AVANCES DE CLONACIÓN IN VITRO DE ÁRBOLES ADULTOS DE RAULÍ
(Nothofagus alpina Poepp. et Endl.) Oerst.) PARA PROPAGACION COMERCIAL
IN VITRO CLONING ADVANCES OF ADULT TREES OF RAULI (Nothofagus alpina
Poepp. et Endl.) Oerst) TREES FOR COMMERCIAL PROPAGATION
Ana M. Sabja1*, Oriana Ortiz2 y Claudia Triviño3
1
Fundación Chile, casilla 567, Valdivia, Chile. (asabja@uach.cl). 2INFOR, Casilla 109 C, Concep-
ción, Chile. (oortiz@infor.cl). 3GENFOR S.A, Casilla 567, Valdivia Chile, (ctrivino@uach.cl)
RESUMEN
Raulí, Nothofagus alpina (= N. nervosa) es una especie nativa
con potencial comercial en Chile. En el presente trabajo se des-
cribe el procedimiento para establecer in vitro fenotipos adultos
de raulí de dos orígenes: terreno e injerto cultivados in vitro por
periodos de varios años y producir plantas de tamaño y forma
adecuada para usar a escala comercial. Se discuten los resulta-
dos obtenidos en la fase de enraizamiento, donde esta especie
mantenida en cultivo in vitro en concentración constante de BAP
(0.125 mg L−1) se propaga sin declinar el potencial de
enraizamiento después de varios años de subcultivos sucesivos en
laboratorio. Para evaluar el potencial rizogénico en el tiempo se
aplicaron dos tratamientos: enraizamiento de brotes después de
un año del inicio del establecimiento in vitro y cuatro años des-
pués de subcultivos sucesivos. No hubo diferencias significativas
en los porcentajes de enraizamiento entre ambos tratamientos y
orígenes. La posibilidad de mantener el potencial rizogénico de
una especie cultivada in vitro por períodos prolongados es una
ventaja para implementar un programa de producción clonal de
plantas a gran escala mediante técnicas de micropropagación.
Key words: Raulí, micropropagación, cultivo in vitro
INTRODUCCIÓN
L
as plantaciones forestales tienen una función
creciente en el abastecimiento futuro de la in-
dustria forestal mundial y liberan presión sobre
el uso maderero de los bosques naturales. Al respecto,
Sedjo (1997) destacó el aporte de las innovaciones en
genética y biotecnología para obtener árboles de buen
crecimiento y con características deseadas. Sin embar-
go, la concentración de la producción industrial en
plantaciones forestales con unas pocas especies plantea
el desafío de la diversificación con nuevas especies
para asegurar una producción forestal sostenible.
Entre las especies con potencialidad de uso comer-
cial por su rápido crecimiento y calidad y uso de la
* Autor responsable v Author for correspondence.
Recibido: Noviembre, 2007. Aprobado: Abril, 2008.
Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 42: 595-603. 2008.
595
ABSTRACT
Rauli, Nothofagus alpina (= N. nervosa) is a species native to
Chile with commercial potential. This study describes the
procedure for in vitro establishment of adult phenotypes of rauli
from two sources, field and graft, cultivated in vitro for periods
of several years to produce plants of adequate size and form for
commercial scale use. We discuss the results obtained in the
rooting phase. The species kept in in vitro culture with constant
concentration of BAP (0.125 mg L−1) propagates with no decline
in rooting potential after several years of successive subcultures
in the laboratory. To evaluate rhizogenic potential over time,
two treatments were tested: shoot rooting one year after
establishment in vitro and four years of successive subcultures.
No significant differences in percentages of rooting were found
for treatments or sources. The possibility of maintaining rhizogenic
potential of a species cultivated in vitro for prolonged periods is
an advantage in implementing a program of large-scale production
of clones using micropropagation techniques.
Key words: Rauli, micropropagation, in vitro culture.
INTRODUCTION
F
orest plantations have a growing role in the future
supply of the world forest industry, freeing
natural forests from pressure exerted by timber
extraction. In this respect, Sedjo (1997) highlights the
contribution of genetics and biotechnology in obtaining
trees with desired characteristics that grow well.
However, the concentration of a few species for
industrial production in forest plantations raises the
challenge of diversification with new species to assure
sustainable forest production.
