I.

SURSE DE COLAGEN

Colagenul se întâlneşte aproape în tot corpul mamiferelor: în piele și tendoane. Deşi sunt
primele folosite pentru extragerea tipului de collagen I, iar ţesuturile cartilaginoase sunt folosite
pentru extragerea colagenului de tip II, acest lucru se explică datorită abundenţei la nivelul
acestor ţesuturi. Aripile, solzii, oasele si deșeurile materiale din industria peștelui au fost și
ele utilizate pentru extragerea colagenului. Diferite metode (sarea neutră, alcalină, acidă și
enzime) au fost investigate de-a lungul anilor pentru a izola și purifica variate tipuri și cantitatea
de colagen din diferite ţesuturi și specii, fiind preferate metodele ce utilizează acizii și extracţiile
enzimatice [1].
Aceste enzime proteolitice abordate sunt folosite pentru a cliva legăturile reticulate
adiţionale și pentru a solubiliza sau extrage mai mult colagen [1]. Eficienţa tratamentului cu
enzime apare datorită separării selective a telopeptidelor nonhelicale cu N și C terminal care
permit separarea helixurilor intacte esenţiale, doar dacă molecula de colagen este parţial nepliată,
ruptă sau topită.
În ciuda avantajelor obţinute din procedeele de extracţie și purificare, colagenul rămâne un
biopolimer derivat de la animale și din acest motiv se pune problema transmiterii bolilor între
specii. De exemplu, o îngrijorare recentă cu privire la transmiterea encefalopatiei spongiforme la
bovine peste bariera speciilor s-a dovedit a fi un dezavantaj semnificativ în cadrul fabricării
biomaterialelor derivate de la bovine în ciuda statisticilor cu privire la transmiterea bolilor la
oameni. Din acest motiv colagenul, peptidele sintetice și colagenul uman recombinat au fost
investigate pe timpul fabricării.
Sintetizarea peptidelor sintetice imitând structural, biologic și mecanic proprietăţile
colagenului nativ au fost subiectul câtorva cercetări de zeci de ani. Constituientul de bază a
colagenului helical este repetarea triplului helix, a secvenţei glicină-X-Y,unde X este deobicei
Pro și Y este frecvent hydroxiprolină (Hyp) [2].
Datele au arătat că sunt necesare cinci triple pentru a forma un triplu helix și din acest
motiv 5-15 triple sunt frecvent folosite pentru a mima structura primară și terţiară al colagenului.
Câteva secvenţe au fost investigate de-a lungul anilor, inclusiv un sistem al unei peptide
sintetice capabilă de a se auto-asambla întro fibră de colagen, ca structură elicoidală
homotrimerică cu o perioadă bine definită evidenţiată prin microscopie electronică de

1
transmitere. Studiile utilizând peptidele colagenului-biomimetic au furnizat informaţii preţioase
în fiziologie și patologie.
În ciuda semnificativilor pași realizaţi, cât şi a anilor recenţi din medicină și nanotehnologie
folosind colagenul sintetic, încă este foarte dificil să mimăm structura ordinului superior
supramolecular de colagen nativ.
Utilizarea de celule modificate genetic, microorganisme, animale și plante se dovedea a fi
o tehnologie de cost scăzută și reproductibilă pentru producerea de colagen uman recombinat
care evită problemele legate cu variaţiile dintre grupuri, transmiterea bolilor între specii și unui
posibil raspuns imnun xenogen indus de colagenul de extracţie animală [3]. Câteva procede
precum transfectarea celulelor mamiferelor, celulelor insectelor, drojdii, bacterii, șoareci
transgenici, plante transgenice precum tabacul, porumbul și a viermilor de mătase au fost folosite
cu succes pentru a produce procolagenul recombinat uman.
Totuși, expresia moleculelor deplin funcţionale a fost dificilă datorită complexului natural
de sintetizare a procolagenului.
În plus, în toate cazurile nivelul de expresie a procolagenului a fost scăzut variind de la 15
mg/ml pentru cultura de celulele a mamiferelor și a drojdiei, la 60mg/ml în baculovirus și prin
urmare limitarea comarcializării unui potenţial larg. În plus, în timp ce recombinarea colagenului
a fost exprimată într-o formă termostabilă, triplu elicoidală, le lipsesc domenii specifice de altfel
prezente în fibrele de colagen native care mai mult compromite funcţia lor biologică și reduce
utilizarea lor.
Recent s-a dezvoltat o abordare care implică depunerea in vitro a unui volum mare de
colagen de la liniile de fibrinogen de celule umane, sub stare de aglomerare macromoleculară
care implică adăugarea de macromolecule în mediile de cultură.
Abordarea principală este bazată pe faptul că depunerea unei matrice de colagen depinde de
conversia unei noi sinteze de procolagen la colagen în spaţiul extracelular, sau imediat inainte de
a fi eliberat în aceeaşi etapă determinantă de viteza de depunere de colagen, fiind conversia
proteolitică a procolagenului la colagen. Acest pas este catalizat de procolagen C-proteinaza și
modificarea proteolitică a regulatorului alosteric. Recent s-a demonstrat că acest pas cheie poate
fi accelerat dramatic în prezenţa unei mari concentraţii de macromolecule cum ar fi sulfonat de
polistiren, sulfatul de dextran în mediul de cultură [4].

2
 De fapt, sub condiţia de non-aglomerare, fibroblastele pulmonare produc aproximativ
6x10⁵ lanţuri de colagen pe oră, pe celulă, în timp ce sistemul permite aglomerarea de la 10 până
la 30 de ori mai mult colagen depus. Pentru a promova creșterea producţiei de colagen, creșterea
transformarii factorului –beta a fost folosit, care s-a dovedit a spori și mai mult depunere de
colagen de tip I in vitro în condiții de aglomerare și non-aglomerare.
De asemenea s-a arătat, în cultura de fibroblast, că factorul fibrogenic poate cauza o mărire
de la trei la șase a ratei de sintetizare a colagenului de tip I prin stimularea transcripţiei genelor
de procolagen de tip I [5].
S-a demonstrat că acest agent acționează prin modularea sintezei macromoleculelor
specifice, în proporţie mai mare decât s-ar acţiona printr-o creștere generală a metabolismului
celular și a proliferării.

