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El factor neurotrófico Trypanosoma cruzi facilita la reparación cardíaca en un

modelo de ratón de enfermedad de Chagas crónica

Facor es un aproteina que actua como factor de crecimiento-- Estas sustancias


pertenecen a una familia de factores de crecimiento que son un tipo de proteínas que se
vierten al torrente sanguíneo y son capaces de unirse a receptores de
determinadas células para estimular su supervivencia, crecimiento o diferenciación.

puede desarrollarse una cardiomiopatíadifusa grave o una dilatación patológica


(megasíndromes) del esófago y colon (megaesófago y megacolon respectivamente).

RESUMEN
La mayoría de los pacientes con infección aguda por Trypanosoma cruzi experimentan
alteraciones cardíacas estructurales y funcionales a corto plazo que curan sin secuelas.
Por el contrario, en los pacientes cuya enfermedad progresa hacia una infección crónica,
puede desarrollarse una cardiomiopatía chagas degenerativa irreversible (CCC). Para
tener en cuenta el contraste entre la regeneración cardíaca en la infección aguda por alto
parasitismo y la cardiomiopatía progresiva en el CCC bajo parasitismo, la hipótesis de
que T. cruzi expresa factores de reparación que facilitan directamente la regeneración
cardíaca. Investigamos el factor neurotrófico derivado de parásitos (PDNF, por sus
siglas en inglés) del T. cruzi, que se sabe que desencadena la supervivencia de los
miocitos y fibroblastos cardíacos y regula la quimiocina CCL2, que promueve la
migración de las células progenitoras cardíacas regenerativas (CPC), como uno de esos
factores de reparación. Probamos si T. cruzi PDNF promueve la reparación cardíaca
utilizando modelos in vivo e in vitro de la enfermedad de Chagas. La qPCR y la
citometría de flujo del tejido cardíaco revelaron que las CPC Sca-1 + se expanden en la
infección aguda en paralelo al parasitismo. El PDNF recombinante indujo la
supervivencia y la expansión de las CPC ex vivo, y la administración intravenosa de
PDNF en ratones sin tratamiento previo aumentó el ARNm del marcador de células
madre cardíacas Sca-1. Además, en ratones CCC, una administración intravenosa de
tres semanas del protocolo PDNF indujo la expansión de CPC y revirtió la acumulación
de células T del ventrículo izquierdo y la remodelación cardíaca, incluida la fibrosis. En
comparación con los ratones tratados con vehículo CCC, que desarrollaron un bloqueo
atrioventricular grave, los ratones tratados con PDNF mostraron una frecuencia y una
severidad reducidas de las anomalías de conducción. Nuestros hallazgos respaldan el
novedoso concepto de que T. cruzi usa PDNF para promover la reparación cardíaca
mutuamente beneficiosa en la enfermedad de Chagas. Esto podría indicar un posible
camino hacia la prevención o tratamiento de la CCC.

Métodos
Declaración de Ética. el trabajo con ratones se realizó de acuerdo con la Guía para el
Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio adoptada por los Institutos Nacionales de la
Salud, y fue aprobada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la
Escuela de Medicina de la Universidad de Tufts y la División de Animales de
Laboratorio. Medicina.

Los parásitos La cepa colombiana T. cruzi se recolectó de células Vero (ATCC;