Among the fast-growing, quality wood species with
potential for commercial use is rauli, (Nothofagus alpina
(Nothofagus procera (Poepp. Et Engl.) Oerst =
Nothofagus nervosa (Phil.) Krasser, one of the main
species of its genus. The tree is endemic to the
subantarctic forests of Chile and Argentina, growing
on mountainsides at intermediate altitudes between 300
and 1200 m in deep well-drained soils (Hoffmann,
AGROCIENCIA, 1 de julio - 15 de agosto, 2008
madera está el raulí, Nothofagus alpina (Nothofagus
procera (Poepp. et Endl.) Oerst =. Nothofagus nervosa
(Phil.) Krasser, una de las principales especies de su
género. Árbol endémico de los bosques subantárticos
de Chile y Argentina, crece en las laderas de las mon-
tañas, a altitudes intermedias entre 300-1 200 m, en
suelos profundos con buen drenaje (Hoffmann, 1982).
En Chile, las plantaciones con especies nativas se ini-
cian desde semillas sin ninguna mejora genética y en
algunos casos mediante semillas depuradas obtenidas
del programa de mejoramiento genético para raulí. Sin
embargo, los niveles de producción de semillas tienen
fluctuaciones anuales que corresponden a patrones cí-
clicos de variación en la especie (Gutiérrez, 2000; Ipinza
y Espejo, 2000). Para aumentar la productividad del
recurso y obtener un beneficio sostenible, se enfatiza
la aplicación de herramientas de mejoramiento genético
junto con técnicas biotecnológicas y silvícolas en la
propagación de esta especie (Kleinschmit et al., 1993).
Las estrategias de mejoramiento de especies forestales
incorporan técnicas de propagación asexual como la
macropropagación (mediante injerto y estaca) y la
micropropagación que permiten transferir toda la
varianza genética a los descendientes, duplicando la
ganancia genética asociada a los esquemas sexuales de
propagación (Ikemori et al., 1994).
La macropropagación por estacas se aplica sólo en
material juvenil de raulí, ya que luego pierde esa capa-
cidad de enraizar (Ortiz y Gutiérrez, 2005). La
micropropagación vía organogénesis directa se usa en
la producción comercial de diversas especies forestales
por la alta capacidad de multiplicación, reversión,
mantención del estado juvenil y producción de plantas
con buena estructura radicular, lo que permite una sil-
vicultura altamente productiva (Ahuja, 1997; MacRae
y Cotterill, 1997; Smith 1997). En especies de
Nothofagus la organogénesis directa se inicia con tro-
zos de tejidos, yemas, secciones nodales y axilares
obtenidos de plantas juveniles y adultas y se ha defini-
do el estadio óptimo de los brotes y yemas a propagar
(Martínez Pastur et. al., 1997a); la embriogénesis
somática utiliza semillas como explante inicial (Caste-
llanos et al., 2005). En el cultivo de estos tejidos se
emplean los medios nutritivos Broadleaved Tree
Medium (BTM), Murashige y Skoog (MS), modifica-
do en las concentraciones de los macronutrientes, y
Woody Plant Medium (WPM) con bajas concentracio-
nes salinas, aminoácidos, reguladores de crecimiento
y vitaminas (Martínez Pastur y Arena, 1995; Jordán
et. al., 1996). El enraizamiento se ha realizado con
éxito en oscuridad, distintos tipos y concentraciones
de auxinas y aclimatación gradual en invernadero
(Martínez Pastur y Arena, 1996; Martínez Pastur et.
al., 1997b).
596 VOLUMEN 42, NÚMERO 5
1982). In Chile, native species are planted from seed
with no genetic improvement. Rauli, in some cases, is
planted from selected seeds obtained from the rauli
genetic improvement program. However, seed
production has yearly fluctuations that correspond to
the species’cyclic patterns of variation (Gutiérrez, 2000;
Ipinza and Espejo, 2000). To increase productivity of
the resource and to obtain sustainable benefits,
application of genetic improvement tools, together with
biotechnological and silvicultural techniques, for the
propagation of this species (Kleinschmit et al., 1993),
is emphasized. Improvement strategies of forest species
incorporates both asexual propagation techniques:
macropropagation (grafting and rooting) and
micropropagation, with which all the genetic variance
is transferred to descendants, thus duplicating genetic
gains associated with sexual propagation schemes
(Ikemori et al., 1994).
