UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL

FACULTAD DE BIOQUÍMICA Y CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA SUPERIOR DE SANIDAD
“DR. RAMÓN CARRILLO”

DESARROLLO DE UN BIOPROCESO PARA

LA OBTENCIÓN DE LACTASA MEDIANTE EL
APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS DE LA
INDUSTRIA LÁCTEA

Alumno: Nicolás Alejandro Puebla

Carrera: Licenciatura en Saneamiento Ambiental
Director: Dr. Pablo César Giordano
Co-Directora: Dra. Gabriela Micheloud
Lugar de trabajo: Laboratorio de Fermentaciones
FBCB, UNL.
2018
INDICE
I- Introducción Página 1
II- Objetivos Página 4
III- Metodología Página 4
IV- Cronograma Página 6
V- Referencias bibliográficas Página 6
1. RESUMEN
La industria láctea genera efluentes que poseen altas demandas de oxígeno.
Particularmente, en la producción de quesos, se genera suero como subproducto, desde
el cual es posible recuperar la fracción proteica, generándose el permeado de suero, que
representa inconvenientes para su disposición final. Una alternativa de aprovechamiento
del permeado es utilizarlo como sustrato para procesos biológicos.
El objetivo de este trabajo fue utilizar el permeado de suero de leche como sustrato
para la generación de lactasa, una enzima producida por diferentes microorganismos y
cuyo sustrato es la lactosa. Para lograrlo, se aplicó diseño experimental en dos etapas: la
primera consistió en identificar los factores significativos y la segunda en optimizar los
niveles de estos, para obtener la mayor actividad enzimática posible. Se utilizó una cepa
de Aspergillus niger cultivada durante distintos periodos de tiempo y en diferentes medios
de cultivo con concentraciones variables de permeado de suero o lactosa, extracto de
malta y peptona (determinados por la aplicación de diseño experimental). Para evaluar las
diferentes formulaciones, se determinaron las concentraciones de biomasa, glucosa y
azúcares reductores totales, y la actividad enzimática de lactasa. Una vez desarrollados
todos los cultivos, se procedió al análisis de datos mediante la aplicación de softwares
específicos, obteniéndose una formulación óptima de medio de cultivo que incluye
permeado de suero de leche en su formulación y que garantiza la maximización de la
actividad enzimática. De esta forma, se logró el aprovechamiento de un subproducto
industrial para la generación de un producto con valor agregado.
Resultados??
2. INTRODUCCIÓN
La industria láctea es una de las más contaminantes debido a los grandes volúmenes
de efluentes que genera y las características particulares de estos, entre ellas, las altas
demandas de oxígeno, tanto biológica (30-50 Kg/m3) como química (60-80 Kg/m3) a causa
de los altos contenidos de materia orgánica, principalmente de lactosa, que lo componen
(Oberoi y col., 2008).
Particularmente, en los procesos de producción de quesos, se genera un subproducto
comúnmente conocido como suero. Por cada kilo de queso producido, se generan
aproximadamente 9 kilos de suero, lo que a nivel mundial se traduce en 190 millones de
toneladas de suero producidas cada año (Yadav y col., 2015). Existen dos clases de
suero: dulce y ácido. El suero dulce se genera cuando la caseína se coagula vía
enzimática a pH= 6,5, mientras que el suero ácido se produce cuando la coagulación se
realiza con ácidos orgánicos o minerales a pH menor a 5 (Yadav y col., 2015).
Una problemática importante que tienen las industrias lácteas es de qué manera
realizar la disposición final del suero. Actualmente, una fracción del volumen de suero que
se genera periódicamente se utiliza para alimentación animal, y la fracción restante es
considerada como un desecho. El problema de desecharlo sin un tratamiento previo
reside en que su descomposición es tóxica para el medio ambiente. Su disposición en
alcantarillas municipales ha sido prohibida por numerosas autoridades locales ya que crea
grandes problemas a las plantas de tratamiento de aguas residuales al interrumpir los
procesos biológicos de los que dependen (Ghaly y col., 2007). La disposición final en la
tierra tampoco es una opción viable ya que crea graves problemas de contaminación para
el ambiente circundante al afectar las características fisicoquímicas del suelo, lo que
resulta en una disminución del rendimiento de los cultivos. Asimismo, cuando es
descargado en cuerpos de agua, reduce el oxígeno disuelto, causando un alto riesgo a la
vida acuática, el ambiente y la salud humana (Ghaly y col., 2007). Por tanto, es necesario
encontrar procesos viables que permitan una disposición final adecuada de estos
efluentes.
Si bien la lactosa presente en los efluentes lácteos puede ser separada y purificada, el
proceso es costoso, y además la demanda mundial está cubierta por otras fuentes más
ventajosas en términos económicos principalmente (Cote y col., 2004).
En el caso de las industrias lácteas más importantes, se utilizan dos alternativas: el
procesado directo y la ultrafiltración. El primero permite obtener suero en polvo mediante
secado por spray, y con la segunda se genera el concentrado proteico, quedando como
remanente el permeado de suero, que contiene aún lactosa y minerales, componentes
que aún pueden y deben ser aprovechados (González Siso, 1996). El problema de estas
dos alternativas es que requieren equipamientos costosos que no están al alcance de
industrias lácteas con capacidades menores de procesamiento, lo cual deja el problema
de la disposición de los efluentes lácteos sin resolver, al menos en forma parcial.
Ante este panorama, para ayudar a resolver la problemática de los efluentes lácteos,
una buena alternativa es su empleo como sustratos para procesos biológicos (Panesar y
col., 2013). Existen microorganismos que pueden fermentar la lactosa y generar
productos de interés como etanol, probióticos, metano, goma xantano, enzimas,
carotenoides, biopreservantes, bioplásticos, o ácidos orgánicos como láctico, propiónico y
acético (Mawson, 1994; Kosseva y col., 2009; Panesar y col., 2013), que aseguran un
manejo apropiado de estos efluentes y tienen potencial a nivel económico y
medioambiental (Hatzinikolaou y col., 2005). Pero, desafortunadamente, hay muchos
microorganismos con aplicaciones industriales que no pueden fermentar la lactosa, por lo
tanto, no pueden emplearla como fuente de carbono y energía (Cote y col., 2004). Sin
embargo, si la lactosa es hidrolizada en una etapa previa, se generan monosacáridos que
sí pueden ser asimilados por estos microorganismos.
La hidrólisis de la lactosa del suero es una alternativa para generar productos con
valor agregado. El proceso de hidrólisis puede ser ácido o enzimático, siendo esta última
opción la preferida ya que se realiza en condiciones suaves de pH y temperatura, y no
modifica propiedades organolépticas (Das y col., 2015). La enzima que cataliza la
hidrólisis de la lactosa es la beta-galactosidasa, también conocida como lactasa. Esta
enzima cataliza la hidrólisis de galactopiranósidos como la lactosa, generando dos
monosacáridos: glucosa y galactosa, los cuales pueden ser utilizados como fuentes de
carbono por microorganismos de interés industrial y/o comercial (Matioli y col., 2003). Es
una enzima muy interesante desde el punto de vista industrial ya que posee resistencia
química y alta actividad a bajo pH y altas temperaturas, reduciendo la posibilidad de
contaminaciones (Haider y Husain, 2009). Es utilizada en la industria alimentaria para
evitar la cristalización en postres congelados concentrados, y para generar leche libre de
lactosa, específica para personas que padecen de intolerancia a la lactosa (Raol y col.,
2014). Si bien se puede obtener desde plantas, animales, bacterias y hongos, las fuentes
microbianas son las preferidas ya que son de fácil manejo y alto rendimiento,
prefiriéndose ciertos microorganismos no patógenos como ciertas especies incluidas en
los géneros Kluyveromyces, Candida, Aspergillus y Bacillus, las que presentan, además,
altas productividades (Pinheiro y col., 2003; Lu y col., 2007; Husain, 2010). Dado que el
costo del medio de cultivo es el factor más importante que determina la economía del
proceso; es necesario idear un proceso eficiente y económicamente factible de
producción de lactasa. Esto se puede lograr desarrollando medios de cultivo a partir de
recursos de nulo o bajo valor agregado, como los efluentes de las industrias lácteas, lo
cual se puede alcanzar aplicando herramientas quimiométricas que permitan analizar los
datos y encontrar combinaciones que garanticen la maximización de la generación del
producto de interés.
Las herramientas quimiométricas consisten en metodologías que se valen de
desarrollos matemáticos y estadísticos, cuyo objetivo es ayudar al investigador a elegir la
estrategia experimental óptima que le permita obtener la información buscada con el costo
mínimo, y evaluar los resultados experimentales obtenidos, garantizando la máxima
fiabilidad en las conclusiones que se obtengan. Estas metodologías comprenden una
serie de pasos que permiten la reducción de los distintos recursos que se ponen en juego
a lo largo de este tipo de investigaciones, ya que con la respuesta obtenida se identifican
las condiciones que deben tenerse en cuenta para lograr la optimización buscada (Araujo
y Brereton, 1996).
Dentro de las herramientas quimiométricas que aplicaremos en esta investigación
podemos mencionar al Diseño Plackett - Burman y la Metodología de Superficie de
Respuesta
Se denomina diseño de Plackett–Burman (PB) a un diseño factorial fraccionado a 2
niveles, que se emplea para estudiar K = N - 1 factores en N experimentos, donde N es
múltiplo de 4 (Plackett y Burman, 1946).. El modelo usado por PB es de primer orden para
cada factor como muestra la ecuación

