidoglicano no puede impedir la
salida del complejo colorante mordiente (cristal violeta) y es entonces fácilmente teñida por un
colorante secundario o de contraste.

4.1.4 Observaciones con la coloración gram en el laboratorio

GRAM NEGATIVOS:

 Manos de Alexander (suspensión)

Diplococos y estafilococos (tipo neisseria)

 Muestra de seudomonas (placa petri)

Bacilos (diplobacilos), estreptobacilos
 Muestra de E.coli (placa petri)
Bacilos

 muestra de Seudomona floureses

Bacilos (son más gorditas que las de E.coli)
  Bacilo gram negativos: Seudomona A.

GRAM POSITIVOS

 Suspensión De Puerta (Placa Petri)

Estafilococos Gram Positivos:
 Manos De Alexander(Tipo Neisseria ) (Placa Petri)
Diplococos Estafilococos (Racimo)

 Manos De Albert (Placa Petri)

Estafilococos
 Reja De Cintia (Placa Petri)
Bacilos y Cocos

 Bacilos Gram Positivos :B. Cerius

  Muestra De Puerta (Suspensión)
Levaduras

4.2 Coloración De Ziehl Neelsen:

Se emplea para detectar la presencia de BAAR (Bacilos Acido-Alcohol Resistentes).Las

paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos de cadena larga
(50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con
alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-
alcohol resistente.

Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos

como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La
coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese
la pared bacteriana que contiene ceras.

Utilidad: diagnóstico de enfermedades infecciosas producidas por:

a) Micobacterias → Micobacterium tuberculosis (Tuberculosis) y Micobacterium leprae

(Lepra).
b) Bacterias del género Nocardia → Nocardiosis (similar a tuberculosis)

4.2.1 Procedimiento de una tinción Ziehl Neellsen

 Hacer una extensión de la muestra sobre un portaobjetos delimitándola. Es necesario

quemar los bordes de a lamina al mechero.
 Cubrir el preparado con fucsina fenicada de Ziehl Neelsen (colorante principal)
 Calentar hasta el desprendimiento de humos blanquecinos, repetir dos veces.
 Eliminar el exceso de colorante con agua corriente.
 Decolorar con alcohol acido
 Eliminar el exceso de alcohol acido con agua corriente.
 Contrastar con azul de metileno o con acido pícrico.(colorante secundario)
 Lavar
 Secar
 Observar
4.2.2 Fundamento De La Coloración De Ziehl Neelsen

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias, contienen ácidos grasos de cadena
larga que les confiere la propiedad de resistir la decoloración con alcohol _acido, después
de la tinción con colorantes básicos. Por eso se denominan acido-alcohol resistentes.las
micobacterias como M.tuberculosis y M.marinum y los parásitos coccidios como
Cristoporidium se caracterizan por sus propiedades de acido-alcohol resistentes.

La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante

atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar
con agua provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que la colorante ya
no puede salir de las bacterias.

Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de la molécula del colorante lo
cual también facilita su entrada a las bacterias .las que resistenten la coloración son de
color rojo y la que no se ven color azul.

4.2.3 Observaciones con muestras de coloración Ziehl Neelsen

 Mycobacterium tuberculosa

o Bacilo de color rojo

o Campo azul,
o Bacilos cortos y delgaditos
4.3 Coloración De Esporas:

Existen diversos tipos de esporas microbianas, pero la espora bacteriana tiene especial
importancia ya que son organelos de gran resistencia que se producen en el interior de la célula,
por lo que reciben el nombre de endosporas. La endospora es una estructura compuesta, de
dipicolinato de calcio en el centro, dentro de su compleja cubierta que consta de siete capas que
contienen mureina
Pocos géneros de bacterias son capaces de formar endosporas, siendo los principales: Bacillus
y Clostridium.
La esporulación de una bacteria no es debida a condiciones desfavorables del medio, sino que
se forman en cierto período del desarrollo de la célula. La función de las endosporas no es la
reproducción, ya que de un bacilo que forma una espora solo surge una bacteria por
germinación.

Tanto el tamaño, como la forma y posición de la espora en la célula bacteriana son caracteres
relativamente constantes de cada especie, ya que poseen cierto valor para distinguir entre sí los
diferentes tipos de bacterias esporuladas.