Manassas, VA) como se describió anteriormente (Chuenkova y PereiraPerrin, 2004).
Los tripomastigotes se recogieron del sobrenadante del cultivo y se purificaron
mediante centrifugación diferencial, luego se resuspendieron en medios apropiados
(PBS o medio de cultivo celular respectivo para aplicaciones in vivo e in vitro,
respectivamente).
Infección aguda por T. cruzi. Se infectaron ratones C57BL / 6J de 8 semanas de edad
(Jackson Laboratory; Bar Harbor, ME) con 1,000-3,000 parásitos mediante inyección
intravenosa en la vena de la cola. Los ratones fueron sacrificados en el pico de infección
aguda, 18-20 días después de la infección (PI), o en el momento indicado.
Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Se aisló ARNm de lisados de
QIAzol (Qiagen; Alemania) de muestras de tejido congelado instantáneamente y
disociado mecánicamente usando un rasgador de tejido (Biospec Products, Inc .;
Bartlesville, OK) según el protocolo del fabricante. El ADNc se sintetizó utilizando el
kit de transcripción inversa QuantiTect (Qiagen) según el protocolo del fabricante. Los
transcritos de genes se cuantificaron después de la amplificación utilizando cebadores
específicos y SYBR verde (Qiagen), y la normalización al gen de mantenimiento
hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HPRT).
Citometría de flujo. Los corazones de ratones se digirieron con colagenasa tipo II (0,895
mg / ml) (Worthington Biochemical; Lakewood, NJ) y proteasa XIV (0,5 mg / ml,
excepto los experimentos Sca-1) (Sigma Aldrich; St. Louis, MO) y las células se tiñeron
en la superficie con los siguientes anticuerpos monoclonales: α-Sca-1 conjugado con
FITC (D7) (Miltenyi Biotec; Alemania), α-CD3e conjugado con FITC (145-2C11), α-
CD45.2 conjugado con PE (104) , APC-Cy7 conjugado con α-Ly-6C (HK1.4), PerCP
conjugado con α-CD11b (M1 / 70) (BioLegend; San Diego, CA) como se describió
anteriormente (Nevers et al., 2017). Los anticuerpos se diluyeron en PBS más 2% de
FBS y se incubaron con células durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de
2 lavados en PBS más 2% de FBS, se ejecutaron las células y los datos se adquirieron
en un LSRii (BD Biosciences; Franklin Lakes, NJ) y se analizaron con el software
FlowJo.
Aislamiento de CPC Sca-1 +. Se aislaron CPC Sca-1 + de los corazones de ratones
C57Bl / 6J. La sangre se extrajo del corazón post mortem con una jeringa de insulina 27
G de 1 ml. El corazón se perfundió con PBS frío, luego se extirpó, se cortó
transversalmente por la mitad y se colocó en una solución salina tamponada con hielo
de Hank (Gibco, Thermo Fisher; Waltham, MA) con 10.000 U / ml de colagenasa II
(Worthington Biochemical). El tejido se homogeneizó utilizando el disociador
softMACS (Miltenyi Biotec) según el protocolo del fabricante. Los glóbulos rojos se
lisaron utilizando un tampón de lisis de glóbulos rojos (Sigma Aldrich) y las células
restantes se lavaron en un tampón de funcionamiento autoMACS (Miltenyi Biotec) para
crear suspensiones de células individuales. Los CPC Sca-1 + luego se marcaron y
aislaron magnéticamente utilizando el kit Anti-Sca-1-MicroBead (FITC) (Miltenyi
Biotec) según el protocolo del fabricante. Las células se sembraron en una placa de 6
pocillos por duplicado en medio enriquecido y se incubaron a 37 ° C / 5% de CO2.
Experimentos de diferenciación y clonogenicidad. Las células Sca-1 + se colocaron en
placa en medio basal (IMDM / FBS al 10%) o medio que contenía 20 ng / ml de factor
de crecimiento endotelial vascular (VEGF) para inducir la diferenciación en un fenotipo
de células endoteliales. Después de 14 días, las células se fijaron y se tiñeron con el
factor α-von Willebrand (α-vWF) (1: 100, Agilent / Dako; Santa Clara, CA), seguido de
un anticuerpo secundario IgG de conejo conjugado con Alexa 594 (1: 500). , Sondas
Moleculares; Eugene, OR). Las células se tiñeron con DAPI. Las imágenes se
capturaron utilizando los mismos tiempos de exposición y se procesaron de manera
similar. Para la diferenciación en cardiomiocitos, las células se colocaron en placas en
medios basales o medios que contenían 5-Azacitidina 10 mM durante 3 días, luego en
medios basales durante 14 días. Las células se fijaron y se tiñeron con α-Myosin Heavy
Chain (α-MyHC) (1: 100, Millipore; Burlington, MA) seguido de un anticuerpo
secundario IgG α-mouse conjugado con Alexa 568 (1: 500, Molecular Probes). Para
evaluar la clonogenicidad, las células Sca-1 + se clonaron en placas de 96 pocillos
mediante dilución limitante (0,5 células / pocillo, verificada mediante microscopía) y se
cultivaron en DMEM / FBS al 10%. Las colonias celulares se pudieron detectar después
de dos semanas en cultivo; después de cuatro semanas, las colonias se fijaron, se tiñeron
con Diff-Quik o α-Sca-1 seguido de un anticuerpo secundario marcado con
fluorescencia, y se tomaron imágenes.
Purificación sPDNF. El sPDNF se clonó en bacterias de expresión BL21 y se purificó
por cromatografía de afinidad con Ni como se describió anteriormente (Chuenkova y
Pereira, 2003; Chuenkova et al., 1999; Weinkauf et al., 2011). La proteína se
intercambió en tampón en PBS y se cuantificó mediante el ensayo BCA (Thermo;
Waltham, MA) según el protocolo del fabricante. El sPDNF se almacenó a 4 ° C para
uso a corto plazo (≤ 1 mes) y a -80 ° C para uso a largo plazo (> 1 mes).