3
 II. COLAGENUL-CARACTERISTICI GENERALE

Colagenul reprezintă principalul material structural al vertebratelor și este cea mai

abundentă proteină la mamifere constituie 20-30% din totalul proteinelor din corp [6].
Aproximativ jumătate din totalul colagenului din corp se regăsește în piele, unde aproximativ
70% este în derm și tendoane. Acesta este prezent încă din stadiul incipient al evoluției la
animale primitive precum: meduze, corali, anemone de mare.
Colagenul este sintetizat din fibroblaste care de obicei provin din celulele endoplaste.
Structura moleculară a colagenului a fost stabilită prin studierea compoziției
aminoacizilor, prin analiza difracției cu raze X, prin examinarea microscopică a electronului și
examinarea fizico-chimică a soluțiilor.
Molecula de colagen este formată din trei lanțuri de polipeptide răsucite unul după altul
precum trei frânghii răsucite, iar fiecare lanț are o răsucire proprie în direcții opuse. Acesta are
structura, dimensiunea și secvența de aminoacizi unică.
Conținutul crescut de glicină și de reziduuri de aminoacizi afectează compusul în formă de
helix. Răsucirile sunt legate prin punți de hidrogen între gruparea –CO și –NH2 dar și de legături
covalente.
Molecula de colagen are o lungime și o lățime de aproximativ 3000 respectiv 15 Å și masă
moleculară de aproximativ 300 Kda [7].
Exista 28 de tipuri diferite de colagen, cu structuri si funcții variate, însă caracteristica
principala comună este faptul că toate sunt puternice și flexibile. Dintre acestea, cele mai comune
sunt tipurile I, II, III si IV. Tipul I este cel mai flexibil dintre toate si este secretat in piele,
tendoane si oase. Tipul II e regasit in cartilaje, tipul III in piele si vasele de sange, iar tipul IV in
țesuturile membranoase. Tipurile I, II, III, V și XI sunt constituite din trei lanțuri, iar acestea la
rândul lor din structuri continue triplu helicale. Tipurile I, II, III și V sunt numite forme de fibre
de colagen și au secțiuni mari de secvențe omoloage independente de specie.
Colagenul este sintetizat de o varietate de celule mezenchimale și epiteliale.
Toți membrii din familia colagenului au în comun o secvență unică numită [Gly-X-Y]n,
unde pozițiile lui X și Y sunt des ocupate de prolină (Pro) și hidroxiprolină (Hyp). Aceasta din

4
urmă prezintă o modificare postranslațională care apare intracelular și este dependentă de
vitamina C. Această structură primară unică este transformată întro structură secundară unică,
colagen cu lanțuri α. Nu trebuie confundată cu α helixurile de la o proteină normală ce este o
structură stabilizată de punți de hidrogen. Aceste punți de hidrogen -C=O: -H-N apar între
carbonii α ale aminoacizilor (figura 1). In starea naturala, pielea contine 75-80% apa, aceasta
separand elementele structurale, in principal prin legaturi reversibile de hidrogen formate la
nivelul -helixului si triplu helixului (intra si intermoleculare). Legatura de hidrogen de tipul
H···OH formata de o molecula de apa cu alta molecula de apa sau direct la grupele reactive din
catena polipeptidica, stabilizeaza structura moleculei de colagen, iar la nivelul fibrilelor si
fibrelor tesutului intermediaza reactii reversibile in mediul „apos biologic”.

Figura 1. Secvențe de aminoacizi din structura colagenului. Evidențierea legăturile de hidrogen

între lanțurile de aminoacizi precum și între aminoacizi și moleculele de apă

Structura terțiară (figura 2) este unică și este reprezentată de asocierea a trei lanțuri α
formând un triplu helix. Cele trei lanțuri α de prolină sunt strâns răsucite una după alta ce
formează trei tije strâns legate de molecule cu resturi de glicil ce reprezintă centrul moleculei.

5
Din acest motiv secvenţa Gly-X-Y, care se repetă, mai este numită și domeniu triplu helical, așa
cum sunt predictori pentru formarea structurii unice cuaternare. Studiile privind precipitarea
colagenului din solutii coloidale (geluri) au adus contributii importante la stabilirea
mecanismului de agregare (polimerizare) a macromoleculelor de colagen in fibrile. Procesul
implica doua etape:
agregarea unidirectionala cap-cap a moleculelor (macromoleculelor) printr-un
proces de polimerizare liniara, ducand la aparitia „protofibrilelor”, structuri cu
diametrul de 15 Å si lungime variabila;
agregarea laterala a protofibrilelor, determinand aparitia fibrilelor, fibrelor si
fasciculelor de fibre. Fibrilele au diametre uniforme ce variaza in diferite tesuturi,
a caror stadii de dezvoltare pot fi cuprinse intre 50Å si 2000Å

Figura 2. Structura terțiară a colagenului (triplu helix cu înfășurare de la dreapta spre stânga)

Colagenul are aspectul unei rețele de fibre și diferă de proteinele obișnuite prin faptul că
are in compozitie o mai mare concentratie de anumiti aminoacizi. Aproape o treime din colagen
este compus din glicina, cel mai mic aminoacid și o altă treime este formată din prolina și
hidroxiprolina, forma activă a prolinei. Forma foarte mica a glicinei impreuna cu proprietatile
prolinei ii dau colagenului forma unică a unei elice triple. O mica porțiune dintr-un aminoacid
numit lisina (si hidroxilisina) compun de asemenea colagenul. Restul structurii este formata din
alti diferiti aminoacizi printre care si arginina sau L-arginina [8].
Prezența colagenului în organism este esentială pentru vindecarea rănilor ușoare ale pielii
dar și a rănilor din diferite țesuturi, pentru repararea cartilagiilor, ligamentelor și oaselor,
incluzand chiar și degenerari dentare.

