BIOCHEMISTRY JOURNAL

Antioxidants Inhibit Nuclear Export of

Telomerase Reverse
Transcriptase and Delay Replicative
Senescence of Endothelial Cells

NAMA ; WAYAN SWANDEDY

NPM ; 12700083 / 2012A
Kelompok ; 7

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS WIJAYA KUSUMA

SURABAYA 2012/2013
 Antioxidants Inhibit Nuclear Export of Telomerase Reverse
Transcriptase and Delay Replicative Senescence of Endothelial Cells

Abstrak - Aging dikaitkan dengan peningkatan spesies oksigen reaktif intraseluler ( ROS ) dan
hilangnya telomerase membalikkan aktivitas transcriptase. Oleh karena itu, kami meneliti
hipotesis bahwa peningkatan berhubungan dengan usia pada spesies oksigen reaktif ( ROS )
dapat menyebabkan ekspor nuklir TERT dan berkontribusi untuk penuaan sel endotel. Budidaya
yang berkelanjutan dari sel endotel mengakibatkan pembentukan endogen peningkatan ROS
yang dimulai setelah 29 doubling populasi ( PDL ). Kenaikan ini disertai dengan kerusakan DNA
mitokondria dan mendahului timbulnya penuaan replikatif di PDL 37. Inkubasi dengan
antioksidan N - acetylcysteine, dari PDL 26, mengurangi pembentukan ROS intraseluler dan
mencegah kerusakan DNA mitokondria. Demikian juga, ekspor nuklir protein TERT, kerugian
dalam kegiatan TERT keseluruhan, dan terjadinya penuaan replikatif tertunda dengan inkubasi
dengan N - acetylcysteine. Kami menyimpulkan bahwa kedua antioksidan dan statin dapat
menunda timbulnya penuaan replikatif dengan menangkal peningkatan produksi ROS yang
terkait dengan penuaan sel-sel endotel.
Kata Kunci: penuaan,spesies oksigen reaktif, Kinase Src – keluarga,statin, TERT

Bahan dan Metode

Kultur Sel
Sel endotel manusia ( Clonetics , Cologne , Jerman ) dikultur dalam medium basal endotel
dilengkapi dengan hidrokortison ( 1 G / mL ) , ekstrak otak sapi ( 12 G / mL ) , gentamisin ( 50 g
/ mL ) , amfoterisin B ( 50 ng / mL ) , faktor pertumbuhan epidermal ( 10 ng / mL ) , dan 10 %
serum janin anak sapi sampai bagian ke-15 sebagai described.22 , 23 Singkatnya , percobaan
dilakukan pada beberapa budaya primer. Mulai dari tiga budaya yang berbeda primer ( dibeli dari
Clonetics ) , sel-sel endotel manusia yang diunggulkan di sejumlah sel 6105 per 75 cm2 termos
dan trypsinized pada pertemuan ( antara 6 sampai 7 hari ). Sel endotel diwarnai dengan von
Willebrand factor untuk mengecualikan dedifferentiation . Setelah detasemen dengan tripsin ,
sel-sel endotel yang diunggulkan menjadi hidangan 6 - cm dan isolasi protein , isolasi DNA
genom , atau analisis FACS dilakukan.

Telomerase Aktivitas Enzim Pengukuran

Aktivitas enzim telomerase diukur dengan menggunakan alat tes berbasis PCR yang tersedia
secara komersial sesuai dengan protokol produsen. Telomeric ulangi protokol amplifikasi
( TRAP ) tes dilakukan dengan menggunakan TS biotinlabeled primer seperti sebelumnya
described.
Immunostaining
Sel tetap dalam paraformaldehyde 4% dan permeabilized menggunakan 3 % bovine serum
albumin, 1 % NP - 40. Setelah inkubasi dengan antibodi terhadap TERT ( 1:75 ; Abcam ,
Jerman ) dan dengan tambang Rhoda RedX antibodi sekunder terkonjugasi ( 1:300 , Probe
Molekuler ) , inti diwarnai dengan tropo 3 iodida ( Probe Molekuler ) dan dianalisis dengan
confocal laser scanning microscopy.

Deteksi Mitokondria Massa

Sel hidup diinkubasi dengan 100 ng / mL acridine orange ( Probe Molekuler ) selama 30 menit
pada suhu 37 ° C. Sel trypsinized selama 2 menit , reaksi dihentikan dengan PBS yang
mengandung 10 % FCS , dan sel-sel pellet dengan sentrifugasi . Setelah dicuci dengan PBS , sel-
sel disuspensi kembali dalam PBS dan diukur dengan menggunakan analisis FACS .

Deteksi Sel BrdU Positif

Sel hidup diinkubasi dengan BrdU label reagen untuk 60 menit pada suhu 37 ° C. Sel trypsinized
selama 2 menit , reaksi dihentikan dengan PBS yang mengandung 10 % FCS , dan sel-sel pellet
dengan sentrifugasi . Sel diinkubasi dengan anti - BrdU - FITC selama 30 menit dan selanjutnya
dengan 1G / mL propidium iodida. Analisis dilakukan dengan menggunakan FACS .