̂
y= β0 + ∑𝑘
𝑘−1 βi xi + 𝜀 ,

donde y es la respuesta, β0 es el coeficiente independiente, βi es el coeficiente

asociado a cada factor xi, y ε representa el error del modelo. Para ejemplificar la
economía del modelo, podemos pensar en el siguiente ejemplo: un PB consistente en 12
experimentos permite estudiar hasta 11 factores, mientras que un diseño factorial
completo a 2 niveles requeriría 2048 experiencias para realizar la misma tarea.

Como se puede ver, el análisis clásico de PB sólo puede estimar los efectos principales
de los factores con un reducido número de experimentos, pero cada uno de ellos tiene
como confusión parcial, todas las interacciones de 2 factores en las que el factor principal
en cuestión no está involucrado. La validez de un PB radica en la asunción de que todos
los
términos que representan interacciones son despreciables. Esta validez es cuestionable
ya que se encuentra presente el riesgo de evaluar erróneamente algunos factores (por
ejemplo: no considerar un efecto importante, considerar incorrectamente un efecto
irrelevante) cuando el efecto verdadero radica en los términos de interacción, que han
sido previamente considerados como despreciables (Montgomery, 1991)., citado por
Giordano P. …..)
En cuanto a la Metodología de Superficie de Respuesta, podemos describirla como una
colección de técnicas estadísticas que se basa en el uso de análisis multivariado y es
ampliamente empleada para diseñar experimentos, construir modelos, evaluar efectos
simultáneos de varios factores y buscar las condiciones óptimas de un proceso con un
limitado número de experimentos. Ha sido aplicada satisfactoriamente en la optimización
de bioprocesos y formulación de productos (Almeida Bezerra y col., 2008; Didier y col.,
2007; Virkutyte y col., 2010, Myers y col., 2004, Giordano P. ….). La Metodología de
Superficies de Respuesta (RSM) es un conjunto de técnicas matemáticas utilizadas en el
tratamiento de problemas en los que la respuesta que nos interesa está influenciada
por varios factores de carácter cuantitativo. Estas técnicas tienen como propósito diseñar
un experimento que proporcione valores razonables de la variable respuesta y que
permita determinar el modelo matemático que mejor se ajusta a los datos obtenidos. Se
dice que que el valor real esperado, η, que toma la variable de interés está influido por los
niveles de k factores cuantitativos, X1, X2, ..., Xk, cuando existe alguna función de X1, X2,
..., Xk que proporciona el correspondiente valor de η para alguna combinación dada de
niveles:

η= f (X1, X2, ..., Xk)

De tal forma que la variable respuesta puede expresarse como:

Y = η + 𝜀 = f (X1, X2, ..., Xk) + 𝜀

donde 𝜀 es el error observado en la respuesta.

La relación η= f (X1, X2, ..., Xk) existente entre η y los niveles de los k factores puede
representarse a través de una hipersuperficie (subconjunto de un espacio euclídeo de
(k+1) dimensiones) a la que llamaremos superficie de respuesta (Sánchez M. T. y col.
2015)
El análisis de una superficie de respuesta se facilita siguiendo una serie de etapas: en
primer lugar se requiere comprender el problema en profundidad y definir el objetivo;
definir que tipo de respuestas experimentales que se van a observar asegurándose de
que proveen información acerca del proceso en estudio; identificar el dominio
experimental de interés y los factores teniendo en cuenta las diversas restricciones de tipo
experimental, técnica o económica; generar los diseños experimentales apropiados para
realizar la selección de los factores que tienen mayor influencia en la respuesta
(screening) y para determinar la optimización, es decir la combinación de fórmulas de
valores que esperamos que produzcan respuestas óptimas. La experimentación debe
realizarse en forma aleatoria para asegurar que no se introduzca confusión de resultados
debida a factores o contemplados, e interpretar los resultados analizándolos mediante
métodos estadísticos a fin de aportar objetividad al proceso de toma de decisiones; y
finalmente extraer conclusiones de los resultados y recomendar los pasos que se deben
seguir (Massart y col., 1997, Giordano P…..).
.
Para los estudios del tipo que nos convoca, se suelen elegir técnicas de ajuste
polinómico, como la metodología de superficies de respuesta porque permiten determinar
las condiciones de máxima productividad y/o máxima estabilidad de un sistema dado,
haciendo uso del diseño experimental. Esta es una metodología muy utilizada para el
desarrollo y optimización de diversos procesos como cepas bacterianas de interés
comercial (Almeida e Silva y col., 2003), entre otros