6
 Colagenul dă pielii rezistenta structurala, elasticitate și durabilitate. El este resposabil
pentru felul în care arata pielea. Colagenul de tip III face pielea pliabilă în timp ce cel de tipul I îi
dă pielii fermitate. Absența sau scăderea nivelului acestuia din piele duce la formarea ridurilor
care acompaniază varsta. O reducere considerabilă a producției de colagen apare după
menopauză și se consideră că până la vârsta de 40 ani sinteza de colagen scade cu 25%, iar până
la 60 ani poate atinge o scădere de aproape 50% [9]. Modificările datorate scăderii conținutului
de colagen de la nivelul dermului sunt redate în figura 3.

Figura 3. Evoluția structurii pielii o dată cu înaintarea în vârstă

Avantajele colagenului constau în:

extragerea facilă din surse naturale;

nonantigenic;
biodegradabil și bioabsorbabil;
netoxic și biocompatibil;
prezintă sinergism cu componentele bioactive, hemostatic;
biodegradabilitatea poate fi controlată cu ajutorul sistemului reticulat;
compatibilitate cu polimerii sintetici.

7
 Principalele dezavantaje ale colagenului sunt:

prețul de cost crescut pentru tipul I de colagen;

variabilitatea colagenului izolat;
hidrofilia care conduce la o eliberare rapidă, efecte secundare ca encefalopatia la
bovine și mineralizarea.

Colagenul, de altfel este ușor absorbabil în corp și prezintă antigenitate slabă, are rezistență
mecanică și afinitate față de apă, dar mai mult decât atât este netoxic, biocompatibil și
biodegradabil [10].
Acesta poate fi dizolvat în soluții apoase, în special în soluții apoase acide și este relativ
stabil datorită structurii primare de proteină din corp, însă este expus degradării colagenolitice de
către enzime precum colagenaza. Aceasta se leagă strâns de triplul helix și degradează colagenul
de la suprafață.
Profilul de topire al colagenului solubilizat de pepsină a arătat o tranziție bifazică,
demonstrând astfel scăderea stabilității termice odată cu vârsta, lucru esențial pentru rezistență
mecanică și fixarea colagenului din oase [11].
Reacțiile adverse au apărut în urma chirurgiei plastice prin utilizarea de implanturi de
colagen și a materialelor de sutură din catgut și s-au manifestat prin roșeață și protuberanță la
nivelul zonelor respective.
Reacțiile adverse au fost rare, însă s-au semnalat două cazuri de reacții alergice pentru
colagenul de bovină [12]. Ambii pacienți au prezentat conjunctivită în urma aplicației locale în
cadrul chirurgiei oftalmice.
Efectele iritante și citotoxicitatea colagenului exogen au apărut la scurt timp după ce
materialul a intrat în contact cu țesutul, ducând la o inflamație rapidă și locală ca răspuns, a cărui
intensitate depinde de forma farmaceutică folosită.
Cu toate acestea deși efecte adverse necunoscute vor putea fi descoperite în aplicațiile
colagenului, dezvoltarea și evaluarea acestuia încă continuă.

8
 III-BIOSINTEZA COLAGENULUI

Acest proces presupune parcurgerea a 10 etape ce se succed într-o secvenţă bine ordonată
şi care permit trecerea de la aminoacizi liberi la fibrila de colagen. Aceste etape sunt:
asamblarea aminoacizilor;
hidroxilarea unor resturi de prolină (prolil) şi de lizină (lizil);
formarea helixului;
glicozilarea;
expulzarea din celulă;
transportul la fibrila în creştere;
transformarea procolagenului în colagen;
formarea aldehidelor;
formarea fibrilei;
stabilirea legăturilor încrucişate .
Unirea aminoacizilor are loc în fibroblaşti, trecându-se prin aceleaşi etape prin care se
biosintetizează toate proteinele. Este caracteristic însă faptul că printre aminoacizii constituitivi
predomină glicina (33%) reprezentând fiecare al treilea rest aminoacidic (X-Y-Gli)n [8,12]. Într-o
măsură mai mică (23%) se află prolina iar într-o proporţie şi mai redusă se găsesc doi aminoacizi
atipici:
 hidroxiprolina
 hidroxilizina:
Aceşti doi aminoacizi atipici provin din prolină şi lizină iar hidroxilarea lor se face în
prezenţa anumitor enzime (prolilhidroxilaza şi lizilhidroxilaza). În ceea ce priveşte
prolilhidroxilaza, s-a dovedit că pentru a fi activă enzima necesită prezenţa oxigenului molecular,
a ionilor Fe2+ şi a vitaminei C (Întreg acest sistem funcţionează prin cuplare cu oxidarea α-
cetoglutaratului la succinat). Se înţelege, în aceste condiţii,că deficienţa vitaminei C afectează
hidroxilarea şi-prin urmare-obţinerea unui colagen normal (Figura 3).

