CHAVES-GARCÍA, S.N; CRUZ-CONTRERAS, S.F & QUIROGA-CAMARGO,W.

E
MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

ENZIMAS: ESTUDIO CINÉTICO DE LA CATALASA

Chaves-García, Sintia Nicol; Cruz-Contreras Sara Fernanda; Quiroga-Camargo, William
Esteban

RESUMEN
Las enzimas son biomoléculas especializadas en la regulación de la actividad en una reacción. En
esta práctica de laboratorio, la catalasa se empleó para determinar cómo se altera la velocidad de la
reacción al variar los efectos de la concentración de sustrato, el tiempo, la temperatura y el pH. La
metodología se llevo a cabo a partir de la titulación, según las condicones anteriores. Los resulatdos
obtenidos nos indicaron que esta enzima tiene unas condiciones específicas las cuales permiten que
disminuya la energía de activación de la reacción; algunas de las gráficas obtenidas representan la
cinética de Michaelis-Menten, dando a conocer la concentración existente en los complejos enzima-
sustrato es constante a lo largo de la reacción y esto conlleva a la determinación de la velocidad
máxima. La determinación de moles de KMnO4 nos permiten observar la velocidad máxima en cada
uno de los efectos y las características óptimas para que la enzima sea más eficiente.

PALABRAS CLAVE: Enzima, concentración de sustrato, tiempo, temperatura, pH, velocidad de

reacción.

ABSTRACT

Enzymes are biomolecules specialized in the regulation of activity in a reaction. In this laboratory
practice, catalase was used to determine how the reaction rate is altered by varying the effects of
substrate concentration, time, temperature and pH. The methodology is carried out from the degree,
according to the previous conditions. The results of this report indicate that this enzyme has specific
conditions to decrease the activation energy of the reaction; some of the commercial graphics
represent the kinetics of Michaelis-Menten, just as the concentration in enzyme-substrate complexes
is constant throughout the reaction and this leads to the search for maximum speed. The
determination of the moles of KMnO4 allows us to observe the maximum speed in each of the effects
and the optimal characteristics for the enzyme to be more efficient.

KEYWORDS : Enzyme, substrate concentration, time, temperature, pH, reaction rate.