Curvas de crecimiento acumulativo. Las CPC se sembraron a una densidad conocida en


medio basal o medio que contenía 4 µg / ml de sPDNF, luego se incubaron a 37 ° C /
5% de CO2 hasta casi el 100% de confluencia. Los recuentos de células se registraron
con cada pase y el crecimiento acumulado se calculó multiplicando el número de células
sembradas por la multiplicidad exhibida durante el período de crecimiento
(generalmente 1 semana).
Prueba de estrés oxidativo. Las CPC se sembraron en medio CPC durante la noche, se
trataron previamente con 300 ng / ml de sPDNF (+ sPDNF + H2O2) o vehículo PBS (+
H2O2) durante 30 minutos antes de la incubación con H2O2 1,25 mM o vehículo PBS
(vehículo) durante 3,5 horas. El porcentaje de muerte celular fue evaluado por
propidium iodide / Hoechst como se describió anteriormente (Chuenkova y
PereiraPerrin, 2004; Chuenkova et al., 2001).
Modelo de ratón de miocardiopatía de Chagas crónica (CCC). Utilizamos el modelo de
ratón de CCC descrito anteriormente por el grupo Ribeiro-dos-Santos (Soares et al.,
2004): se infectaron ratones C57BL / 6J de 8 semanas de edad con T. cruzi colombiana
(3.000 por vía intraperitoneal (IP) inyección o 1.000 por inyección intravenosa (IV));
Los controles emparejados por edad (Uninf) se inyectaron solo con PBS. A los 5 meses,
a los ratones se les inyectaron 25 µg (~ 3 mg / kg) de sPDNF IV (CCC-sPDNF) o 200
µl de vehículo PBS (CCC-Veh) a T = 0, 3 y 24 h semanalmente durante 3 semanas. La
eutanasia y la cosecha se produjeron 8 semanas después de la inyección final.
La inmunohistoquímica. Los ventrículos izquierdos (LV) del ratón se fijaron en PFA al
4% durante 24 a 48 horas, luego se enviaron al núcleo de histología de Tufts para su
seccionamiento y tinción. Los LV se cortaron en secciones transversales, luego se
tiñeron con α-CD4 o α-CD8 (eBiosciences, ahora parte de Thermo Fisher), seguido de
un anticuerpo secundario biotinilado, estreptavidina HRP y visualización de DAB. Las
imágenes de 20x (9-11 por sección) fueron capturadas y superpuestas con una
cuadrícula en ImageJ. Los campos positivos para la tinción de CD4 / CD8 se calcularon
como un porcentaje de todos los campos en la cuadrícula.
Peso del corazon Después de que los ratones fueron sacrificados, los corazones se
extirparon y se pesaron. El peso del corazón se normalizó para que la longitud de la
tibia se midiera post mortem al 0.1 mm más cercano con un calibrador digital (Fisher
Scientific).
Ecocardiografía transtorácica con electrocardiograma. La ecocardiografía se realizó a
diversos intervalos durante el curso de la infección crónica, incluso antes del
tratamiento con sPDNF, 4 semanas después del tratamiento y 8 semanas después del
tratamiento justo antes de la eutanasia. La ecocardiografía con electrocardiograma de
extremidad-plomo se realizó en un sistema de imágenes Vevo 2100 (VisualSonics;
Canadá) bajo sedación ligera con isoflurano al 2,5% por un investigador ciego. El modo
M y las imágenes bidimensionales se obtuvieron de la vista del eje corto, como se
describió anteriormente (Blanton et al., 2012). Los diámetros diastólicos finales y
sistólicos finales se midieron promediando los valores de al menos 5 ciclos cardíacos.
Cardiomiocitos de sección transversal. Los LV de ratón se fijaron en PFA al 4% durante
24 a 48 horas, luego se enviaron al Centro de histología de Tufts para su seccionamiento
y tinción. Los LV se cortaron en secciones transversales, luego se tiñeron con
hematoxilina y eosina. Los cardiomiocitos que se identificaron como células redondas
con núcleos centrales se midieron para el área utilizando el software SPOT Advanced.
Fibrosis. Los LV de ratón se fijaron en PFA al 4% durante 24 a 48 horas, luego se
enviaron al Centro de histología de Tufts para su seccionamiento y tinción. Los LV se
cortaron en secciones transversales y luego se tiñeron con Sirius Red (tinciones de
colágenos) y Fast Green (tinciones de proteínas no colágenas) para la visualización de
tejido fibrótico de alto contraste. Se capturaron imágenes cosidas de sección completa a
un aumento de 10x en un Keyence BZ-X y luego se utilizaron para cuantificar el
porcentaje de fibrosis con el analizador BZ-X (Keyence; Japón). Todas las imágenes se
capturaron al mismo tiempo utilizando configuraciones similares y se procesaron por
lotes para un análisis uniforme.
Estadística. Para la comparación entre dos grupos, utilizamos pruebas t no pareadas.
Para la comparación entre tres o más grupos, utilizamos un análisis de varianza de una
vía con la prueba post hoc de Tukey. Para los datos de EF y FS (Tabla 2), que no se
distribuyeron normalmente, utilizamos la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. Los
datos se expresan como la media ± desviación estándar a menos que se indique lo
contrario, y los valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Todos los datos se analizaron en Graph
RESULTADOS:
Resultados Los CPC de Sca-1 + se expanden en los corazones de ratones con infección
aguda por T. cruzi en una forma dependiente de parasitismo tisular Para probar los
efectos de la infección por T. cruzi en la expansión de células progenitoras en el
corazón, medimos las transcripciones de tres marcadores de células progenitoras
conocidas (Sca-1, c-kit y Musashi-1) en tejidos cardíacos de ratones en el transcurso de
una infección aguda con Cepa colombiana de T. cruzi.
Hemos observado un aumento significativo en el ARNm de Sca-1 en Ratones
infectados en relación con controles no infectados, con expresión máxima a los 18 días
despuésInfección (PI) (Fig. 1A, B). El tiempo de esta elevación de transcripción Sca-1
se correlaciona con el estableció el parasitismo máximo como se observó anteriormente
en este modelo de enfermedad de Chagasinfección aguda (Aridgides et al., 2013b), que
sugiere una relación causal entre Sca 1 niveles de ARNm y el grado de parasitismo del
tejido cardíaco. En contraste, la expresión de Los marcadores c-kit y Musashi-1 no se
vieron afectados por la infección por T. cruzi.