9
 Figura 3. Rolul acidului ascorbic în sinteza de colagen

Procesul de asamblarea al aminoacizilor decurge rapid- 200 aminoacizi/minut.Aceasta

înseamnă că biosinteza unei catene de 1000-1100 aminoacizi are loc în 5-6 minute.
Lanţurile polipeptidice rezultate iau conformaţia elicei şi de aceea, se numesc lanţuri α.
Deoarece secvenţele de aminoacizi şi hidroxilările la nivelul la nivelul resturilor prolil sau lizil
nu sunt identice în toate lanţurile polipeptidice,se constitue-în genere-două feluri de lanţuri α
numite respectiv-lanţuri α1 (cu variantele I,II,III,IV) şi lanţuri α2.Acestea sunt totuşi omoloage
fiind formate din circa 1050 resturi de aminoacizi şi având în multe poziţii secvenţe identice.
Lanţurile α au masa de 90-95 kdaltoni [13].
În organismele superioare (specii de vertebrate evoluate) s-au evidenţiat - până în prezent –
11 tipuri de colagen şi nu este exclus să se mai descopere în alte tipuri.
Tipurile de colagen cunoscute actualmente se deosebesc prin structura lor la nivel
molecular:fie din cauza modificărilor survenite în procesele care au loc după translaţiile intra – şi
extracelulare în cursul biosintezei, fie datorită diverselor asamblări şi organizări posibile a
moleculelor în structurile supramoleculare.
Cele 11 tipuri de colagen cunoscute, caracteristicile lor structurale şi principalele surse de
extracţie sunt menţionate în tabelul 1:

10
 Tabel 1: Tipurile principale de colagen

Tipul Nr.lanţurilor Lanţuri Masa Distribuţia tisulară

colagenic distincte distincte lanţurilor
(kD)
Tip I 2 α1 (I) 95 Piele,tendon,os,cornee
1 α2 (I) 95
Tip II 1 α1 (II) 95 Cartilaj,disc intervertebral,corp vitros
Tip III 1 α1 (III) 95 Piele fetală,sistem cardiovascular
Tip IV 2 α1 (IV) 170- Membrana bazală
1 α2 (IV) 185
Tip V 3 α1 (V) 130- Aceleaşi ţesuturi ca la tipul I,dar în
α2 (V) 200 cantităţi mult mai mici
α3 (V)
Tip VI 3 α1 (VI) 140- Vilozităţi placentare
α2 (VI) 240
α3 (VI)
Tip VII α1 (VII) 170 Membrane placentare
Tip VIII 1 α1 (VIII) ~150 Celule endoteliale

Tip IX 3 α1 (IX) 85 Cartilaj hialin

α2 (IX)
α3 (IX)
Tip X 1 α1 (X) 59 Cartilaj hialin
Tip XI 3 α1 (XI) ~100 Cartilaj hialin
α2 (XI)
α3 (XI)

Colagenul aflat în stadiu de formare intracelulară se numeşte procolagen . Expulzarea lui

din fibroblast are loc printr-un mecanism încă necunoscut.
În spaţiul extracelular procolagenul pierde unele resturi peptidice , neîmpletite ,de la
capătul N-terminal al lanţurilor care cuprind porţiuni cu 20 resturi de aminoacizi (telopeptide).
Îndepărtarea acestor resturi de aminoacizi are loc sub acţiunea hidrolizantă a procolagen
– peptidazei.

11
 Formarea legăturilor încrucişate din microfibrile necesită parcurgerea următoarelor 4
categorii de procese extracelulare:
oxidarea unor resturi de lizină şi hidroxilizină la aldehidele corespunzătoare (alizină şi
hidroxializină ) sub acţiunea enzimei numită colagen-lizin oxidaza care este inactivă faţă
de aminoacii respectivi când se află în stare liberă;
condensarea aldehidelor formate cu resturi de lizină conducând la bazele Schiff
corespunzătoare;
condensări (aldolică şi crotonică) a două resturi de aldehidă;
condensarea, de tip crotonic, aldehidei cu resturi de histidină
Datorită acestor legături încrucişate inter- şi intramoleculare, fibrilele de colagen capătă o
mare rezistenţă mecanică. Este de remarcat că odată cu înaintarea în vârstă numărul legăturilor
încrucişate creşte. Pe de altă parte, diversele tipuri de colagen (Tabel 1) se deosebesc între ele şi
prin numărul legăturilor încrucişate precum şi prin grosimea fibrelor. Astfel, colagenul de tip I
este constituit din fibre mai groase care au un conţinut mai redus de hidroxilizină şi glucide [13].
Mai multe microfibrile de colagen, vizibile numai la microscopul electronic, se asociază
constituind fibrele de colagen, vizibile la microscopul optic. În fond, din punct de vedere al
compoziţiei şi structurii sale, fibrila de colagen este produsul final al unei agregări proprii – bine
cunoscute şi controlate – de aminoacizi dispuşi în anumite secvenţe (figura 4).

Figura 4. Structura colagenului-preparat histologic privit la microscop

12
 IV-DEGRADAREA COLAGENULUI

Colagenul izolat din diverse ţesuturi se reînnoieşte în perioade variabile de timp, în funcţie
de organul căruia aparţine. Acest proces se numește colagenoliză. Astfel, studiile cu izotopi
radioactivi – făcute pe şobolani – au dovedit că timpul de înjumătăţire al colagenului din piele
este de 200 zile, al celui din muşchi de 60 zile şi al celui din ficat de 30 zile. Se cunosc şi situaţii
în care colagenul se degradează şi se reînnoieşte mult mai repede; spre exemplu, în involuţia
uterului după naştere şi în vindecarea rănilor. Indiferent de ritmul de reînnoire, în procesele
fiziologice normale există un echilibru foarte bine păstrat între biosinteza colagenului şi
degradarea lui. Această degradare se mai numeşte colagenoliză şi are loc sub acţiunea unor
enzime hidrolitice numite colagenaze. Colagenazele sunt secretate de către celulele ţesutului
conjuctiv sub formă inactivă, de procolagenaze. În mediul extracelular ele sunt activate şi îşi
exercită acţiunea hidrolitică [14].
În urma intervenţiei colagenazelor, din colagen rezultă peptide cuprinzând hidroxiprolina
sau chiar hidroxiprolină liber (figura 5). Hidroxiprolina nu poate fi reutilizată pentru biosinteza
de colagen. De aceea, este luată de sânge (devenind un component al plasmei) şi dusă la ficat
unde este degradată .O parte din hidroxiprolina plasmatică se elimină prin urină.