En cuanto a los diseños experimentales, se requiere que sean capaces de

proporcionar una distribución razonable de puntos en toda la región de interés; permitir
investigar la idoneidad del modelo, incluyendo la falta de ajuste; permitir la realización de
experimentos en bloques; permitir la construcción secuencial de diseños de orden
superior; proporcionar una estimación del error del sistema; no requerir un número
elevado de experiencias, no requerir demasiados niveles de las variables independientes;
asegurar simplicidad de los cálculos de los parámetros del modelo (de Aguiar y col., 1995,
Giordano P. ...).. Uno de los atributos más importantes del diseño experimental robusto es
el valor de la función deseabilidad.

El cálculo de la función deseabilidad es un método empleado para optimizar procesos

con múltiples respuestas. Se basa en el concepto de que la calidad de un proceso o
producto con al menos una característica no incluida en un límite deseable, no es
aceptable. Por tanto, el desafío es encontrar condiciones operativas que garanticen la
obtención de un valor de respuesta deseable.
 La función deseabilidad parcial o individual (di) asigna un valor que está acotado entre
0 y 1 para cada combinación de factores. Si el valor es 0, implica una combinación no
deseable, mientras que un valor de 1 asegura que todas una respuesta en particular tiene
un valor deseable simultáneamente. La construcción de funciones de deseabilidad parcial
depende de si cada respuesta (Yi(x)) debe ser maximizada, minimizada, tener un valor
dentro de un rango establecido o un valor objetivo. (Giordano P….. revisar plagio)

Otro de los recursos que puede aplicarse al análisis de este tipo de problemas es la
herramienta del algoritmo genético o G.A.. Estos son métodos adaptativos que se
emplean para resolver problemas de búsqueda y optimización y se inspiran en el proceso
de evolución biológica de los organismos vivos (Goldberg, 1989). Son eficaces en cualquier
función pero especialmente se las emplea cuando se necesitan calcular funciones no
derivables. Los GA en el mundo biológico evolucionan mediante iteraciones, llamadas
generaciones. En cada generación, los cromosomas son evaluados usando alguna
medida de aptitud. Las siguientes generaciones (nuevos cromosomas), se crean
aplicando en forma repetitiva un conjunto de operadores genéticos llamados de
selección, cruzamiento, mutación y reemplazo.. Los principios básicos de los GA fueron
establecidos por J. H. Holland (Holland, 1975). En la naturaleza, los individuos de una
población compiten entre sí en la búsqueda de recursos tales como comida, agua y
refugio. Los genes de los individuos mejor adaptados se propagarán en sucesivas
generaciones. Los GA usan una analogía directa con este comportamiento natural, los
algoritmos provocan la evolución de una población compuesta por un determinado
número de individuos, sometiéndola a acciones aleatorias similares a las que operan en la
evolución biológica (mutaciones y recombinaciones genéticas), así como también a una
selección de acuerdo con algún criterio, en función de cual que se decide cuáles son los
individuos más adaptados, que sobreviven, y cuáles los menos aptos, que son
descartados (Li y col., 1992, Giordano P., revisar plagio).
Para operar los GA se trabaja en las diferentes generaciones realizando operaciones:
la primera generación se conoce como inicialización y consiste en generar aleatoriamente
la población inicial, que está constituida por un conjunto de cromosomas que representan
las posibles soluciones del problema. La segunda generación, llamada evaluación, asigna
a cada cromosoma una puntuación de acuerdo a una función de aptitud de manera de
evaluar la solución que representa. Finalmente, en la última generación, se realizan cuatro
 operaciones: la selección, en la que después de saber la aptitud de cada cromosoma
se procede a elegir los que serán cruzados en la siguiente generación; la recombinación,
que representa la reproducción sexual y opera sobre dos cromosomas a la vez para
generar dos descendientes en los cuales se combinarán las características de los
cromosomas padres; la mutación, que consiste en modificar al azar parte de cada uno de
los cromosomas, y abre la posibilidad de llegar a espacios de búsqueda que no estaban
contemplados por la generación anterior, y el reemplazo, que consiste en seleccionar los
mejores cromosomas surgidos de la recombinación y colocarlos en el lugar de los peores
de la generación previa. De esta forma en cada generación se produce una nueva
población de posibles soluciones, la cual reemplaza a la anterior y contiene una mayor
proporción de buenas características en comparación con la población anterior. Esto hace
que a lo largo de las generaciones las buenas características se propaguen a
favoreciendo así el cruce de cromosomas mejor adaptados, y van siendo exploradas las
áreas más prometedoras del espacio de búsqueda (Bramlette,1991, Giordano P.). Las
operaciones continúan hasta que se alcanza el criterio previsto para la finalización. Como
se desconocen las variables que optimizan el modelo, generalmente se emplean dos
criterios: correr el GA un número máximo de iteraciones (generaciones) posible de
acuerdo a los límites del experimento. o detenerlo cuando no se produzcan más cambios
en la población.

En el presente plan se propone el empleo de herramientas quimiométricas para

encontrar una formulación óptima que permita incrementar los rendimientos de lactasa,
sintetizada por Aspergillus, y que permita reducir la carga orgánica de distintos efluentes
de industrias lácteas, empleados como sustratos. La enzima a producir no sólo tiene
aplicaciones industriales, sino que también puede ser utilizada para hidrolizar la lactosa
presente en los efluentes provenientes de industrias lácteas, de manera de ampliar el
espectro de microorganismos que pueden utilizar dichos efluentes como fuentes de
nutrientes.

3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Desarrollar un proceso de producción de lactasa mediante el aprovechamiento de
efluentes de industrias lácteas.
3.2 Objetivos específicos
Aplicar herramientas quimiométricas para la puesta a punto de un medio de cultivo
específico para la maximización de la producción de lactasa.
Determinar la capacidad de hidrólisis de la enzima extraída sobre los efluentes
previamente caracterizados.

4. MATERIALES Y METODOS
4.1 Permeado de suero de leche
El permeado de suero de leche fue gentilmente provisto por MILKAUT S.A., Franck,
Santa Fe.