El aumento en el ARNm de Sca-1 en corazones con infección aguda refleja una


población de células Sca-1 + expandida, como lo revela la citometría de flujo (Fig. 1C).
Los esfuerzos subsiguientes se centraron así en las células progenitoras cardíacas (CPC)
Sca-1 +.
Para verificar que la selección positiva con el marcador Sca-1 pueda aislar de manera
confiable una población de células madre / progenitoras cardiacas, aislamos células Sca-
1 + de ratones sin tratamiento previo Corazones mediante clasificación de células
activadas magnéticamente y evaluadas para determinar su rigidez. De acuerdo con la
caracterización previa de otras células cardíacas Sca-1 + (Oh et al., 2003;
Smits et al., 2009; Valente et al., 2014; Ye et al., 2012), esta población exhibió la
potencial para diferenciarse en fenotipos definidos y la capacidad de expandirse a partir
de clones.
Específicamente, la exposición al factor de crecimiento endotelial vascular indujo la
expresión del factor de von Willebrand del marcador de células endoteliales, y el
tratamiento con 5-azacitidina indujo la expresión de la cadena pesada de la miosina
marcadora del linaje cardiomiocito (Fig. 1D). Las células también fueron clonogénicas,
mostrando la capacidad de crecer en una colonia de una sola célula (Fig. 1E).

sPDNF estimula la expansión y promueve la supervivencia de CPC in vitro e in


vivo

Para probar la hipótesis de que T. cruzi media la expansión de las células madre a través
de PDNF, estimulamos las CPC Sca-1 + cardiacas con PDNF recombinante (sPDNF).