Figura 5. Procesul de colagenoliza

Pentru motivul că toate procesele degradative ale colagenului au loc cu intervenţia

colagenazelor iar în urma acţiunii lor se eliberează hidroxiprolină,dozarea acestui aminoacid în
plasmă şi în urină are rol de diagnostic. Într-adevăr, nivelul crescut al hidroxiprolinei libere în
plasmă sau a celei urinare este adesea un indicator preţios pentru aprecierea diverselor stări
patologice însoţite de colagenolize (hiperparatiroidism primar ,unele boli osoase).

13
 V- OBȚINEREA COLAGENULUI

Colagenul se obține prin extracție din surse naturale, cea mai des întâlnită fiind pielea
animalelor. Biotehnologiile de obținere ale colagenului includ:
tratamente alcaline
tratamente acide
tratamente enzimatice
tratament combinate

Etapele de obținere cuprind:

 pretratarea pielii prin demineralizare și deproteinizare
 extracția colagenului solubil
 filtrarea amestecului
 precipitarea colagenului
 centrifugarea
 reticularea
Două metode de extracție a colagenului sunt redate de cercetătorii Singh et al. [15] după cum
urmează:

Metoda 1 (extracție acidă)

Pielea de pește este degresată cu alcool butilic 10% cu un raport solid/solvent de 1:10 (g /
v) timp de 48 ore și solventul este înlocuit la fiecare 8 ore. Pielea degresată a fost spălată
cu apă rece (5-8 ° C), urmată de adăugare 0,5 M acid acetic cu un raport solid/solvent de
1:15 (g / v) timp de 24 de ore. Amestecul a fost filtrat, iar colagenul a fost precipitat prin
adăugare NaCl până la o concentrație finală de 2,6 M în prezență de 0,05 M tris-
hidroximetil-aminometan, pH 7,0. Preparatul a fost separat prin centrifugare, iar apoi
liofilizat.

14
Metoda 2 (extracție enzimatică)
Reziduul nedizolvat obținut după extracția prim metoda 1 a fost utilizat pentru extracție
enizmatică. Reziduul a fost dizolvat în 0,5 M acid acetic cu un raport solid/solvent de
1:15 (greutate/ volum) și pepsină porcină (20 UI/g). Amestecul a fost agitat continuu la 4
°C timp de 48 de ore, urmată de filtrare. Filtratul a fost supus precipitării și apoi a fost
liofilizat.

(a) (b)

Figura 6. Colagen obținut prin extracție cu acid clorhidric (a) și acid acetic (b)

15
 VI-METODE DE CARACTERIZARE ALE COLAGENULUI [16,17]

a. Proprietăți fizico-chimice

Colagenul sub toate formele sale caracteristice se prezintă ca un polimer care se

individualizează prin hidrofilie accentuata, caracter ionic variabil şi functionalitate diversă,
putând fi implicat intr-un mare numar de sisteme de interactiuni cu alte componente micro sau
macromoleculare. Stabilitatea structurii colagenului este asigurată de multitudinea de legături
stabile: covalente, electrovalente, legaturi de hidrogen şi legaturi hidrofobe.
Comportarea mecanica, fizico-chimică şi chimică a colagenului se datorează dualismului
structurii sale, cristaline şi amorfe, prezentand atat proprietatile cristalelor, cat şi ale gelurilor.
Stabilitatea relativa a colagenului (dimensionala, biologica, chimica etc.) este atribuită
proprietatilor cristaline, iar cele clasice de flexibilitate, reactivitate etc. proprietăţilor particulelor
amorfe polare. Datorita coexistentei ambelor structuri, se poate tana (tabaci) pielea animala şi
obtine o gama larga de sortimente de piele finisată. La caracteristicile specifice pielii tăbăcite
concură şi proprietatile colagenului de coloid fibrilar şi structura sa histologică specifică.
Așadar, colagenul poate exista atât în stare de gel, cat şi în stare de sol. In stare dizolvată
nu difuzează prin membrane semipermeabile, întrucat particulele au marimi mai mici de 1 m,
deci prezinta dimensiunile starii coloidale. Particulele coloidale pot fi formate din
macromolecule sau agregate moleculare colagenice, faza incipientă în formarea colagenului
insolubil.
Starea coloidala a colagenului in solutie îi conferă toate proprietățile fizico-chimice
caracteristice sistemelor coloidale: presiune osmotică mică, capacitate de difuzie scazută,
tensioactivitate, etc. Datorită caracterului coloidal, repartitia ionilor din solutie prin membrane
semipermeabile va fi influentată de echilibru de membrana Donnan.
Un rol important in structura moleculei de colagen îl are apa care face parte integrantă
din aceasta, formand un sistem de tip „cluster”. Absorbția apei este atribuită grupelor polare
specifice –NH2 şi –COOH din catena laterala, sau –CO–NH– din catena principala.
Colagenul este un produs amfoter datorită grupelor bazice şi acide din catenele lanturilor
polipeptidice. Un rol deosebit îl au grupele aminice şi carboxilice. Grupa amidică din lanțul

16
polipeptidic şi grupele hidroxilice ale catenelor laterale au o însemnatate redusă asupra
caracterului amfoter. Prin introducerea colagenului in mediu alcalin sau acid se constata o
tendință puternică de pătrundere a apei. Are loc umflarea, care este determinată de pH-ul
sistemului şi de capacitatea de combinare a colagenului cu acizi sau baze.
Pe langa apa care se gasește la pH-ul izoelectric, cu cresterea sau scaderea pH-ului,
colagenul se imbogateste in sarcini negative sau pozitive şi din aceasta cauza, datorita efectelor
osmotice, cantitatea de apa creste.Acest tip de umflare se realizeaza prin modificarea pH-ului la
intensități ionice diferite şi temperaturi joase şi constante. Cantitatea de apa absorbită de piele în
regiunile extreme ale pH-ului, este determinată de doi factori contrari: forțele osmotice care tind
sa patrunda in piele şi fortele de coeziune reprezentate prin insăși structura supramoleculară a
colagenului, care se opun absorbției.