Deteksi Stres oksidatif

Sel hidup diinkubasi untuk penyerapan dye dengan 20 Mol / L 2, 7 - Dichlorodihydrofluorescein
diasetat ( H2DCF - DA ) selama 30 menit ( Probe Molekuler ) . Sel trypsinized selama 2 menit ,
reaksi dihentikan dengan PBS yang mengandung 10 % FCS , dan sel-sel pellet dengan
sentrifugasi. Sel disuspensi kembali dalam PBS dan diukur dengan menggunakan analisis
FACS .
Pemisahan Nuklir dan Cytosolic Pecahan
Fraksi nuklir dan sitosol dipisahkan menggunakan kit yang tersedia secara komersial sesuai
dengan protokol produsen ( Pierce ) seperti yang dijelaskan previously.24 Secara singkat , sel-sel
yang dikerok hidangan di PBS dan disentrifugasi pada 800g selama 5 menit pada suhu 4 ° C.
Kemurnian fraksi diyakinkan oleh imunobloting dengan tubulin .

Asam - Galaktosidase ( Gal ) Pewarnaan

Sel yang tetap selama 10 menit dalam 2 % formaldehida , 0,2 % glutar - aldehida di PBS , dan
diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37 ° dengan Gal solusi segar Pewarnaan seperti yang
dijelaskan previously.22 Jumlah absolut sel biru dalam kaitannya dengan jumlah ditentukan dari
1.000sel.
statistika
Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan uji t student . Data dinyatakan sebagai mean
SD .
Hasil
Peningkatan Pembentukan ROS dan Kehilangan Utuh Mitochondrial DNA Diawali
dengan Onset of Penuaan di Sel endotel
Penuaan sel endotel dipelajari dengan menundukkan sel endotel untuk bagian berikutnya sampai
bagian 14 seperti yang dijelaskan previously.22, 23 dedifferentiation dikeluarkan oleh faktor von
Willebrand pewarnaan. Dalam model eksperimental ini, kita menyelidiki peningkatan tergantung
umur dalam pembentukan ROS, disfungsi mitokondria, dan penuaan replikatif .

Kenaikan Formasi ROS Menghasilkan Kehilangan Nuklir TERT Kegiatan Sebelum

Pengurangan Keseluruhan TERT Kegiatan
Berbagai studi telah menunjukkan bahwa aktivitas subunit katalitik dari telomerase, telomerase
reverse transcriptase ( TERT ), sangat penting untuk mencegah sel-sel dari penuaan masuk
dengan pemanjangan telomeres. Studi immunocytochemical mengkonfirmasi temuan ini dan
juga menunjukkan penurunan dari pewarnaan TERT didominasi nuklir di penggandaan populasi
32. Sebaliknya, aktivitas TERT dan TERT protein tidak berubah dalam lisat sel seluruh antara
penggandaan populasi 29 dan 32, menunjukkan bahwa translokasi TERT dari nukleus ke sitosol
mendahului downregulation aktivitas TERT keseluruhan.

Peran Src - Keluarga Kinase dalam Aging Sel endotel

Ekspor nuklir ROS - diinduksi TERT di HEK293 dimediasi oleh kinase Src - keluarga tirosin
tergantung phosphorylation. Selain itu, ini juga ditetapkan bahwa inkubasi dengan ROS
menyebabkan aktivasi kinase Src - keluarga di types. Sel yang berbeda karena itu, kami
menyelidiki apakah kinase Src - keluarga diaktifkan selama penuaan sel endotel . Src - aktivasi
dipantau oleh deteksi fosforilasi Tyr Tyr 416,29 416 fosforilasi secara signifikan di-berkerut di
PDL 29. Menariknya , fosfor - ylation dari penghambatan Tyr 527 dalam Src29 situs juga
menurun secara signifikan mulai dari PDL 32.

N - Acetylcysteine Mengurangi Aged - Induced ROS Pembentukan dan Translokasi TERT

dan Penundaan Onset of the replikatif Penuaan
Untuk menyelidiki apakah peningkatan usia terkait dalam pembentukan ROS memang kausal
kontribusi untuk TERT translokasi, sel endotel diinkubasi dengan dosis rendah antioksidan N -
acetylcysteine. Seperti ditunjukkan pada Gambar 4A dan 4B, inkubasi dengan N - acetylcysteine
mulai dari penggandaan populasi 26 mencegah peningkatan pembentukan ROS dan pengurangan
DNA mitokondria utuh. Selain itu, pengurangan aktivitas TERT nuklir diblokir oleh N -
acetylcysteine. Selain itu, N - acetylcysteine mencegah penurunan aktivitas TERT keseluruhan
selama lebih terjadi penyaluran dan menunda terjadinya penuaan replikatif.

Penundaan Atorvastatin Sel Endotel Aging

Baru-baru ini, telah menunjukkan bahwa statin dapat memberi efek antioxidative dengan
menghambat ekspresi p22phox dalam sel otot polos, 30 sehingga menghambat aktivitas oksidase
NADPH dan pembentukan ROS. Peningkatan pembentukan ROS secara signifikan dikurangi
dengan atorvastatin. Inkubasi dengan atorvastatin juga menghambat hilangnya DNA mitokondria
utuh dan membatalkan pengurangan aktivitas TERT nuklir dan secara keseluruhan dan protein.
Lebih lanjut, inkubasi dengan atorvastatin menunda terjadinya penuaan sel endotel. Secara
bersama-sama, atorvastatin mengurangi pembentukan usia yang disebabkan ROS, TERT
translokasi, dan kemudian, penuaan sel endotel .