INTRODUCCIÓN por varios aminoácidos , aunque las moléculas

como el ARN también entran en esta
Las enzimas son catalizadores biológicos. Son categoría. Las enzimas son altamente
generalmente proteínas grandes compuestas específicas, por lo que cada una acelera una
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sola reacción e interviene para disminuir la
energía de activación, permitiendo conocer la
cantidad de energía que necesita la reacción
para llevarse a cabo. Este proceso enzimático
inicia cuando las enzimas o sustratos, se unen
a las moléculas de los reactivos, esto genera
que la actividad de formación y rompimiento
de enlaces suceda a mayor velocidad. Este
proceso es temporal, por lo que la enzima
volverá a su estado original al final de la
reacción; Así cuando una enzima ha terminado
de catalizar una reacción, solo libera el
producto y continua su ciclo de catálisis.
Varios factores afectan la acción de las
enzimas: concentración de sal, pH,
temperatura, radiación, la concentración de
enzimas y la concentración del
sustrato.(OpenStax, 2017).
La catalasa es una enzima responsable de la
degradación del peróxido de hidrógeno,
presente en casi todas las células animales. De
igual manera, se encuentra en tejidos vegetales
como en animales, a nivel celular se localiza
en las mitocondrias y los peroxisomas del
hígado, como también en las células renales de
las células animales. Pero es especialmente
abundante en los órganos de almacenamiento
de plantas como las papas y las partes carnosas
de los frutos. (Science in Motion, 2015).
La catalasa consta de un grupo Hemo de 4
subunidades que se mantienen unidas por las
interacciones no covalentes. Está presente en
los organismos aeróbicos, previniendo la
acumulación de peróxido de hidrógeno (H2O2)
en agua y oxígeno. El peróxido de hidrógeno
es un agente oxidante fuerte, que tiende a
interrumpir el equilibrio químico a nivel
celular. La fórmula química para esta reacción
es:
2H2O2 ⇌ 2H2O + O2
La velocidad de catálisis de una enzima se
puede medir por la velocidad a la que se forma
el producto, o por velocidad a la que
desaparece el sustrato. El modelo de
Michaelis-Menten explica el comportamiento
hiperbólico de la velocidad con respecto a la
concentración de sustrato.
En el modelo postularon que la enzima (E) se
combina en primer lugar con el sustrato (S), de
forma reversible, formando el complejo
enzima-sustrato (ES), que se descompone en
un segundo paso dando la enzima libre (E) y el
producto (P). La velocidad de la última
reacción es irreversible. La enzima puede
existir en dos formas, en forma libre (E) o
combinada como ES, cuando la [S] es baja la
mayoría de la enzima estará libre y se verá
favorecida la formación de ES, cuando se va
incrementando la [S] la velocidad aumenta
linealmente. La [E] libre será la diferencia
entre la [E] total o inicial y la [ES] o enzima
combinado con el sustrato, y la velocidad
máxima se alcanzará cuando toda la enzima se
encuentre en forma de ES (Pérez, J. M., et al
2019).
Ecuación de Michaelis-Menten:
𝑉 𝑚𝑎𝑥 ∗ [𝑆]
𝐸𝐸 → 𝐸 + 𝐸 𝑣 =
𝐾𝑚 + [𝑆]
Este laboratorio trata cómo la actividad de la
catalasa se ve afectada por diferentes factores:
pH, temperatura, tiempo y la concentración de
sustrato específicamente, qué efecto tendrán la
velocidad de reacción para cada uno. De
acuerdo con una titulación con KMnO4 que va
a medir la presencia de la concentración del
peróxido de hidrogeno final para cada
experimento. La reacción que ocurre es:
5HO2+2KMnO4+3H2SO4⟹
8H2O+5O2+2MnSO4+K2SO4
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Obtención de catalasa
La catalasa se extrajo a partir de la papa. Para
ello se pesó aproximadamente 100.1g de papa
recién pelada, se mezcló en la licuadora con un
volumen de agua destilada, sin superar un
volumen total de 250,0 mL, se licuo hasta
obtener una mezcla homogénea y se dispuso el
filtrado de la mezcla en un baño de hielo
previamente preparado. Durante toda la
práctica se mantuvo el extracto en el hielo.
2. Efecto del pH sobre la velocidad de
reacción
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Con el extracto de catalasa en hielo, se

dispusieron las cantidades establecidas según
la Tabla 1. Primeramente, se agregaron los
Tabla 1. Efecto del pH
volúmenes del sustrato (peróxido de en la velocidad de
hidrogeno (H2O2) a pH indicado para cada una reacción de la enzima
de las muestras, seguidamente de dos minutos catalasa, extraída de
se agregó 0.5μL del extracto, medido con una papa.
micropipeta de volumen 100μL, de igual
manera se esperó el mismo tiempo y se le
añadió por último 5,0 mL de (H2O4 ,1M).
Finalmente se realizó la titulación con KMnO4
Tabla 2. Efecto
para cada una de las muestras. de la
3. Efecto de la temperatura sobre la temperatura
velocidad de reacción. en la velocidad
Las muestras se colocaron en los respectivos de reacción de
la enzima
baños de agua de la marca [ANALYTICA] a
catalasa,
temperaturas establecidas. Una vez colocados extraída de papa.
en los baños, se esperaron 5 minutos en estos.
Finalizado el tiempo, se agregó el sustrato
(H2O2) a pH 7.0 para cada una de las muestras, Tabla 3 Efecto
del tiempo en la
seguidamente se esperó dos minutos y se les velocidad de
agrego el extracto, de igual manera se esperó reacción de la
el mismo tiempo y se le añadió por último enzima catalasa,
(H2SO4 ,1M). Finalmente se realizó la extraída de papa.
titulación con KMnO4 para cada una de las
muestras. Ver tabla 2.
4. Efecto del tiempo sobre la velocidad de
reacción Tabla 4. Efecto
Primeramente, se agregaron los volúmenes del de la
concentración de
sustrato (peróxido de hidrogeno (H2O2) a pH sustrato en la
7.0 para cada muestra en el tiempo establecido. velocidad de
Seguidamente del tiempo indicado, se agregó reacción de la
el exacto, como de igual manera uno después enzima catalasa.
de otro, en el caso del (H2O4 ,1M). Finalmente
se realizó la titulación con KMnO4 para cada
una de las muestras. Ver tabla 3.
5. Efecto de la concentración de sustrato RESULTADOS
sobre la velocidad de reacción
Primeramente, se agregaron los volúmenes del
sustrato (H2O2) a pH 7.0 para cada una de las Efecto de la Concentración de Sustrato
muestras, luego se le proporción los
volúmenes de agua, seguidamente se agregó el
extracto, esperando 2 minutos, se le añadió el
(H2O4 ,1M). Finalmente se realizó la titulación
con KMnO4 para cada una de las muestras.
Ver tabla 4.
Tablas:
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Tabla 7. Datos para la figura 2, Donde se