b. Comportamentul colagenului la temperatură

Influenta temperaturii asupra colagenului se manifesta la o anumită valoare prin

fenomenul de contracție. Temperatura la care are loc contracția se numește temperatura de
contractie (Tc) şi este specifica diferitelor materiale colagenice. La contractia colagenului, forțele
moleculare devin mai mari decat fortele intermoleculare. Contracția nu are loc brusc la o
temperatura dată, ci este un proces lent care progresează în timp, pe masura desfacerii legăturilor
intermoleculare.
Astfel, la pielea „gelatina” (piele bruta tratata cu alcalii) supusă încălzirii la 58-65°C, se
observă deformarea fibrelor de colagen şi scurtarea lor cu o treime din lungime, volumul lor
crescand. Se produce fenomenul de contracție, iar colagenul capată vascozitatea şi elasticitatea
asemanatoare cauciucului.
Cresterea elasticității colagenului în urma contracției se datorează distrugerii unei bune
parți din legaturile prin care moleculele colagenice sunt orientate în structuri polimerice –
protofibrile, fibrile, sau ghem - mai stabile termodinamic. Dupa ruperea acestor legaturi,
moleculele capata forma sinusoidală.
La temperaturi ridicate colagenul se distruge usor şi nu se poate realiza topirea sa înainte
de degradare. Temperatura de topire a colagenului deshidratat se apreciază după temperatura de
topire a aminoacizilor care sunt cristalini, precum şi după cea a materialelor fibroase sintetice de
tipul poliamidelor.

17
 Ruperea legaturilor intermoleculare se poate realiza prin topire sau prin dizolvare. Teoria
solutiilor arată că temperatura de topire a oricarei substante poate fi redusă dacă poate fi drept
solvent pentru un alt compus. Colagenul poate fi considerat un „mediu solvent” pentru apa care
pătrunde în el în acest proces de umflare. Prin creșterea gradului de umflare al colagenului,
temperatura de contractie scade, iar prin deshidratare crește. Structura complexă a colagenului
face ca procesul de contracție sa fie ireversibil, spre deosebire de topirea substantelor cristaline
obișnuite în care s-au dizolvat diferite substanțe.

c. Proprietățile mecanice ale colagenului

Comportarea mecanică şi fizico-chimică a colagenului se datorează dualismului structurii

sale, cristaline şi amorfe, cumuland proprietatile cristalelor şi gelurilor. Colagenul este o
proteina fibroasă, care in tesuturi calcifiate actionează ca nucleu pentru depozitarea sării, iar in
tesuturile moi acționeaza ca „schelet” care susține țesutul şi dă rezistență față de forțele mecanice
externe.
Proprietatile sale mecanice cuprind elasticitatea, vascozitatea şi plasticitatea. De
asemenea el reacționează la diferite necesități functionale, fapt demonstrat cu exactitate pentru
tractul reproductiv feminin în timpul sarcinii şi în faza de recuperare postnatală.
În dermul pielii rețeaua de colagen este mai densă şi mai complicată decat cea din
membranele bazale; este o țesatura compactă tridimensională. Zona de limitare fața de țesutul
subcutanat nu este o linie ferma, fibrele continuându-se în tot tesutul, astfel încat aranjamentul
fibrelor devine din ce in ce mai lax. Direcția predominantă a fibrei este paralelă cu suprafața, dar
manunchiurile de fibre perpendiculare sunt destul de frecvente şi tind sa creasca cantitativ, cu cat
pielea este mai groasa. Elasticitatea pielii este favorizata şi de continutul de 4% elastina.
Comportarea la forfecare a fost studiata pentru a determina anumite proprietati mecanice
legate de functia de protectie a pielii. Acest fapt poate fi demonstrat intepand pielea cu un ac
ascutit, rotund şi gros. Rezultatul nu este o gaura rotunda, ci o crapatura a carei directii poate
varia in functie de regiunea de piele aleasa. Acelaşi fenomen este prezent cand se produc incizii,
marginile celor taiate in unghi drept cu directia despicaturii tinzand sa se traga inapoi mai mult
decat cele taiate paralel cu ea.
Colagenul nu este o proteină inertă şi imobilă chiar şi in forma matura şi “insolubila”. El
reacționează la diferiți stimuli, in special la organismele tinere, înca în crestere. Colagenul

18
reactioneaza la trauma şi tensionare nu numai în locul traumatizat sau tensionat, ci în intreg
organismul, chiar şi la indivizii în varsta, atat din punct de vedere chimic (schimbare de
entropie), cat şi din punctul de vedere al proprietăților mecanice.
Cu varsta, colagenul sufera schimbari succesive foarte asemănătoare de la individ la
individ şi de la o specie de mamifere la alta. Schimbarile cuprind o creștere succesivă de colagen
care devine mai strict organizat prin contributia legaturilor inter- şi intramoleculare. La
majoritatea speciilor această dezvoltare este considerabil incetinită dupa ce se atinge maturitatea
scheletului şi cea sexuală.
Pretensionarea diferitelor elemente colagenice este prezenta la anumite țesuturi așa cum
sunt pielea, tendonul, cartilajul din discul intervertebral. In cazul pielii, comportarea mecanică
este mai complicata datorita geometriei 3D specifice arhitecturii colagenului.
Pentru a identifica tipul de colagen izolat cel mai des se utilizează gel-electroforeza
pentru a separa proteinele constituiente pe gel de poliacrilamidă, urmată de colorarea cu azo
colorant amido-black sau imunoblotare cu anticorpi anti-colagen tip I,II,II,IV [15] (figura 7).