Macropropagation by cuttings is applied only in
young rauli material since at later ages it losses rooting
capacity (Ortiz and Gutiérrez, 2005). Micropropagation
via direct organogenesis is used in the commercial
production of diverse forest species because of its
capacity for multiplication, reversion, maintenance of
the juvenile stage and production of plants with good
root structure, leading to highly productive silviculture
(Ahuja, 1997; MacRae and Cotterill, 1997; Smith
1997). In Nothofagus species, direct organogenesis
begins with portions of tissues, buds or node and axillary
sections obtained from young or adult plants; the optimal
state of shoots and buds to be propagated has been
defined (Martínez Pastur et al., 1997a). Somatic
embryogenesis uses seeds as initial explants (Castellanos
et al., 2005). In the culture of these tissues the following
nutrient mediums were used: Broadleaved Tree Medium
(BTM), Murashige and Skoog (MS) modified in
macronutrient concentrations, and Woody Plant Medium
(WPM) with low salt concentrations, amino acids,
growth regulators, and vitamins (Martínez Pastur and
Arena, 1995; Jordán et al., 1996). Rooting has been
achieved in darkness, different types and concentrations
of auxins, and gradual acclimation in greenhouse
(Martínez Pastur and Arena, 1996; Martínez Pastur et
al., 1997b).
However, previous studies have not considered a
number of trees sufficient to permit continuous
evaluation of the behavior of different phenotypes in a
process of commercial-scale production. Therefore, the
objective of this study was to contribute to the
diversification of plantations in Chile with a
commercially promising native species by evaluating,
using micropropagation techniques, the morphogenic
capacity of a considerable number of adult rauli
phenotypes of field-grown and grafted plants established
 AVANCES DE CLONACIÓN IN VITRO DE ÁRBOLES ADULTOS DE RAULÍ (Nothofagus alpina Poepp. et Endl.) Oerst.)
Sin embargo, los estudios anteriores no han consi-
derado un número suficiente de árboles que permita
evaluar el comportamiento de distintos fenotipos en un
proceso de producción a escala comercial de manera
continua. Por tanto, el objetivo del presente trabajo
fue contribuir a la diversificación de las plantaciones
con una especie nativa de Chile con potencial comer-
cial, mediante técnicas de micropropagación, evaluan-
do la capacidad morfogénica de un número considera-
ble de fenotipos adultos de raulí establecidos in vitro
de dos orígenes, terreno e injerto, por 4 años de culti-
vo in vitro. Como objetivo específico se evaluó el po-
tencial rizogénico en el tiempo, brotes enraizados des-
pués de uno y cuatro años del establecimiento in vitro,
así como el procedimiento para producir plantas
plantables.
MATERIALES Y MÉTODOS
Selección del material vegetal y establecimiento
El material vegetal a micropropagar correspondió a 126 árboles
de raulí de 40 a 100 años de edad. Los árboles localizados en toda el
área de distribución natural de la especie (35° a 41° S), fueron
seleccionados fenotípicamente con base a la rectitud y volumen, con
una intensidad de selección promedio de un árbol cada 50 ha, por las
instituciones Corporación Nacional Forestal, Instituto Forestal, Com-
plejo Maderero Panguipulli y Universidad Austral de Chile, con
proyectos financiados por la Corporación de Fomento (CORFO) y la
Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) de Chile.
El material vegetal óptimo para el inicio del cultivo in vitro de
raulí adulto corresponde a brotes apicales de yemas en desarrollo.
Sin embargo, dado que este material vegetal se obtiene en primavera
(inicio de crecimiento vegetativo), para avanzar en esta investiga-
ción, los primeros cultivos se hicieron en verano usando brotes apicales
de siete árboles (fenotipos) adultos injertados en plantas juveniles y
mantenidos en invernadero. En la práctica, el uso de esta metodolo-
gía es cara pues demanda un número inicial alto de injertos para
obtener una cantidad adecuada de brotes apicales. Por esta razón se
decidió usar brotes de ramas recolectadas en terreno de 119 árboles
adultos seleccionados a inicios de primavera, al término del periodo
de receso vegetativo de la especie. Las ramas recolectadas (longitud
30 a 40 cm) fueron llevadas al laboratorio, donde se sumergieron
20 min en una solución de Captan 80WP (Cis-N-((triclorometil)tio)-
4 ciclohexen-1, 2-dicarboxamida), 1g L−1; las ramas fueron enjua-
gadas en agua potable y forzadas a brotar en un ambiente controlado
(22±2 °C; humedad 80%; fotoperíodo16 h luz). Los brotes apicales
cosechados (1-2 cm longitud), con uno a dos pares de hojas, fueron
desinfectados 10 min en una solución al 10% (v/v) de hipoclorito de
sodio comercial, más dos gotas L−1 de Tween 20®, más cuatro en-
juagues sucesivos en agua destilada estéril por 4 min. Todo el proce-
so fue con agitación constante dentro de la cámara de flujo laminar.
