Técnicas de screening o rastreo para el análisis

de drogas en matrices biológicas

Inmunoensayos

Origen

Década 50

Cuantificación de AC en pacientes diabéticos con respuesta inmune a

la insulina bovina.

Se utilizo 131I para cuantificar la cantidad de insulina marcada unida a

la inmunoglobulina

Luego se utilizo para la cuantificación de diversas hormonas

1º técnica de inmunoensayo fue RIA

INMUNOLOGÍA BÁSICA

ANTIGENO LINFOCITO ANTICUERPO

Respuesta primaria IgM

ANTICUERPO
Respuesta secundaria > cant.
IgG

IgG uso en inmunoensayos

IgG conc. máxima 14 días después de exposición al antígeno

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FUNDAMENTO DE LOS INMUNOENSAYOS

Todos se basan en la interacción

antígeno – anticuerpo y el proceso de
enlace competitivo.

Enlace competitivo: dos diferentes

sustancias (antígeno y antígeno marcado),
compiten por los mismos sitios de unión en
los anticuerpos

Enlace Competitivo

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 CARACTERISTICAS PARA LA UNIÓN ESPECIFICA
ANTICUERPO – ANTÍGENO

a) Composición molecular del antígeno

b) Orientación espacial de las moléculas

DROGAS
Como fabricar un antígeno para una droga especifica?

La mayoría son pequeñas moléculas con PM < 2000 Da sin

capacidad antigénica. Ej: Anfetamina PM: 135 Da

Entonces que hacer?

Molécula pequeña+Macromolécula=propiedades Antigénicas

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 CONJUGACION de DROGAS a MACROMOLECULAS

1.- Creación de un intermediario reactivo

Depende del sitio de reactividad de la droga
Ej: Grupos reactivos: - OH ; - CO ; - CHO
Droga – OH hemisuccinato
Droga – CO oxima
Droga – CHO oxima

Si la droga contiene un grupo NH2, este puede ser conjugado

directamente a la proteína

2.- Conjugación del intermediario reactivo con proteínas

Albúminas: BSA (Bovine Serum Albumine)

HSA (Human Serum Albumine)

Macromoléculas: KHL (Key-Hole Limpet Hemocyanin)

Poli-L-lisina
Tiroglobulina

Oxima
Hemisuccinato de la droga (hapteno) + proteína inmunógeno

3.- Producción del anticuerpo

inmunógeno inmunización Anticuerpo (IgG)

de animales

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 PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES Y
MONOCLONALES

Policlonales: Se producen en animales , la amplia variedad de

anticuerpos producidos tendrá diferente afinidad / especificidad por
el compuesto de interés. Estos AC además puede diferir en las
partes del compuesto que ellos reconocen

Monoclonales: Producción in vitro de un Hibridoma, el anticuerpo

producido será muy especifico para la droga.

ENLACE ESPECIFICO ANTICUERPO ANTÍGENO

Especificidad: Capacidad del ensayo de detectar

únicamente el compuesto de interés.

Reacciones cruzadas: grado de respuesta de un

inmunoensayo a una sustancia diferente al analito de
interés.

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6
 COMPUESTOS MARCADOS
Características:

1.- Inmunologicamente similares al compuesto problema, para

que compitan por los sitios de unión de los anticuerpos.

2.- Los marcadores deben detectarse sin que haya

interferencias de la matriz biológica.

MARCADORES O TRAZADORES

Moléculas radioactivas, fluorescentes, enzimas o

micropartículas que se unen al compuesto de interés.
La molécula marcada se agrega a la mezcla reactiva en el
ensayo y los cambios asociados al marcador se usan para medir
la cantidad de compuesto marcado enlazado.

CLASES DE INMUNOENSAYOS

Heterogéneos: Inmunoensayo que requiere la separación del

antígeno libre y el enlazado antes de medir el antígeno
marcado.
Homogéneos: Inmunoensayo que permite la medición directa
del antígeno marcado sin separar el antígeno unido del
antígeno libre.

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 TÉCNICAS DE INMUNOENSAYO

RIA: Radio Immuno Assay

EMIT: Enzyme – Multiplied Immunoassay
FPIA: Fluorescence Polarization Immunoassay
CEDIA: Cloned Enzyme Donor Immunoassay
KIMS: Kinetic Interaction of Microparticles In
Solution
ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent assay

FPIA (TDx, Adx, Axysm)

Ventajas: Ensayo homogéneo, el complejo droga-F

es más estable que el de droga-Enzima, LDD bajo,
efecto matriz pequeño , larga duración de los
reactivos ( > 1 año).
Desventajas: Más costosa que los ensayos
enzimáticos, fluorescencia de las sales biliares
(falsos positivos).

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 FUNDAMENTO ELISA

Enzima (peroxidasa del rábano)

Sustrato TMB (Tetrametilbenzidina)

Producto coloreado (azul) λ 450 nm

ELISA

Ventajas: el de menor LDD, menos efecto matriz

con el lavado (heterogéneo) , fácil de automatizar,
larga duración de los reactivos (>1 año).
Desventajas: Azida de sodio bloquea la actividad
de la peroxidasa. Costo por muestra es mas alto
que para un ensayo homogéneo.

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 INMUNOCROMATOGRAFÍA

Enlace competitivo entre la droga y/o metabolito presente en la

muestra y la droga conjugado inmovilizada en la zona test por el
anticuerpo-colorante que está en la membrana soporte.

Pasos:
1) Colocar la orina en la zona de la muestra (S), se deja migrar hacia
arriba. Esperar 5 minutos.

2) Si hay droga presente en la muestra, la droga se une al conjugado ANTICUERPO-

colorante y lo satura, se bloquea así la formación del enlace del conjugado con la
droga marcada que está en la membrana en la zona test y no se forma la línea
púrpura, por lo tanto el ensayo es positivo.
Si no hay droga, el conjugado ANTICUERPO-colorante se une con la droga de la zona
test formando una línea púrpura en la zona test (T) y el ensayo es negativo.

Diagrama de las zonas de una

inmunocromatoplaca

Droga conjugada con proteína

Anticuerpo con micro esferas coloreadas

Anticuerpo control

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 Esquema de un ensayo negativo

Droga conjugada a proteína

Anticuerpo con micro esferas coloreadas

Anticuerpo control

Esquema de un ensayo positivo

Droga

Anticuerpo con micro esferas coloreadas

Anticuerpo Control

Interferencia por adulterantes viscosos

Droga

Anticuerpo Control

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