Figura 7. Identificarea tipului de colagen prin tehnica de electroforeză pe gel de

poliacrilamidă și lauril sulfat de sodiu

19
 VII- UTILIZĂRILE COLAGENULUI

1. In dermatocosmetică

Colagenul menține structura calitativă a pielii şi îmbunatațeste starea epidermei. Având

beneficii în mentinerea structurii calitative şi a elasticității pielii, dar şi cu un rol activ în
tonifierea acesteia, colagenul are proprietati hidratante şi împiedica aparitia ridurilor sau chiar le
diminueaza pe cele deja existente. Are un rol important în regenerare și contribuie la cicatrizarea
rapidă a leziunilor de la nivelul dermului. Colagenul exogen, respectiv cremele şi suplimentele
alimentare cu colagen sunt recomandate pentru pielea uscată şi pentru cea matură şi îi conferă
flexibilitate şi luminozitate.
Colagenul s-a dovedit benefic şi în tratamentele antiacneice, deoarece ajuta la cicatrizarea
rapida şi eficienta a semnelor şi la vindecarea pielii, stimulând celulele să se regenereze. Tot
datorită rolului de regenerare celulara, colagenul poate diminua afecțiuni ale pielii precum
edemele şi eritemele. Contribuie la reducerea petelor pigmentare de pe fata, maini şi decolteu,
datorate expunerii la soare sau varstei înaintate. Cremele ce contin colagen sunt indicate şi pentru
o piele sensibilă, cu tendinta de înrosire. Tot in componența cremelor dermatocosmetice este
eficace împotriva primelor riduri de expresie [18,19].
Cele mai multe studii in vivo au arătat că suplimentele cu collagen tip I hidrolizat
administrate pe cale orală au efectele mai pronunțate asupra pielii decât aplicarea topică a
cremelor cu colagen [18].

Figura 8. Suplimente alimentare și preparate topice pe bază de colagen

20
 2. În regenerarea articulară

Colagenul are un rol împortant în refacerea cartilajelor şi totodată creste gradul de

lubrifiere, alaturi de acidul hialuronic, prin menținerea vascozitatii lichidului sinovial. Acesta
este o substanță fluidă produsă în mod natural în cavitățile articulațiilor sinoviale, al carei rol este
sa reducă fricțiunea dintre cartilajele articulare şi alte tesuturi articulare prin lubrifiere şi
amortizare în timpul mișcarii.
Colagenul contribuie la atenuarea inflamațiilor articulare, indeosebi a celor cauzate de
înaintarea în varsta şi are un rol esențial în prevenirea unor unor afectiuni precum artrita
reumatoida, artroza, osteoporoza, guta sau osteoartrita. Așadar, este o proteină importantă pentru
sanatatea şi buna funcționare a sistemului osteoarticular.
Pentru ca reprezintă 90% din structura ligamentelor, ale tendoanelor, ale fasciilor şi ale
articulațiilor, poate sprijini regenerarea celulelor acestora şi poate reduce durerile şi rigiditatea
asociate cu simptomele artritei. De asemenea, peptidele din colagen ajuta la cresterea mobilității
şi a flexibilității, precum şi la mineralizarea optimă a oaselor şi a dinților, respectiv la întarirea
scheletului osos. Pentru o absorbție intestinală optimă, se recomandă colagenul hidrolizat [20].

3. În domeniul farmaceutic și medical

3.1.Filme și inserte pe bază de colagen
Filmele, plasturii sau insertele de colagen au fost folosite pentru tratamentul țesuturilor
infectate precum infecția țesutului corneal sau a țesutului hepatic.
Principala aplicație a filmelor de colagen este cea de barieră sub formă de membrană.
Filmele cu grosimea de 0,01–0,5 mm și realizate din materiale biodegradabile, asigură o eliberare
prelungită a substanței medicamentoase [21].
Insertele oftalmice solubile sub formă de film au fost introduse pentru tratamentul țesutului
corneal infectat prin utilizarea de doze mari de antibiotice precum gentamicina sau tetraciclina.
Unele modificări ale filmelor, insertelor sau plasturilor au fost făcute pentru a controla
eliberarea substanței medicamentoase din forma farmaceutică. Filmele de colagen reticulate cu
formaldehidă au fost folosite cu succes ca forme farmaceutice implantabile, în vederea controlării

21
eliberării acetatului de medroxiprogesteron. Pentru controlul eliberării substanței
medicamentoase s-a atașat o altă membrană la filmul, insertul sau plasturele de colagen .

3.2.Bureții de colagen
Bureții de colagen (figura 9) au fost utili pentru tratarea arsurilor severe dar și pentru
variate tipuri de răni precum ulcerații la nivelul piciorului cât și în testarea in vitro.
Membrana de colagen uman a constituit o sursă majoră pentru bureții de colagen. Aceștia
au abilitatea de a absorbi ușor cantități mari de exudat tisular, aderă de rănile ude și protejează
împotriva rănilor mecanice și împotriva infecțiilor bacteriene.
Experimentele care utilizează implanturi de bureți au demonstrat o recuperare rapidă a pielii
ce prezintă arsuri prin infiltrarea intensă a neutrofilelor în burete. Stratul de burete de colagen cu
factor de creștere conduce la facilitarea vindecării rănilor dermice și epidermice [22].

Figura 9. Bureți de colagen: a) burete în stare hidratată; b) secțiune SEM (microscop

electronic).

3.3.Hidrogelurile pe bază de colagen

Hidrogelurile (figura 10) au fost des folosite pentru transportul substanței active datorită
siguranței și manipulării ușoare. Variate combinații de polimeri au fost formulate ca hidrogel
pentru a investiga potențialul lor ca forme farmaceutice.