4.2 Cepa microbiana

La cepa de Aspergillus niger empleada es parte de la colección de cepas del
Laboratorio de Microbiología Aplicada de la FBCB-UNL, Santa Fe, Argentina. Dicha cepa
se seleccionó debido a que es capaz de producir lactasa. Fue mantenida en medio
extracto de malta con 2% de agar-agar y almacenada a 4ºC realizándose repiques
periódicos.

4.3 Diseño y preparación de los medios de cultivos

A partir de formulaciones relevadas en la bibliografía consultada, se evaluaron
combinaciones de concentraciones de diferentes componentes con el fin de incrementar
el rendimiento de lactasa. Las concentraciones ensayadas se determinaron mediante el
uso de herramientas quimiométricas.
Cada una de los medios de cultivo contenía extracto de malta (EM), tripteína
bacteriológica (TB) y lactosa o permeado de suero de leche en diferentes
concentraciones. Las soluciones madres de estos reactivos se prepararon disolviendo los
correspondientes sólidos en agua destilada, a excepción del permeado de suero de leche,
del que se tomó un volumen para diluirlo en agua destilada.
Los diferentes medios de cultivo sugeridos por los diseños experimentales se
materializaron combinando los volúmenes correspondientes de las soluciones madres de
los componentes, luego se ajustó el pH inicial a 5 adicionando volúmenes determinados
de HCl o NaOH 1 M, para luego completar el volumen final de 50 mL mediante la adición
de agua destilada. Los 50 mL de medio de cultivo se transfirieron a frascos Erlenmeyer de
250 mL de volumen nominal. Posteriormente se acondicionaron adecuadamente y
esterilizaron por calor húmedo a 121°C, durante 15 minutos. Al inicio de la incubación,
cada medio de cultivo se inoculó con esporangios de A. níger de manera de obtener un
recuento inicial 1 x 105 esporangios/mL.
Una vez inoculados, se incubaron en agitación a 150 RPM con la ayuda de un
agitador orbital, a una temperatura de 28 ± 1 ºC; y la duración del periodo de cultivo fue
determinada por los diseños experimentales.

4.4 Ensayos de fermentación

Se dividieron en 4 etapas: exploratoria, de identificación de factores significativos, de
optimización, y de comprobación experimental.
4.4.1 Etapa exploratoria: se realizaron dos tipos de cultivos cuya diferencia radicaba
en si el medio de cultivo era de composición definida o indefinida. La composición de los
medios indefinidos fue 20 gL-1 extracto de malta, 1 g.L-1 tripteína bacteriológica y 20 g.L-1
de glucosa o lactosa (pura o contenida en el permeado de suero de leche), mientras que
la de los medios definidos fue 2 g.L-1 NaNO3; 1 g.L-1 K2HPO4; 0,5 g.L-1 KCl; 0,5 g.L-1
MgSO4; 7 H2O; 0,01 g.L-1 FeSO4; 7 H2O y 30 g.L-1 de glucosa o lactosa (pura o contenida
en el permeado de suero de leche).
Todos los cultivos se desarrollaron a 28 C° y 150 rpm durante 7 días, tomando una
alícuota cada 24 horas para determinar las concentraciones de glucosa y azúcares
reductores, y la actividad enzimática.
4.4.2 Etapa de identificación de factores significativos: se construyó un diseño de
Plackett-Burman (PB) que consistió en 12 experimentos, y una vez obtenidos los
resultados, estos fueron analizados empleando algoritmos genéticos (GA). Los factores
evaluados fueron 4 numéricos (concentraciones de extracto de malta (EM) (5 o 30 gL-1),
tripteína bacteriológica (TB) (1 o 10 gL-1), fuente de carbono extra (CE) (5 o 30 gL-1), y
tiempo de cultivo (T) (3 o 5 días)) y 2 categóricos (volumen nominal de Erlenmeyer (V)
(250 o 500 mL) y tipo de fuente de carbono extra (TFC) (lactosa o permeado)), mientras
que las respuestas fueron actividad enzimática (AE) y las concentraciones de glucosa (G),
biomasa (X) y azúcares reductores (AR).
4.4.3 Etapa de optimización: se construyó un diseño central compuesto (DCC) que
consistió en 30 experimentos Los factores involucrados y sus rangos fueron los
siguientes: EM (0 a 35 gL-1), TB (0 a 12 gL-1), T (2 a 7 días) y concentración de lactosa
contenida en permeado de suero de leche (LP) (0 a 35 gL-1). Las respuestas fueron las
mismas que se determinaron en la etapa previa.
 4.4.4 Etapa de determinación de capacidad hidrolítica: se incubó el sobrenadante de
cultivo con un volumen de permeado de suero de leche tal que la concentración de
lactosa inicial sea de 20 g/L. El ensayo se prolongó durante 120 horas tanto en
condiciones estáticas como de agitación (150 rpm). Se realizaron tomas de muestra a las
24, 48 y 120 horas (1, 2 y 5 días) y se determinaron las concentraciones de azúcares
reductores y glucosa.

4.5 Determinaciones analíticas

Una vez concluido el tiempo de cultivo, se procedió a separar las células del
sobrenadante de cada cultivo. Para esto se trasvasó el contenido de los frascos
Erlenmeyer a cápsulas con papel Whatman Nº1 previamente tarado, y se filtró en vacío
utilizando una bomba. Las biomasas filtradas fueron secadas a 50 °C hasta pesada
constante. Los valores de biomasa seca fueron luego transformados en valores de
concentración.
En los sobrenadantes filtrados se determinaron las concentraciones de glucosa y
azúcares reductores, y actividad enzimática.
La concentración de glucosa fue medida enzimáticamente usando un kit comercial
(Wiener Lab., Argentina). Este método de cuantificación consiste en 2 pasos: primero, la
glucosa oxidasa cataliza la reacción de oxidación de glucosa hacia ácido glucónico, con el
consecuente consumo de oxígeno y agua, y la generación de peróxido de hidrógeno. En
el segundo paso, una peroxidasa cataliza la reacción entre 2 moléculas de peróxido de
hidrógeno con fenol y 4-aminofenazona para generar 4 moléculas de agua y un
compuesto coloreado conocido como 4-(p-benzoquinona monoimino)-fenazona, cuyo pico
de absorción se encuentra en los 505 nm del espectro visible.
La concentración de azúcares reductores fue determinada usando una técnica de
óxido-reducción que se basa en la capacidad de la ciertos azucares para reducir el ácido
3,5-dinitrosalicilico a pH alcalino y temperatura de alrededor de 90 ºC. Esta reducción
produce el ácido 3-amino-5-nitrosalicilico, cuya concentración y coloración rojiza es
proporcional a la de azucares reductores presentes en la muestra. Finalmente, el color se
estabiliza enfriando el medio de reacción y adicionando una solución de tartrato de sodio y
potasio. Finalmente, se mide la absorbancia a 575 nm.
La actividad enzimática se determinó combinando 100 µL de sobrenadante, 200 µL de
solución de lactosa 100 mM y 1700 µL de solución buffer citrato 100 mM pH = 4. Dicha
mezcla fue incubada a 50 ºC en baño María durante 10 minutos, y finalmente en agua
hirviendo durante 2 minutos. Luego, se determinó la concentración de glucosa en cada
mezcla mediante un kit enzimático comercial (Wiener Lab.). Una unidad de actividad
enzimática se definió como la cantidad de enzima que libera 1 µmol de glucosa por
minuto.
En las determinaciones de actividad enzimática, y concentraciones de glucosa y
azúcares reductores, las determinaciones fueron por triplicado y contra blanco de
reacción, además de la realización de curvas de calibrado.