divide la concentraciòn de H2O2 para hallar su
inverso igual que la velocidad.
Tabla 5. Datos obtenidos sobre el efecto de la
concentración de sustrato.

Tabla 6. Datos para la figura 1, para hallar la
concentracion de H2O2 se utilizo la molaridad
y el volumen total.
Figura 2. Grafica del inverso de velocidad vs
inverso de concentración, donde se muestra
una relaciòn lineal despues de un aumento y
decrecimiento brusco.
Efecto del Tiempo

Figura 1. Grafica velocidad vs concentración,

Tabla 8. Datos volumen gastado de KMnO4
donde se muestra que a medida que aumenta la
respecto al efecto del tiempo.
concentraciòn la velocidad tambien.
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Tabla 10. Datos figura 4, velocidad de la

Tabla 9. Datos figura 3, de diferentes tiempos
reacciòn con respecto a diferentes
con su respectiva velocidad de reacciòn.
temperaturas.

Figura 3. Grafica velocidad vs tiempo, donde

se muestra un punto maximo entre los minutos
4 y 6 y luego se muestra un comportamiento
en la grafica que tiende a ser constante
aproximadamente desde el intervalo de tiempo Figura 4. Grafica de velocidad vs
7 hasta el 15. temperatura, donde se observa un
comportamiento decreciente a lo largo de esta
(desde la temperatura 15 hasta la 92).