22
 Figura 10. Hidrogel de colagen
a. stare hidratată; b. stare anhidră

Alcoolul polivinilic și acidul poliacrilic au fost combinate cu acidul hialuronic și colagen

pentru a crește puterea mecanică a polimerilor naturali. Această combinație a fost formulată ca
hidrogel, film, bureți și frecvent încărcată cu hormoni de creștere. Astfel s-a demonstrat că
hormonul de creștere poate fi eliberat de hidrogelul de alcool polivinilic cu colagen, iar rata de
eliberare cât și cantitatea este dependentă de cantitatea de colagen [23].

3.4.Utilizarea colagenului în grefele de piele

Implanturile de colagen au fost des folosite ca vehicule pentru transportul culturilor de
celule dermice sau în cadrul formelor de transport pentru înlocuirea pielii și în arsuri. De când
implanturile de bureți au fost utilizate pentru refacerea pielii, multe tipuri de piele artificială au
fost dezvoltate sub formă de burete.
Rănile cronice ale diabeticilor au fost vindecate cu ajutorul grefelor de piele (figura 11),
preparată din celule dermice. În cadrul culturilor de substituienți de piele, latexul de colagen a
fost utilizat ca suport pentru creșterea epitelială pentru înlocuirea pelii patologice [24].

Figura 11. Grefa de piele pe bază de colagen.

23
 3.5.Colagenul în bioingineria tisulară
Gelul de colagen folosit ca substituient al pielii umane, a condus la dezvoltarea
bioingineriei țesuturilor precum vasele sanguine, valvele inimii și ligamentele [25].

Dermatocosmetică

Bioinginerie Utilizările Grefe de piele,

regenerare
tisulară colagenului articulară

Hidrogeluri,
bureți de
colagen,
inserte

24
 BIBLIOGRAFIE

1. Zeugolis D.I., Paul R.G., Attenburrow G., J. Biomed. Mater. Res. A 2008; 86A: 892–904.
2. Melacini G., Bonvin A.M.J.J., Goodman M., Boelens R., Kaptein R., J. Mol. Biol. 2000; 300:
1041–1049.
3. Liu W., Merrett K., Griffith M. et al., Biomaterials 2008; 29: 1147–1158.
4. Lareu R.R., Subramhanya K.H., Peng Y. et al., FEBS Lett. 2007; 581: 2709–2714.
5. Hetzel M., Bachem M., Anders D., Trischler G., Faehling M., Lung 2005; 183: 225–237.
6. Miyata T., Taira T., Noishiki Y. Collagen engineering for biomaterial use. Clin. Mater 1992; 9
(3-4): 139-148.
7. Nimni M.E., Harness R.D. Molecular structures and functions of collagen. In: M. E. Nimni
editor. Collagen-Biochemitry, vol. I. FL: CRC Press, Boca Raton, 1988, 1-79.
8. Gelse K, Pöschl E, Aigner T. Collagens--structure, function, and biosynthesis. Adv Drug Deliv
Rev. 2003 Nov 28;55(12):1531-46.
9. Shoulders MD, Raines RT. Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem. 2009;78:929-
58
10. Friess W. Collagen-biomaterial for drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 1998; 45: 113-
136.
11. Danielsen C.C. Age-related thermal stability and susceptibility to proteolysis of rat bone
collagen. Biodem. J. 1990; 272: 697-601.
12. Mullins R.J., Richards C., Walker T. Allergic reactionos to oral, surgical and topical bovine
collagen. Anaphylactic risk for surgeons. Austr. New Zealand J. Ophthalmol. 1996; 24 (3): 257-
260.
13. Reiser KM. Collagen biosynthesis. Environ Health Perspect. 1984;55:169-77.
14. Last JA, Laurent GJ. Dynamic state of collagen: pathways of collagen degradation in
vivo and their possible role in regulation of collagen mass. Am J Physiol. 1987
Jan;252(1 Pt 1):C1-9.
15. Singh P, Soottawat B, Sajid M, Hideki K (2011) Isolation and characterisation of collagen
extracted from the skin of striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus). Food Chem 124:97–
105

25
16. http://www.scritub.com/stiinta/chimie/Cercetari-privind-functionaliz22364.php
17. Trandafir V., Popescu G., Albu M., Iovu H., Georgescu M., Bioproduse pe baza de colagen,
Editura “Ars Docendi”, 2007
18. Asserin J, Lati E, Shioya T, Prawitt J. The effect of oral collagen peptide supplementation on
skin moisture and the dermal collagen network: evidence from an ex vivo model and randomized,
placebo-controlled clinical trials. J Cosmet Dermatol. 2015 Dec;14(4):291-301
19. Avila Rodríguez MI, Rodríguez Barroso LG, Sánchez ML. Collagen: A review on its sources
and potential cosmetic applications. J Cosmet Dermatol. 2018 Feb;17(1):20-26
20. Bello AE, Oesser S. Collagen hydrolysate for the treatment of osteoarthritis and other joint
disorders: a review of the literature. Curr Med Res Opin. 2006 Nov;22(11):2221-32
21. Nalinanon S., Benjakul S., Visessanguan W., Kishimura H. Food Chem. 2007; 104: 593–
22. Pecher J., Pires V., Djaafri I. et al. Eur. J. Med. Chem. 2009; 44: 2643–2650.
23. Ruggiero F., Exposito J.Y., Bournat P. et al. FEBS Lett. 2000; 469: 132–136.
24. Tyan Y.C., Liao J.D., Klauser R., Wu I.D., Weng C.C. Biomaterials 2002; 23: 65-76.
25. Ball M.D., O’Connor D., Pandit A.J. Mater. Sci. Mater. Med. 2009; 20: 113–122.

26