Observamos un aumento exponencial en la población de CPC después de la


estimulación con sPDNF (Fig. 2A), un resultado reproducido en otros cuatro
experimentos (datos no mostrados).

Nuestro laboratorio ha demostrado previamente que el sPDNF protege las poblaciones


de células cardíacas (fibroblastos y miocitos) por muerte inducida por estrés oxidativo
(Aridgides et al., 2013a, 2013b). Por lo tanto, examinamos el potencial de sPDNF para
promover la supervivencia de las células progenitoras Sca-1 +. Al igual que con los
otros tipos de células cardíacas, sPDNF pudo proteger
CPC del daño inducido por el estrés oxidativo (Fig. 2B).
Para determinar la relevancia in vivo de las observaciones in vitro anteriores, a
continuación examinó los efectos de sPDNF en los niveles cardíacos de Sca-1, ya que
esto sería relevante para el crecimiento de CPC que habíamos observado con la
infección por T. cruzi (Fig. 1A, B). Para determinar si el sPDNF intravenoso (IV)
aumentaría la regulación del ARNm de Sca-1, inyectamos ratones vírgenes con el
vehículo sPDNF o PBS. El sPDNF indujo un aumento significativo, selectivo y
dependiente de la dosis en el transcrito de Sca-1 cardíaco, alcanzando un máximo de 3 h
después de la inyección (Fig. 2C, D).

Las transcripciones de otros marcadores de células madre en el mismo punto de tiempo


no se vieron afectadas por sPDNF IV (Fig. 2D), lo que concuerda con los resultados en
corazones con infección aguda (Fig. 1A).

La administración intravenosa de sPDNF estimula la proliferación de CPC en un


modelo de ratón de cardiomiopatía de Chagas crónica

En la cardiomiopatía de Chagas crónica (CCC), la carga de T. cruzi es tan baja que es


Difícil de detectar por microscopía óptica (Fig. 3A). Esto implica que, en contraste con
el período de infección aguda, los niveles tisulares de PDNF en la infección crónica
pueden ser,correspondientemente, muy bajo. Por lo tanto, hemos probado si el aumento
de PDNF en La infección crónica podría alterar el fenotipo CCC. Probamos
específicamente el efecto de la administración IV sPDNF en un modelo de ratón de
CCC. Cinco meses después de infectar ratones C57BL / 6J con T. cruzi, se administró
sPDNF IV (3 mg / kg) semanalmente durante tres semanas, con dosis administradas a T
= 0, 3 y 24 h.

Ocho semanas después de la inyección de sPDNF, tanto el ARNm de Sca-1 como la


proporción de células Sca1 + aumentaron significativamente en los corazones de
ratones CCC tratados con sPDNF (CCC sPDNF) en relación con ratones CCC
inyectados solo con vehículo PBS (CCC-Veh), o hasta la edad controles no infectados
emparejados (Uninf) (Fig. 3B, C). Este aumento en el ARNm de Sca-1 cardíaco en
ratones CCC-sPDNF se correlaciona con el patrón de elevación del ARNm de Sca-1
observado en Ratones con infección aguda por T. cruzi (Fig. 1B).

El sPDNF IV disminuye la infiltración de linfocitos T cardíacos en un modelo de


ratón de CCC

Con pruebas que demuestran que el sPDNF promueve la supervivencia y la expansión


de varios tipos diferentes de células cardíacas (Aridgides et al., 2013a, 2013b),
investigamos si el PDNF afectaría la patología cardíaca en ratones con infección
crónica. Primero examinamos la infiltración de células mononucleares, que está
asociada con daño cardíaco y muerte de miocitos (Milei y otros, 1992; Morris y otros,
1990; Reis y otros, 1993

La inmunohistoquímica (IHC) y la citometría de flujo identificaron una reducción en los


niveles de células T CD4 + y CD8 + en corazones CCC-sPDNF en relación con la
infiltración significativamente mayor observada en CCC-Veh (Fig. 4A). La citometría
de flujo corroboró los resultados de
IHC, que muestra una reducción en los linfocitos T en los corazones de ratones
inyectados con sPDNF en relación con el control (Fig. 4B), aunque la diferencia no fue
estadísticamente significativa.
La infiltración de otras poblaciones de células inflamatorias, macrófagos CD11b + y
neutrófilos Gr-1 +, no se vio afectada significativamente por la infección crónica por T.
cruzi o la inyección de sPDNF (datos no mostrados).