4.6 Recursos informáticos

Los datos obtenidos (concentraciones de biomasa, glucosa, y azucares reductores, y
actividad enzimática) se ingresaron a los diseños experimentales y con ayuda de
programas informáticos específicos (DesignExpert, versión 7.0.3, Stat-Ease Inc.,
Minneapolis, EE. UU. y MATLAB R2008a (The MathWorks, Inc.)) se determinó la
formulación óptima. La misma se verificó experimentalmente. Se compararon los
resultados obtenidos experimental y analíticamente, y se decidió si los modelos ajustados
son buenos descriptores de las variaciones observadas en cada una de las respuestas en
función de los estadísticos obtenidos.

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Etapa exploratoria:
5.1.1 Cultivos en medios de composición indefinida: se evaluaron 3 medios de cultivo:
indefinido con glucosa (IG), con lactosa (IL) y con permeado de suero de leche (IP). Las
Figuras 1A, 1B y 1C muestran la evolución de las concentraciones de glucosa y azúcares
reductores, y de la actividad enzimática en función del tiempo de cultivo de A. niger
creciendo en medios IG, IL e IP, respectivamente.
 Figura 1. Evolución de las concentraciones de glucosa y azúcares reductores, y de la
actividad enzimática en un cultivo de A. niger en medio IG. Los valores mostrados son
promedios (n = 3).

Figura 2. Evolución de las concentraciones de glucosa y azúcares reductores, y de la

actividad enzimática en un cultivo de A. niger en medio IL. Los valores mostrados son
 promedios (n = 3).

Figura 5. Evolución de las concentraciones de glucosa y azúcares reductores, y de la

actividad enzimática en un cultivo de A. niger desarrollado en un medio indefinido con
permeado de suero. Los valores mostrados son promedios de cultivos realizados por
triplicado.

En el caso del cultivo en IG (Figura 1) se observa que la actividad enzimática

desciende hacia el segundo día de cultivo hasta volverse prácticamente nula y mantener
ese comportamiento hasta el día 5, donde luego aumenta levemente y se mantiene en
0,06 UI/mL-1 hasta el final del cultivo.
Por otra parte, puede observarse que tanto las concentraciones de azúcares
reductores como las de glucosa descienden a lo largo de todo el tiempo de cultivo, lo cual
es de esperarse ya que las fuentes de carbono están siendo consumidas por Aspergillus.
El desfasaje que hay entre las concentraciones de estas dos respuestas puede deberse a
que el extracto de malta aporta maltosa, que al igual que la glucosa, es una fuente de
carbono, y en los azúcares reductores se están detectando la suma de estos
monosacáridos.
En el caso del cultivo en IL (Figura 2) se puede ver que, por otra parte, los azúcares
reductores comienzan a descender a partir del día 2, y detienen su descenso a partir del
quinto día donde se mantiene constante dentro de un rango aproximado de 23 g/L-1.
 Se registra una mayor actividad enzimática en el medio IL que en el medio IG. Este
comportamiento es el esperado ya que en el medio IL, el hongo debe producir lactasa
para poder desdoblar la lactosa presente en el medio y obtener energía desde los
monosacáridos resultantes; en cambio, en el medio IG, el microorganismo no tiene la
necesidad de producir la enzima. Por otro lado, hasta el día 1, la actividad enzimática es
similar en ambos cultivos, lo cual puede deberse a una actividad basal del hongo. A partir
del día 2 se observa la mayor actividad enzimática en el caso del medio IL, lo cual se ve
acompañado por un aumento en la concentración de glucosa. Posteriormente, la actividad
enzimática disminuye hasta el día 5, para luego mantenerse constante hasta el final de
cultivo. Este comportamiento final puede deberse a que la inhibición de la síntesis de la
enzima ejercida por la glucosa ha decrecido ya que esta ha sido consumida en esta etapa
del cultivo.
La concentración de azúcares reductores muestra un comportamiento muy similar en
ambos cultivos. Aunque su disminución es más pronunciada en los cultivos IG
Por último, en el cultivo IP, la actividad enzimática se incrementa hasta el día 2
concentración de glucosa, lo que indica que la galactosa generada por el desdoblamiento
se acumula debido a que no puede ser consumida en su totalidad. Desde el día 2, la
actividad enzimática se mantiene constante hasta el del cultivo, La concentración de
glucosa en cambio disminuye a valores prácticamente nulos hasta el final del cultivo, lo
que se debería a que la glucosa generada es rápidamente consumida por A. niger.
Por otra parte, la concentración de azúcares reductores disminuye marcadamente
hasta el tercer día de cultivo, momento a partir del cual continúan siendo consumidos por
el microorganismo pero a un ritmo menor medida que transcurren los días de cultivo.

5.1.2 Cultivos en medios de composición definida: se evaluaron 3 medios de cultivo:

definido con glucosa (DG), definido con lactosa (DL) y con permeado de suero de leche
(DP). Las Figuras 2A, 2B y 2C muestran la evolución de las concentraciones de glucosa y
azúcares reductores, y de la actividad enzimática en función del tiempo de cultivo de A.
niger creciendo en medios DG, DL e DP, respectivamente.
 Figura 3. Evolución de las concentraciones de glucosa y azúcares reductores, y de la
actividad enzimática en un cultivo de A. niger en medio DG. Los valores mostrados son
promedios (n = 3).

Figura 4. Evolución de las concentraciones de glucosa y azúcares reductores, y de la

actividad enzimática en un cultivo de A. niger en medio DL. Los valores mostrados son
promedios (n = 3).
Figura 6. Evolución de las concentraciones de glucosa, de los azucares reductores, y de
la actividad enzimática en un cultivo de A. niger desarrollado en un medio definido con
permeado de suero. Los valores mostrados son promedios de cultivos realizados por
triplicado.