Efecto pH

Efecto de la Temperatura

Tabla 9. Datos volumen gastado de KMnO4 Tabla 11. Datos volumen gastado de KMnO4
respecto al efecto de la temperatura. respecto a el efecto de pH.
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Tabla 12. Datos figura 5, velocidad de la
reacciòn con respecto a diferentes pH.
Figura 4. Grafica de velocidad vs pH, donde
se observan dos puntos maximos en el pH 4 y
el 7
DISCUSIÓN
Las enzimas requieren trabajar en optimas
condicones por diversos factores, entre estos
tenemos, el pH, la concentración, el tiempo y
la temperatura; que alteran a las proteínas.
En la mayoría de las reacciones químicas, la
velocidad en las enzimas aumenta la
temperatura y esto sucede porque la energía
cinética incrementa, la cual favorece a la
desnaturalización y por lo tanto, esta proteína
pierde su capacidad catalizadora. En la figura
4, se observa que la temperatura de 15 grados
centígrados no debió ser alta la velocidad, esto
se debe a errores experimentales ya sea por
manejo del tiempo.
Todas las enzimas poseen en su estructura
primaria aminoácidos con grupos radicales
ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2;
tiol -SH; etc.). La relación entre el pH y su
actividad va a depender el comportamiento
(acido-base) de la enzima con el sustrato,
específicamente del sitio activo, donde se
realiza la disociación de estos. (Science in
Motion, 2015). Dependerá del medio en el que
se encuentren, pueden tener, o no carga. Sea
esta positiva, negativa o neutra. Estas cargas
sirven para estabilizar la conformación natural
de la proteína y cuando el pH las cambia,
también se modifica la estructura, llevando a
la desnaturalización de la proteína y conforme
cambia la carga en este grupo, la proteína
puede desenrollarse, volverse más compacta o
disociarse, todo lo cual conduce a la perdida de
la actividad de las enzimas.De igual manera la
actividad de la enzima tiene un valor concreto
de pH, que recibe el nombre de pH óptimo en
los resultados podemos observar que el pH en
que la velocidad de reacción es más optima es
en el pH 7.
En los demás valores de pH observamos que el
cambio de estos provocará una disminución de
la actividad.
En la grafica despues de el pH optimo se
presenta un decrecimiento esto ocurre debido
a lo explicado anteriormente, las enzimas ya
tienen ciertas cargas en sui estructura y debido
al cambio de pH estas cambian y
desnaturalizan la proteina lo que produce la
perdida de la actividad enzimatica.
La mayor parte de las enzimas son muy
sensibles a las variaciones de pH. Esta
adaptación garantiza su funcionamiento
independientemente del valor del pH del
alimento ingerido (Pérez, J. M., et al 2019).
La desnaturalización térmica depende del
tiempo, y para una enzima el término
"temperatura óptima" tiene poco significado
real a menos que se registre la duración de la
exposición a esa temperatura. La estabilidad
térmica de una enzima se puede determinar al
exponer primero la proteína a un rango de
temperaturas durante un período de tiempo
fijo, y luego medir su actividad a una
temperatura favorable. La temperatura
presenta dos efectos contrapuestos, por un
lado, el aumento de temperatura produce, de
forma general, un aumento en la velocidad de
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cualquier reacción química; pero también
proporciona que las enzimas experimenten
una desnaturalización y pérdida de actividad al
superar una determinada temperatura. La
temperatura óptima, presenta curvas de
actividad con un incremento inicial de
actividad más pronunciado para
posteriormente al irse desnaturalizando,
decrecer la velocidad de reacción. El aumento
de la temperatura aumenta la velocidad de las
reacciones catalizadas por enzimas. Las tasas
alcanzan un máximo y luego comienza a
disminuir. La disminución de la velocidad a
una temperatura más alta se debe a la
desnaturalización de las enzimas (Frey, PA,
and Hegeman, AD, 2007).
Principalmente, la velocidad de la reacción o
catálisis varía de acuerdo a la concentración
del sustrato. Al aumentar o disminuir la
concentración de sustrato, la actividad
enzimática varia, siendo la velocidad de
reacción directamente proporcional al sustrato
concentración hasta alcanzar la velocidad
máxima, punto donde la enzima se satura,
debido a que las enzimas tienen todos sus
sitios activos ocupados (Biología, B. (2019).
En toda reacción enzimática si se incrementa
la concentración de la enzima, se forma una
mayor cantidad de producto por unidad de
tiempo. El incremento de la velocidad de
reacción es directamente proporcional al
incremento en la concentración de la enzima,
siempre y cuando la cantidad de sustrato no
sea limitante, es decir, que el sustrato no llegue
a agotarse. (Céspedez, M.E. Hernández, L.I.
Llópiz, J.N, 2011). En la figura 1, se puede
apreciar la tendencia lineal la cual se deduce
que en el punto que esta más afuera de la
tendencia tiene la opción de linealizar, es
decir, que no es muy buena ya que debe dar la
tendencia en forma de media parábola; por lo
tanto, resulta que se debe a errores
experimentales (descritos más adelante). Por
otra parte, la inversa de la concentración del
peróxido se obtuvo lineal lo cual infiere a que
resulto bien, dando a conocer que se grafica
para que con la pendiente de esa recta se saque
la velocidad maxima y el Km con el punto que