La posición de la espora en la célula puede ser central, sub-terminal o terminal y de forma

redonda u ovalada. La espora puede también ser más grande que el diámetro de la bacteria o
menor que éste.

Las endosporas bacterianas son muy resistentes y refractarias a la desecación, a los agentes
químicos y sobre todo a temperaturas elevadas, ya que pueden sobrevivir expuestas a altas
temperaturas durante largos períodos a diferencia de las bacterias vegetativas normales que
mueren con breves exposiciones.

4.3.1 Técnica de la coloración de esporas:

 Preparar una extensión a partir del cultivo bacteriano.

 Colocar la extensión sobre un soporte y agregar suficiente solución de verde de
Malaquita al 5%.(colorante principal)
 Flamear la extensión pasando por debajo de ésta el mechero Bunsen ó lámpara de
alcohol hasta observar una ligera emisión de vapores por espacio de minuto y medio,
evitando que se evapore totalmente el colorante.
 Lavar enérgicamente al chorro del agua, hasta eliminar exceso de colorante.
  Cubrir la preparación con solución de contraste, Safranina al 5%, y dejar actuar el
colorante durante un minuto y medio.
 Lavar al chorro del agua hasta eliminar el exceso de colorante.
 Secar al aire o utilizando papel absorbente.
 Observar al microscopio con objetivo de inmersión en aceite.

4.3.2 Fundamento De La Tinción De Esporas

Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores
ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el
microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción.

La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

a. Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.

b. Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.

Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo
harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo coloran

4.3.3 Observación de Esporas

 Clostridium tetani:
 Bacilos esporulados
 Espora terminal
 Espora central
 Espora sub terminal
 Bacilos Esporulados

V. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En esta práctica se logro realizar adecuadamente los pasos para una tinción Gram, respetando el
tiempo y el orden de los colorantes, así como también teniendo en cuenta cuáles de ellos son
colorantes principales y cuales son de contraste y qué función cumplen dentro de esta tinción .

Se identificaron bacterias gram negativas y las bacterias gram positivas por la coloración que estas
presentaron siendo las bacterias gram positivas color morado y las gram negativas color rosado
.Esto se debe a la diferencia de pared celular que estas bacterias presentan (Gram positivas: capa
gruesa de peptidoglicano en su pared. Gram negativas: capa delgada de peptidoglicano en su
pared) motivo por el que se fundamenta la tinción Gram.

Pudimos reconocer y diferenciar las distintas formas de las bacterias como cocos, diplococos,
estafilococos, y algunos de ellos presentaron racimos.

También pudimos observar algunas muestras con coloración de Ziehl Neelsen (esta coloración es
diagnostica) para reconocer bacterias acido-alcohol resistentes donde se observó un citoplasma
azul y diferenciándose claramente de la tinción Gram. Así como también muestras con coloración
para esporas logrando ver esporas centrales, terminal y sub terminal.
V. CONCLUSIONES:

 Logramos aprender la técnica más utilizada de tinción de microorganismos la tinción Gram

 Se logro diferenciar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas.
 Se reconoció la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización e identificación
de las bacterias.
 Comprendimos la importancia de una tinción y cuál es el fundamento de la tinción gram y otras
tinciones.
 Adquirimos y practicamos un conocimiento teórico_ práctico sobre la realización de esta
técnica de coloración

VI. BIBLIOGRAFÍA

 http://www.revistaciencias.com/publicaciones/EElpZEVkykPMncqxmd.php
 http://www.facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos2010/DptoMedInt/Tencion_de_gram.pdf
 http://darwin.bio.ucm.es/revistas/index.php/reduca-biologia/article/viewFile/61/88
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 http://www.solociencia.com/biologia/microbiologia-tecnicas.htm
 http://www.csiCif.es/andalucia/modules/mod_ense/revista/pdf/Numero_11/ROSARIO_ALORS_
1.pdf
 http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
 http://es.scribd.com/doc/5368278/Fundamentos-de-la-tincion-de-Gram
http://www.bio-nica.info/biblioteca/TincionBacterias.pdf