Universidad Autónoma de Querétaro

Facultad de Química
Alumno: Jesús Alejandro Medrano Jiménez
Laboratorio de Toxicología y Genética

Producción de un péptido de Dermaseptin recombinante en Nicotiana tabacum con actividad

antimicrobiana mejorada.
Los microorganismos patógenos en plantas reducen la calidad y rendimiento de los cultivos causando gran
daño en el sector agrícola y el uso de químicos y sus efectos en la salud humana han sido la causa de buscar
nuevas soluciones incluyendo el uso de antibióticos para el control de los patógenos. Los péptidos
antimicrobianos naturales (AMPs) han surgido como una alternativa por su baja citotoxicidad, rápida actividad
y baja masa molecular además de ser componentes integrales del sistema inmune de todo organismo vivo. Un
tipo de estas moléculas son las Demaseptinas que presentan el problema de poder cruzar la membrana e
interferir con componentes como el DNA, además, todo AMPs es vulnerable a la proteólisis dentro del citosol.
La mejor manera de producirlas es con la expresión de genes antimicrobianos en una célula hospedador. Con
el uso de cultivos transformados ‘’root’’ es posible producir proteínas recombinantes, este tipo de cultivos son
fáciles de transformar y producen metabolitos secundarios de importancia terapéutica. Durante este estudio se
busco la expresión recombinante de un tipo de dermaseptina (DrsB1) en un cultivo ‘’root’’ de tabaco para
determinar las propiedades antimicrobianas.
Para la transformación se utilizaron cepas de Nicotiana tabacum utilizando un vector de expresión con el dominio
para la expresión de la proteína Avr4 proveniente de la Cladosporium fulvum y la expresión de Drs.B1; aislando
las células con el vector durante 5 min con agitación, posteriormente se drenó con papel filtro y se incubó
durante dos días en un medio sólido MS (Murasighe-Skoog, utilizado para el crecimiento de plantas) a un pH
5.7. Las hojas se transfirieron a un nuevo medio MS conteniendo antibióticos (400 mg/L de cefotaxima y 50
mg/L de kanamicina) manteniendo a 25°C bajo fotoperiodos de luz/oscuridad de 16/8h durante dos semanas.
Las raíces formadas fueron transferidas nuevamente a un medio MS fresco cada dos semanas a 25°C en
obscuridad. Para la extracción de las proteínas recombinantes se tomaron los cuatro primeros clones
transgénicos hechos y fueron molidos y homogonizados en un buffer de fosfato de potasio 50mM (pH 7) con
inhibidor de proteseasas (PMSF) 1 mM, posteriormente se agitó utilizando vórtex durante 5 min. Los extractos
fueron centrifugados a 17949g por 30 min a 4°C y los sobrenadantes fueron filtrados con un poro de 0.45um.
Las proteínas fueron purificadas en una columna de resina Ni-IDA equilibrada con un 600 uL de buffer LEW 1X
(50mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 8) y con un buffer de elución (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM
imidazol, pH8). Para la evaluación de la actividad antimicrobiana se utilizaron medios LB esparciendo 50 uL en
placas con este medio colocando un disco de papel (6 mm diámetro) en el cultivo. Las placas se almacenaron
a 4°C por dos horas y después incubadas durante 16 h. Se utilizaron discos de 10 uL de gentamicina como
control positivo. Se obtuvo una MIC de 22.5 ug/L en el control positivo y una de 11.25 ug/L

ARTÍCULO CITADO:
Shams, M. V., Nazarian-Firouzabadi, F., Ismaili, A., & Shirzadian-Khorramabad, R. (2019). Production of a
Recombinant Dermaseptin Peptide in Nicotiana tabacum Hairy Roots with Enhanced Antimicrobial
Activity. Molecular Biotechnology. doi:10.1007/s12033-019-00157-

Se etiquetaron Se prepararon 200 Se preparó un medio LB Se añadió el agar LB en cada

40 cajas Petri ug/uL de agregando en un matraz placa. Además de ampicilina
como: 16 ‘’LB’’, arabinosa y 10 500 mL de agua con 10g en las ‘’LB/amp’’ la
16 ‘’LB/amp’’ y 8 ug/uL con H2O del agar, se agitó y arabinosa en ‘’LB/amp/ara’’
‘’LB/amp/ara’’ para rehidratarlas calentó hasta ebullición. y se dejaron solidificar.

Se situó la Con un asa estéril se tomó Se añadió con una Se rotularon 2

solución del una colonia de E. Coli e pipeta estéril 250 uL tubos eppendorf
plásmido pGLO introdujo en el tubo de la solución CaCl2 como ‘’+pGLO’’ y
bajo luz UV y se ‘’+pGLO’’, se dejó en hielo. Se 50 mM a cada tubo y otro como ‘’-pGLO’’
observó. repitió con el tubo ‘’-pGLO’’ se colocaron en hielo.

Se rotularon 4 placas
Con una micropipeta se Se incubaron
del agar LB como: Pasados los 10 min.
añadieron y mezclaron 10 uL ambos
+pGLO LB/amp se llevaron los
de la solución de plásmido en eppendorf en
+pGLO LB/amp/ara tubos a baño maría
el tubo ‘’+pGLO’’. Se regreso hielo durante
-pGLO LB/amp a 42°C por 1 min.
el tubo al hielo 10 min
-pGLO LB/amp

Utilizando un asa estéril Pasar 100 uL de cada Sacar los tubos y Inmediatamente se
extender la suspensión tubo a las placas añadir 250 uL de llevaron los tubos al
desde el centro de la placa correspondientes caldo LB a cada uno. hielo para choque
hasta los bordes exteriores (+pGLO o -pGLO) Mezclas e incubar a T térmico y se
en forma de 4 cuadrantes ambiente por 10 min. dejaron 2 min.

Apilar placas, Después de 24

empaquetar e incubar h. observar
en posición invertida placas bajo luz
en estufa a 37°C UV y observar.