IV sPDNF reduce la remodelación cardíaca en un modelo de ratón de CCC

Se sabe que un aumento de la población cardíaca Sca-1 + atenúa la hipertrofia y


fibrosis en un modelo de sobrecarga por presión de la insuficiencia cardíaca (Valente et
al., 2014). Nosotros la hipótesis de que observaríamos una mejora similar de la
remodelación cardíaca, incluida la hipertrofia y la dilatación de la cámara, que son
características distintivas de la enfermedad de Chagas crónica (Morris y otros, 1990;
Rossi y Ramos, 1996).

Se evaluó la estructura y función del corazón en CCC y ratones no infectados de la


misma edad mediante ecocardiografía. En comparación con los ratones no infectados,
los ratones CCC-Veh desarrollaron diámetros diastólicos y sistólicos aumentados del
ventrículo izquierdo (LV), lo que indica una dilatación de la cámara. En contraste, los
ratones CCC tratados con sPDNF no mostraron un aumento significativo en el diámetro
del VI. Más bien, el tamaño de la cámara en los ratones inyectados con sPDNF no
difirió de los controles Uninf (Fig. 5A, B). El grosor de la pared anterior y posterior del
VI no se vio afectado (Tabla 1). El examen general de los corazones enteros extirpados
de ratones CCC reveló una reducción tamaño en corazones CCC tratados con sPDNF en
comparación con corazones CCC tratados con vehículo (Fig. 5C

Correspondiente a las medidas de la cámara ecocardiográfica. Los efectos de sPDNF en


la hipertrofia cardíaca también fueron evidentes al medir el peso del corazón
normalizado a la longitud de la tibia (HW / TL). Mientras que los corazones CCC-Veh
tenían una relación HW / TL significativamente mayoren comparación con Uninf, no
hubo diferencia entre CCC-sPDNF y Uninf (Fig. 5D). Del mismo modo, el área de la
sección transversal promedio de los cardiomiocitos de ratones CCC inyectados con
sPDNF fue significativamente menor que la de los ratones CCC-Veh (Fig. 5E).

El sPDNF IV reduce la fibrosis cardíaca y la progresión del bloqueo


atrioventricular en un modelo de ratón con CCC
El desarrollo de la fibrosis cardíaca patológica representa una característica importante
de la remodelación cardíaca (Milei et al., 1992; Morris et al., 1990; Reis et al., 1993) y
puede ser causada por la infiltración de células T del miocardio (Hanif et al., 2017; Ye
et al., 2012). Debido a que el sPDNF IV disminuyó la infiltración de linfocitos e invirtió
la hipertrofia y dilatación del VI en
En los ratones CCC, investigamos si también se reduciría la acumulación de colágeno
correspondiente y la cicatrización fibrótica. A diferencia de la fibrosis
significativamente elevada observada en CCC-Veh, los corazones de ratones CCC
inyectados con sPDNF no mostraron más fibrosis que los de Uninf (Fig. 6A).

El bloqueo auriculoventricular (AV), particularmente el bloqueo de rama derecha, es


un clásico manifestación de la miocardiopatía chagásica (Elizari y Chiale, 1993).
El electrocardiograma (ECG) reveló bloqueo AV en casi todos los ratones infectados,
desde una leve prolongación del intervalo PR hasta la disociación AV completa.
Aproximadamente ocho meses de IP, dos meses después de la finalización del período
de inyección, el ECG demostró bloqueo AV de segundo o tercer grado y la bradicardia
correspondiente en todos los ratones CCC inyectados solo con el Vehículo (Tabla 2,
Fig. 6B). Sin embargo, los ratones CCC que habían recibido sPDNF fueron En gran
parte evitado de las perturbaciones graves de la conducción: la mayoría presentaba solo
un bloqueo de primer grado, y algunos tenían trazados de ECG completamente
normales (Fig. 6C). La frecuencia cardíaca también se restauró parcialmente en CCC-
sPDNF en comparación con CCC-Veh (Fig. 6B). Este resultado se repitió en dos
cohortes de ratones CCC, cuyos resultados combinados se dan en la Tabla 2.