En la Figura 2A puede observarse que tanto la concentración de glucosa como la de

azúcares reductores muestran un comportamiento similar, lo cual es de esperarse ya que
en este caso el único azúcar presente en el medio es la glucosa, y ésta es consumida por
el hongo para obtener carbono y energía.
La actividad enzimática se mantiene prácticamente nula hasta el día 3 y registra un
leve aumento hacia el cuarto día de cultivo, para mantenerse constante hasta el final del
cultivo, sin embargo, los valores observados son similares a los obtenidos en el medio de
cultivo IG, por lo cual es de suponer que la actividad enzimática registrada sea basal. En
el cultivo DL la actividad enzimática es entre los días 1 y 5. A partir del día 4, las
actividades enzimáticas se diferencian entre sí: mientras que, en el cultivo DL, la actividad
se mantiene constante; en el cultivo DG, se incrementa levemente, lo cual podría deberse,
nuevamente, a que la represión (a nivel genético) ejercida por la glucosa ya no es tan
significativa.
En el cultivo DP se observa la mayor actividad enzimática entre los días 1 y 3, y
descendiendo a niveles iniciales hacia el día 4, a partir del cual presenta un leve aumento
que se prolonga hasta el final del cultivo. Este comportamiento no se ve acompañado por
un pronunciado descenso en la concentración de azúcares reductores como ocurría en el
caso del medio IP.

5.2 Fase de selección de factores significativos

En base a los resultados obtenidos en la fase previa, los ensayos posteriores fueron
realizados en medios de cultivo de composición indefinida.
Se construyó un diseño de Plackett-Burman (PB) para evaluar el efecto de diferentes
factores sobre la actividad enzimática (AE) y las concentraciones de glucosa (G), biomasa
(X) y azúcares reductores (AR). Los factores evaluados fueron 4 numéricos:
Concentraciones de extracto de malta (EM) (gL-1), Tripteina bacteriológica (TB) (gL-1) y
Fuente de carbono extra (CE) (gL-1), y Tiempo de cultivo (T) (días); y 2 categóricos:
Volumen nominal de Erlenmeyer (V) y Tipo de fuente de carbono extra (TFC).
Cabe aclarar que el término “fuente de carbono extra” hace referencia a la lactosa
presente en el medio de cultivo en forma pura o contenida en el permeado de suero de
leche, ya que el medio contiene extracto de malta, que en su composición incluye
maltosa, un disacárido que puede ser metabolizado por A. niger para obtener carbono.
La Tabla 1 resume las 12 combinaciones de los 6 factores, obtenidas mediante la
construcción de un PB, y los valores de las 4 respuestas.

Tabla 1: Diseño de Plackett-Burman construido para evaluar la significancia de factores

en cultivos de A. niger
E Factores Respuestas
x
p
e
r
T
i EM TB CE V G AR AE X
-1 -1 (días TFC
m (gL ) (gL ) (gL-1) (mL) (gL-1) (gL-1) (UmL-1) (gL-1)
)
e
n
t
o
1 30.0 1.0 5.0 30.0 500.0 Lac 0.03 10.29 0.06 7.27
2 5.0 10.0 5.0 30.0 250.0 Lac 0.00 8.38 0.01 1.87
3 30.0 1.0 3.0 5.0 500.0 Lac 1.35 4.99 0.05 3.73
4 5.0 1.0 3.0 5.0 250.0 Lac 0.00 2.45 0.05 2.08
5 30.0 10.0 5.0 5.0 250.0 Lac 0.06 2.14 0.13 12.67
6 30.0 10.0 3.0 5.0 250.0 Per 0.25 3.09 0.03 8.59
7 5.0 1.0 3.0 30.0 250.0 Per 0.00 8.80 0.05 2.88
 8 30.0 10.0 3.0 30.0 500.0 Per 0.07 7.64 0.04 14.71
9 5.0 10.0 3.0 30.0 500.0 Lac 0.00 8.26 0.04 4.17
10 5.0 10.0 5.0 5.0 500.0 Per 0.00 1.50 0.08 6.3
11 5.0 1.0 5.0 5.0 500.0 Per 0.00 1.82 0.06 4.06
12 30.0 1.0 5.0 30.0 250.0 Per 0.00 11.24 0.12 7.64
a
Lac = Lactosa pura; Per = Lactosa contenida en permeado de suero de leche

Los resultados fueron analizados empleando algoritmos genéticos (GA) y las conclusiones
obtenidas se resumen en la Tabla 2, la cual muestra los valores de probabilidad para cada
efecto ejercido por los factores y/o sus interacciones sobre cada respuesta, además de
los valores de R2 para cada modelo obtenido.

Tabla 2: Valores de probabilidad (p) para cada efecto ejercido por los factores y/o
sus interacciones sobre cada respuesta
Factor o Valor de pa y efectob
interacción G AR AE X
EM 0,047 (+) 0,016 (+) - 0,001 (+)
TB - 0,013 (-) - 0,004 (-)
T 0,042 (-) - - -
CE - 2 x 10-5 (+) - -
V - - - -
TFC - - - -
EM/T8 - 0,050 (+) -
EM/C 0,033 (-) - - 0,036 (-)
EM/V - - 0,011 (-) -
R2 0,683 0,959 0,809 0,811
a
Valores de p menores o iguales a 0.05 indican un efecto significativo.
b
+: efecto positivo y un signo; -: efecto negativo.

Del análisis de la Tabla 2 se desprende que el volumen nominal no ejerció efectos

significativos sobre ninguna de las respuestas, lo cual puede deberse a que el volumen de
cultivo empleado en este estudio permite obtener no sólo un buen mezclado sino también
un área de contacto líquido-gas lo suficientemente grande como para que no ocurra una
limitación de oxígeno, haciendo que el cambio de volumen nominal, al menos a esta
escala de cultivo, no tenga efecto. Similarmente, el tipo de fuente de carbono extra
tampoco tuvo efectos significativos, lo que indica que el reemplazo de lactosa por el
permeado de suero de leche es factible.
En consecuencia, en la etapa de optimización, los factores volumen (V) y tipo de
fuente de carbono (TFC) se mantuvieron constantes en 250 mL y permeado de suero de
 leche respectivamente, mientras que los restantes 4 factores fueron considerados pero
ampliando sus rangos.

Fase de optimización de factores

Con el fin de obtener una combinación óptima de los niveles de los factores que
garanticen una buena producción de lactasa, se construyó un diseño central compuesto
(DCC) que consistió en 30 experimentos. Los factores considerados y sus rangos fueron
los siguientes: EM (0 a 35 gL-1), TB (0 a 12 gL-1), T (2 a 7 días) y concentración de lactosa
contenida en permeado de suero de leche (LP) (0 a 35 gL-1).
En la Tabla 3 se detallan los 30 experimentos correspondientes al DCC construido, y
los valores de las respuestas.