Inmediatamente los brotes se cultivaron en medio nutritivo Broad-
leaved Tree Medium (Chalupa, 1983), con un suplemento 3% de
and cultured in vitro for four years. As a specific
objective, rhizogenic potential over time was evaluated
on rooted shoots after one and four years of in vitro
growth, as well as the procedure for producing plantable
plants.
MATERIALS AND METHODS
Selection and establishment of plant material
The plant material to be micropropagated was selected from
126 rauli trees 40 to 100 years old. The trees located throughout the
species natural distribution (35° to 40° S) were selected phenotypically
based on straightness and volume by the institutions Corporación
Nacional Forestal, Instituto Forestal, Complejo Maderero Panguipulli,
and the Universidad Austral de Chile, through projects funded by
the Corporación de Fomento (CORFO) and the Comisión Nacional
de Ciencia y Tecnología (CONICYT) of Chile. Average selection
intensity was one tree per 50 ha.
Optimal plant material for in vitro culture of adult rauli is apical
shoots from developing buds. However, since this plant material is
obtained in the spring (beginning of vegetative growth); in order to
advance this study, the first cultures were done using apical shoots
from seven adult trees (phenotypes) grafted on young plants and
kept in a greenhouse. In practice, the use of this method is expensive
since it requires a high initial number of grafts to obtain enough
apical buds. For this reason, we decided to use sprouts from branches
collected in the field from 119 adult trees selected in early spring at
the end of the plant dormant period. The collected branches (30 to
40 cm long) were taken to the laboratory where they were immersed
for 20 min in a 1 gL−1 solution of Captan 80WP (Cis-N-
((trichloromethyl)tio)-4 cyclohexen-1,2-dicarboximide). The branches
were rinsed in potable water and forced to sprout in a controlled
environment (22±2 °C; 80% relative humidity; 16 h light
photoperiod). The harvested apical shoots (1-2 cm long), with one to
two pairs of leaves, were disinfected 10 min in a 10% (v/v) solution
of commercial sodium hypochlorite, plus two drops L−1 of Tween
20TM and rinsed four times successively in sterile distilled water for
4 min. The entire process was done under constant shaking inside a
laminar flow chamber. The shoots were immediately cultivated in a
Broad-leaved Tree Medium (Chalupa, 1983) with a 3% supplement
of sucrose (Merck), 0.125 mg L−1 6-benzylaminopurine (BAP,
Sigma), Murashige and Skoog vitamins, 2 mg L-1 glutamine (Sigma),
2.3 g L−1 GelriteTM (Sigma); pH was adjusted to 5.7. Explants were
maintained in an incubation chamber (22±2 °C, 16 h photoperiod)
for 30 d.
Shoot multiplication
The shoots from the explants were transferred to a fresh BTM
medium every 21 d using the same hormone concentration as the
previous stage, but reducing the sucrose concentration to 2%. The
number of shoots from explants was determined monthly for one
year.
SABJA et al. 597
AGROCIENCIA, 1 de julio - 15 de agosto, 2008
sacarosa (Merck), 0.125 mg L−1 de 6-benzilaminopurina (BAP;
Sigma), vitaminas de Murashige y Skoog, 2 mg L−1 de glutamina
(Sigma), 2.3 g L−1 de Gelrite® (Sigma); el pH se ajustó a 5.7. Los
explantes se mantuvieron 30 d en una cámara de incubación a
22±2 °C, con un fotoperíodo de 16 h.
Multiplicación de brotes
Los brotes originados de los explantes fueron transferidos a
medio nutritivo fresco BTM cada 21 d, usando la misma concentra-
ción hormonal de la etapa anterior pero reduciendo la concentración
de sacarosa al 2%. El número de brotes originados desde un explante
fue contabilizado mensualmente durante un año.