se encuentra con los ejes y o x.
Las enzimas no alteran el equilibrio de una
reacción, debido a que la enzima no cambia la
estructura y la energía de los productos y
reactivos, sino que simplemente permiten que
el equilibrio de la reacción se alcance más
rápidamente (Castro J., 2014).
Los factores ambientales como el pH y la
temperatura pueden afectar y afectan la
posición del equilibrio. Las reacciones in vivo
no pueden pasar a su posición de equilibrio,
haciendo que la reacción se detenga y no
habría un flujo neto a través de la reacción. De
igual manera ayudan a caracterizar las
propiedades de la enzima, evaluando el
cambio de la velocidad cuando se altera el pH
por ejemplo. Influencia de control sobre la
actividad de la enzima (Robinson PK., 2015).
Una razón común para esta disminución de la
velocidad de la reacción es que el sustrato
dentro de la mezcla se está agotando y, por lo
tanto, se está volviendo limitante.
Alternativamente, puede ser que la enzima sea
inestable y se desnaturalice a lo largo del
experimento, o podría ser que el pH de la
mezcla esté cambiando, ya que muchas
reacciones consumen o liberan protones
(Robinson PK., 2015).
Las sustancias que reducen la actividad de una
reacción catalizada por enzimas se conocen
como inhibidores. Actúan influyendo directa o
indirectamente en las propiedades catalíticas
del sitio activo. Una de sus características es
que pueden desplazar del sitio activo si se usan
altas concentraciones de sustrato. Las altas
concentraciones del sustrato o del producto
pueden ser inhibidoras (Robinson PK., 2015).
Las catalasas que contienen grupos hemo que
descomponen el peróxido de hidrógeno por un
mecanismo de dos etapas en el que el peróxido
de hidrógeno oxida y reduce alternativamente
el hierro hemo en el sitio activo. El primero de
ellos ocurre cuando, una molécula de peróxido
de hidrógeno oxida el grupo hemo a una
especie oxyferryl (Fe IV -O). En el segundo
mecanismo, se utiliza una segunda molécula
de peróxido de hidrógeno como reductor para
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regenerar la enzima, produciendo agua y
oxígeno. Algunas catalasas contienen
NADPH como cofactor, que funciona para
prevenir la formación de un compuesto
inactivo. Las catalasas pueden tener otro
papel: la generación de ROS, generalmente
hidroperóxidos, en la irradiación con UVB.
De esta manera, la luz UVB se puede
desintoxicar a través de la generación de
peróxido de hidrógeno, que luego se puede
degradar por la catalasa. NADPH puede
desempeñar un papel en el suministro de los
electrones necesarios para reducir el oxígeno
molecular en la producción de ROS. Gran
parte del peróxido de hidrógeno que se
produce durante el metabolismo celular
oxidativo proviene de la descomposición de
uno de los ROS más dañinos, a saber, el radical
anión superóxido (O 2- ). El superóxido se
descompone por las superóxido dismutasas
presentes en el peróxido de hidrógeno y
oxígeno. El superóxido es tan dañino para las
células que las mutaciones en la enzima
superóxido dismutasa pueden conducir a la
ELA, que se caracteriza por la pérdida de
motoneuronas en la médula espinal y el tallo
cerebral. Además las enzimas antioxidantes,
incluida la catalasa, forman la primera línea de
defensa contra los radicales libres, por lo que
su regulación depende principalmente del
estado oxidante de la célula (McDowall, J.,
2004).
En base a los resulatdos (gráficas) obtenidos,
se puede apreciar algunos errores los cuales se
pudieron presentar en el desarrollo de la
práctica, en relación a las mediciones a partir
de la percepción del color, es decir, que el
matraz que no tenía catalasa se hubiera pasado
en la coloración.
CONCLUSIONES
Se encontró que el pH que proporciona las
condiciones para obtener mayor actividad
enzimática es cuando esta aproximadamente
en 7,0 puesto que en la gráfica 4 se puede ver
que la catalasa tuvo mayor velocidad de
reacción en ese pH. Si la velocidad aumenta la
diferencia (aumento constante) entre los
volumenes cada vez debe ir aumentando. Las
gráficas de tiempo y de pH se adecuan a la
representación cinética de Michaelis-Menten
(dando una media parábola), mientras que las
de concentración de sustrato (peróxido) y
temperatura no; debido a que la existencia de
varios productos intermediarios evita que la
reacción sea constante.
REFERENCIAS
Biología, B. (2019). Factores que afectan la
actividad enzimática. Blog de Biología.
Castro J. ( 2014). Cómo funcionan las
enzimas. Live Science.
Céspedez Miranda E.M., Hernández Lantigua
I., Llópiz Janer N. 2011. Instituto de Ciencias
Básicas y Preclínicas “Victoria de Girón”
Enzimas que participan como barreras
fisiológicas para eliminar los radicales libres:
II. Catalasa.
Frey, PA, y Hegeman, AD (2007).
Mecanismos de reacción enzimática . Prensa
de la Universidad de Oxford.
Montanchez. W. (2011). Efecto de pH y
temperatura sobre la actividad de la catalasa.
McDowall, J. (2004). Catalasa. European
Bioinformatic institute. [GB]
OpenStax.(2017). Las enzimas y el sitio
activo. Khan Academy.
Pérez, J. M., & Borge, M. J. N.
(2019).Fisiología general. Universidad de
Cantabria (UC), Open Course Ware.
Robinson PK (2015). Enzimas: principios y
aplicaciones biotecnológicas.Ensayos en
bioquímica , 59 , 1-41.
Science in Motion (ASIM) (2015) .El efecto
de la concentración del sustrato en la acción
enzimática, Alabama: l1aezcn. 1-5.