Tabla 3: DCC construido para encontrar la combinación óptima de factores que maximice la
producción de lactasa en cultivos de A. niger.
Experiment Factores Respuestas
o EM TB T LP G AR AE X
(gL-1) (gL-1) (días) (gL-1) (gL-1) (gL- (UI) (gL-1)
1
)
1 8,7 9,0 5,75 26,2 0,00 10,3 0,14 6,21
5 0 5 9
2 8,7 9,0 3,25 8,75 0,00 4,40 0,05 10,21
5 0
3 8,7 3,0 5,75 8,75 0,00 4,68 0,08 14,53
5 0
4 26, 9,0 3,25 26,2 0,13 24,1 0,11 14,16
25 0 5 5
5 17, 6,0 4,50 17,5 0,01 10,7 0,08 16,08
50 0 0 4
6 26, 9,0 5,75 8,75 6,44 0,06 16,60
25 0
7 8,7 3,0 3,25 26,2 0,00 19,4 0,10 15,22
5 0 5 9
8 26, 3,0 3,25 8,75 0,06 6,79 0,07 9,54
25 0
9 17, 6,0 4,50 17,5 0,00 12,5 0,12 14,11
50 0 0 1
10 26, 3,0 5,75 26,2 0,00 15,2 4,84
25 0 5 6
11 26, 3,0 5,75 8,75 0,05 0,52 0,05 6,93
25 0
12 8,7 9,0 3,25 26,2 0,22 11,2 0,10 4,17
5 0 5 4
13 26, 3,0 3,25 26,2 0,22 22,1 0,03 6,71
 25 0 5 0
14 8,7 3,0 3,25 8,75 0,13 4,82 0,07 2,88
5 0
15 26, 9,0 5,75 26,2 0,19 12,0 0,03 4,59
25 0 5 1
16 17, 6,0 4,50 17,5 0,11 2,47 0,10 8,67
50 0 0
17 8,7 3,0 5,75 26,2 0,23 13,5 0,01 2,08
5 0 5 7
18 8,7 9,0 5,75 8,75 0,21 0,26 0,08 3,73
5 0
19 26, 9,0 3,25 8,75 0,21 6,51 0,04 5,87
25 0
20 17, 6,0 4,50 17,5 0,19 1,70 0,07 7,27
50 0 0
21 17, 6,0 7,00 17,5 0,01 0,83 12,39
50 0 0
22 17, 12, 4,50 17,5 0,23 13,1 0,05 7,68
50 00 0 4
23 17, 6,0 4,50 0,00 0,00 0,23 0,07 15,64
50 0
24 17, 6,0 4,50 17,5 0,00 11,5 0,05 13,69
50 0 0 2
25 0,0 6,0 4,50 17,5 0,06 19,0 0,10 2,67
0 0 0 7
26 17, 6,0 4,50 17,5 0,09 1,87 0,03 11,26
50 0 0
27 17, 6,0 2,00 17,5 0,12 24,1 0,01 13,14
50 0 0 5
28 17, 6,0 4,50 35,0 0,12 3,40 0,03 9,03
50 0 0
29 17, 0,0 4,50 17,5 0,08 25,8 0,04 1,66
50 0 0 4
30 35, 6,0 4,50 17,5 0,04 0,03 11,17
00 0 0

Del análisis de los datos se desprende que las 4 respuestas se ajustan a modelos
cuadráticos, los cuales pueden ser representados matemáticamente mediante las
Ecuaciones (1) a (4).
donde y1, y2, y3 e y4 son las respuestas G, AR, AE y X, respectivamente, y x1, x2, x3 y x4
son los factores EM, TB, T y LP, respectivamente.
Los valores de los coeficientes R2 obtenidos fueron 0,753, 0,735, 0,602 y 0,869 para
las respuestas G, AR, AE y X, respectivamente, indicando que altos porcentajes de sus
variabilidades se explican con los modelos obtenidos.

Figura 7. Superficie de respuesta que representa la AE en función del EM y de la LP,

manteniendo los factores TB y T en ¿qué valores?.

Figura 8. Superficie de respuesta para la AE en función de la TB y del EM.

 Figura 9. Superficie de respuesta para la AE en función del T y del EM.

La figura 7 muestra que un aumento combinado en las concentraciones de permeado

de suero de leche y de extracto de malta genera un incremento en la actividad enzimática.
Sin embargo, el mayor aumento de la actividad enzimática ocurre al mantener la
concentración de LP elevada y la concentración del extracto de malta reducida.
La razón por la cual AE aumenta a medida que la concentración de EM disminuye
puede deberse a que, tanto PS como EM son fuentes de carbono y, por lo tanto, al
coexistir ambas en altas concentraciones, podrían causar un exceso de fuentes de
carbono asimilables en el medio, que estaría causando una inhibición de la producción de
la enzima de interés.
Las actividades enzimáticas más bajas se observan al disminuir la concentración de
lactosa presente en PS, más allá de la concentración de EM, lo que implica que la
generación de la enzima es muy dependiente de la concentración de lactosa presente en
el medio de cultivo, lo cual es de esperarse, ya que la producción de beta-galactosidasa
es promovida por la presencia de dicho disacárido (aca habría que poner una
referencia). Por otro lado, de la observación de la figura 8, se puede concluir que
elevadas concentraciones de TB favorecen el incremento de la AE independientemente
de las concentraciones del EM.
 Adicionalmente, en la gráfica 9 se observa que el tiempo de cultivo no ejerce efecto
sobre la AE, siendo alrededor de 4/5 días la cantidad de tiempo más favorable para el
cultivo.
De la observación de las 3 figuras se puede concluir que tanto el tiempo de cultivo
como la concentración de EM no ejercen un efecto significativo al menos sobre la
respuesta AE, mientras que la TB y LP si tienen un efecto importante sobre esta misma
respuesta.
La observación de las figuras 10 a 12 permite elucidar los efectos individuales y
combinados de los factores sobre la respuesta evaluada que en este caso son los
azúcares reductores.

Figura 10. Superficie de respuesta para los AR en función de la TB y del T.

 Figura 11. Superficie de respuesta para los AR en función de la TB y de la LP.

Figura 12. Superficie de respuesta para los AR en función del T y de la LP.