Enraizamiento
Se emplearon 35 fenotipos para evaluar la etapa de enraizamiento
después de un año (año 1) y cuatro años (año 2) del cultivo in vitro,
para determinar si el potencial de enraizamiento decrece con
subcultivos sucesivos. Para ello 16 110 brotes apicales (2-3 cm lon-
gitud) con dos pares de hojas fueron cultivados en medio BTM con
los macronutrientes diluidos en 50% (p/v), vitaminas de Murashige
y Skoog, 0.12mg L−1 de ácido indol 3-butírico (AIB; Sigma), 15%
sacarosa (Merck), 2.3 g L−1 de Gelrite® (Sigma); el pH se ajustó a
5.7. Los explantes fueron colocados 7 d en oscuridad, luego un
fotoperíodo de 16 h luz por 18 d y se traspasaron a la etapa de
acondicionamiento en laboratorio.
Acondicionamiento y pre-aclimatación
en laboratorio
Para evitar las condiciones de estrés observadas al transferir
plantas micropropagadas a invernadero, se acondicionaron previa-
mente en laboratorio: los brotes enraizados en sustrato fueron culti-
vados tres semanas en envases con un filtro en la parte superior que
permite intercambio gaseoso. Se adicionó medio líquido BTM esté-
ril, diluido a 25% (v/v), al sustrato de turba y perlita (1:3).
Aclimatación en invernadero
Luego del acondicionamiento en laboratorio, las plantas fue-
ron trasladadas a invernadero y colocadas en tubetes circulares
(120 cm3) con sustrato de turba y perlita (1:3) y Osmocote® 15-9-12,
en dosis de 5 kg m−3. La humedad fue 90% por una semana bajo
túnel de plástico, la que gradualmente (tres semanas) se redujo hasta
condiciones ambientales normales.
Análisis estadístico
Para evaluar el potencial rizogénico en el tiempo se usaron dos
tratamientos de enraizamiento de brotes. La unidad experimental
fue el fenotipo de dos orígenes: material adulto de injerto y material
adulto de terreno. Los tratamientos fueron los dos períodos de tiem-
po para el enraizamiento: año 1 (después de un año de cultivo in
598 VOLUMEN 42, NÚMERO 5
Rooting
Thirty-five phenotypes were used to evaluate the rooting stage
after one year (year 1) and four years (year 2) of in vitro culture to
determine whether rooting potential decreases with successive
subcultures. A total of 16 110 apical sprouts (2-3 cm long) with two
pairs of leaves were cultured in BTM medium with diluted (50% p/v)
macronutrients, Murashige and Skoog vitamins, 0.12 mg L−1 indol
3-butiric acid (IBA; Sigma), 15% sucrose (Merck), 2.3 g L−1
GelriteTM (Sigma); pH was adjusted to 5.7. Explants were kept in
darkness for 7 d and later with a photoperiod for 16 h light for 18 d;
they then passed to the stage of conditioning in the laboratory.
Laboratory conditioning and pre-acclimatation
To prevent symptoms of stress normally observed when
micropropagated plants are transferred to a greenhouse, they were
previously conditioned in the laboratory: shoots rooted in a substrate
were cultured three weeks in vessels with a filter in the upper part to
permit gas exchange. Sterile BTM liquid medium diluted to 25% (v/v)
was added to peat-perlite (1:3) substrate.
Acclimatation in the greenhouse
After conditioning in the laboratory, the plants were taken to
the greenhouse and placed in circular tube containers (120 cm2) with
peat-perlite (1:3) substrate and OsmocoteTM 15-9-12 at a dosage of
5 kg m−3. Humidity was 90% under a plastic tunnel for one week
and was gradually (three weeks) reduced until it reached normal
environment conditions.
Statistical analysis
To assess potential rhizogenic potential over time, two shoot
rooting treatments were used. The experimental unit was phenotype
from two sources: grafted adult material and land-grown adult
material. The treatments were two time periods for rooting: year 1
(after one year of in vitro culture) and year 2 (four years of
multiplication in vitro). With the rooting results, a one-way analysis
of variance was performed by treatment, and treatment means were
compared with the Tukey test (p≤0.05).
RESULTS AND DISCUSSION
Selection and establishment of plant material
The use of a considerable number of phenotypes
allowed us to define the behavior of the plant material
in vitro. From the 126 adult rauli trees or phenotypes,
and using two sources (apical shoots from grafts and
apical shoots from field-grown plants) 47 phenotypes
(37%) were established in vitro, of these seven were
from grafted adult phenotypes and 40 from field-grown
adult phenotypes (Figure 1A). Apical shoots were very
 AVANCES DE CLONACIÓN IN VITRO DE ÁRBOLES ADULTOS DE RAULÍ (Nothofagus alpina Poepp. et Endl.) Oerst.)