Las figuras 10 y 12 muestran que el tiempo (días) tiene un efecto significativo sobre la
concentración de azúcares. A menor cantidad de días transcurridos del ensayo esta
concentración es elevada y a mayor cantidad de días baja la concentración. Esto
demuestra que existe una relación entre los días de cultivo y esta respuesta, lo cual
puede deberse a que el hongo consume los azúcares presentes en el medio.
Los gráficos muestran que transcurridos los 7 días de cultivo, la concentración de
azúcares presentes en el medio baja hasta alcanzar valores muy bajos o casi nulos.
Valores medios, alrededor de 4/5 días de cultivo, parecería bastar para obtener bajas
concentraciones de azúcares. Esto es importante porque se podría ahorrar tiempo e
insumos requeridos para el ensayo.En el caso del suero la cantidad utilizada no sería de
importancia ya que este es un desecho de la industria y por lo tanto no conlleva ningún
costo, pero cabe destacar que valores medios del mismo alcanzan para obtener los
valores deseados de azúcares reductores. Por otra parte, de la observación de las figuras
10 y 11, puede decirse que valores demasiado bajos o demasiado altos de TB provocan
que la concentración de azúcares aumente. Esto puede deberse a que, por ser esta la
única fuente de nitrógeno disponible para el microorganismo, y al disminuir
excesivamente, el hongo no puede metabolizar los azúcares presentes en el medio. Por el
contrario, un aumento de TB estaría causando una inhibición a la actividad del
microorganismo por lo que no consumiría el azúcar presente en el medio. La TB es un
insumo de valor, por lo que es conveniente bajar su concentración en los cultivos para
reducir así los costos pero no demasiado ya que esto perjudica la metabolización de los
azúcares por parte del hongo.
La observación de las figuras 13 a 15 permite dilucidar los efectos individuales y
combinados de los factores sobre la respuesta evaluada que en este caso es la glucosa
Figura 13. Superficie de respuesta para la G en función del EM y de la TB.

Figura 14. Superficie de respuesta para la G en función de la TB y de la LP.

Figura 15. Superficie de respuesta para la G en función del T y del EM.

Figura 16. Superficie de respuesta para la X en función de la LP y del T.

 Figura 17. Superficie de respuesta para la X en función de la LP y del EM.

Figura 18. Superficie de respuesta para la X en función y de la TB y del EM.

Verificación experimental
 En la tabla 5 se observa una comparación entre los resultados obtenidos y los
predichos por los modelos matemáticos.

Tabla 5: Comprobación experimental

Respuesta Valor predicho Valor experimental

Actividad 0,10 0,11 (0,01)

enzimática (UI/mL)
Azúcares 0,04 0,61 (0,05)
reductores (g/L)

Glucosa (g/L) 0,21 0,06 (0,01)

Biomasa (g/L) 6,24 6,48 (0,34)

Fase final. Determinación de la capacidad de hidrolisis de los sobrenadantes

Finalmente, el sobrenadante donde, de acuerdo a la bibliografía, debería encontrarse
la enzima, se incubó durante 120 horas con permeado fresco en un volumen tal que la
concentración de lactosa inicial sea la óptima
 Figura 19. Evolución de las concentraciones de glucosa en función del tiempo, en
medios de cultivos estáticos y agitados incubados con permeado de suero. Los valores
mostrados son promedios de cultivos realizados por duplicado.

Figura 20. Evolución de las concentraciones de azúcares reductores en función del

tiempo, en medios de cultivos estáticos y agitados incubados con permeado de suero. Los
valores mostrados son promedios de cultivos realizados por duplicado.

En el caso de la concentración de glucosa, no se observa un aumento, lo que indicaría

que no hay actividad enzimática en el medio de cultivo. Esto podría deberse a que la
enzima es intracelular y que en el sobrenadante solo existe una actividad mínima residual.
Esto explicaría, por qué, al realizar la determinación de la actividad enzimática en los
cultivos, se obtienen valores tan bajos.
En cuanto a la concentración de azúcares reductores, a lo largo de todo el ensayo
esta se mantiene prácticamente constante, lo cual es de esperarse ya que en estos
cultivos no se encuentra el hongo, por lo tanto no hay consumo de los azúcares. Esta
determinación se realizó a modo de control para descartar el consumo de la lactosa por
células de hongo que pudieron haber permanecido suspendidas en el sobrenadante.

VI. CONCLUSIONES
 Se definieron las variables de diseño y operativas de un medio de cultivo para la
producción de lactasa, a la vez que se aprovechó un material de desecho, con nulo o muy
bajo valor económico, en las formulaciones de los medios de cultivo como lo es el
permeado de suero de leche.
Se demostró que el permeado de suero de leche puede ser un excelente sustituto de
la lactosa comercial, y su incorporación en medios de cultivo sería una solución potencial
para industrias lácteas menores. Además se logró reducir la carga orgánica de este
efluente.
Al mismo tiempo, al aprovechar este material de desecho, se colaboró en la búsqueda
anticipada de potenciales problemas medioambientales, ya que se planteó una alternativa
a la disposición final que se realiza de éstos. Esto pudo concretarse gracias a la
aplicación de diferentes herramientas quimiométricas avanzadas, que permitieron predecir
las combinaciones óptimas de factores que aseguran concretar los objetivos planteados.
El empleo de herramientas quimiométricas como el diseño experimental y la
optimización sistemática permitieron encontrar una formulación óptima de un medio de
cultivo a base de permeado de suero de leche para la producción de lactasa, sintetizada
por Aspergillus niger, minimizando los costos y garantizando la máxima fiabilidad en los
resultados. La actividad enzimática obtenida fue baja, por lo cual, a futuro se propone
identificar las causas y solucionarlas. Por otro lado, la concentración de azúcares
reductores se redujo a valores casi nulos, lo cual indicaría que se podría lograr minimizar
el impacto provocado por su volcado directo en el ambiente.
La construcción de un diseño de Plackett-Burman y la metodología basada en
algoritmos genéticos permitió, primero identificar el efecto de diferentes factores sobre la
actividad enzimática, las concentraciones de glucosa, la biomasa y sobre los azúcares
reductores; y en segundo lugar evaluar los factores con efectos significativos. Mientras
que en una etapa posterior, aplicando un diseño central compuesto, se obtuvo más
información de cómo esos factores influyen solos o combinados sobre las respuestas,
permitiendo entender en profundidad el sistema.
Una vez desarrollados todos los cultivos, se procedió al análisis de datos mediante la
aplicación de software específicos, obteniéndose una formulación óptima de medio de
cultivo que incluyó permeado de suero de leche en su formulación y que garantiza la
maximización de la actividad enzimática de lactasa. De esta forma, se logró el
aprovechamiento de un subproducto industrial para la generación de un producto con
valor agregado.
 Finalmente cultivando el sobrenadante con el permeado de suero se determinó la
capacidad de hidrólisis de la enzima presente en el sobrenadante y se encontró que la
misma no muestra actividad.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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