vitro) y año 2 (cuatro años de multiplicación in vitro). Con los
resultados de enraizamiento según tratamientos se hizo un análisis
de varianza de una vía y las medias entre tratamiento se compararon
con la prueba de Tukey (p≤0.05).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Selección del material vegetal y establecimiento
El uso de un número considerable de fenotipos per-
mitió definir el comportamiento del material vegetal
cultivado in vitro. A partir de 126 árboles o fenotipos
adultos de raulí y usando dos orígenes (brotes apicales
de injerto y brotes apicales de terreno) se establecieron
in vitro 47 fenotipos (37%), de los cuales siete prove-
nían de fenotipos adultos injertados y 40 de fenotipos
adultos de terreno (Figura 1A). Los brotes apicales
eran muy heterogéneos entre fenotipos en tamaño y
expansión foliar, aspecto determinante en la oxidación
del tejido de raulí y de otras especies de Nothofagus
(Martínez Pastur et al., 1995), lo que condicionó que
solo 47 fenotipos se establecieron in vitro.
Multiplicación de brotes
En explantes provenientes de injertos de material
adulto, las respuestas de multiplicación de brotes se
heterogeneous among phenotypes in size and foliar
expansion, a determinant aspect in tissue oxidation of
rauli and other Nothofagus species (Martínez Pastur et
al., 1995); this determined establishment of only 47
phenotypes in vitro.
Shoot multiplication
Shoot multiplication response was observed in the
seven phenotypes (Figure 2) of explants from grafted
adult material. Their multiplication rate fluctuated
between 1:1 and 1:2 shoots per explant after two
months, reaching 1:2 to 1:62 shoots after 12 months of
in vitro culture. Some phenotypes showed better capacity
for inducing axillary buds, such as phenotypes 43 and
23, which produced more than 50 shoots per explant
12 months after culture initiated.
The shoot multiplication response of 13 field-grown
adult phenotypes is described. After two months culture,
the rate of shoot multiplication was 1:1 to 1:12, and
after 12 months it was 1:1 to 1:230, depending on the
phenotype. In phenotypes 141 and 120, more than 100
shoots per explant were obtained (Figure 3). Martínez
Pastur and Arena (1996) report similar results, 1:7 to
1:11 after two months of culture using young material.
These good results are due to previous experience with
cultured material from grafting in a greenhouse.

A B C

D E F

Figura 1. Etapas del proceso de micropropagación de raulí. A) explante inicial: brotes apicales; B) multiplicación de brotes; C) etapa de
pre-aclimatación en laboratorio; D) plantas a transferir a invernadero; E) plantas bajo túnel plastificado en invernadero para
mantener alta humedad; F) plantas después de tres meses en invernadero.
Figure 1. Stages of the rauli micropropagation process. A) initial explant: apical shoots, B) shoot multiplication; C) laboratory pre-
acclimatation stage; D) plants to be transferred to the greenhouse; E) plants under plastic tunnel in greenhouse to maintain
high humidity; F) plants after three months in greenhouse.

SABJA et al. 599

 AGROCIENCIA, 1 de julio - 15 de agosto, 2008
observan en los siete fenotipos (Figura 2). Su tasa de
multiplicación fluctuó entre 1:1 a 1:2 brotes por explante
a los dos meses, alcanzando 1:2 a 1:62 brotes a los 12
meses del cultivo in vitro. Algunos fenotipos mostraron
una mejor capacidad de inducir brotes axilares, como
los fenotipos 43 y 23 que alcanzan más de 50 brotes por
explante a los 12 meses del inicio del cultivo.
La respuesta en multiplicación de brotes en fenotipos
adultos de terreno se describe en 13 de ellos, con una
tasa de 1:1 a 1:12 brotes originados por explante a los
dos meses de cultivo y 1:1 a 1:230 brotes después de
12 meses, dependiendo del fenotipo. En los fenotipos
141 y 120 se obtuvieron más de 100 brotes por explante
(Figura 3). Martínez Pastur y Arena (1996) señalan
resultados similares: 1:7 a 1:11 al cabo de dos meses
de cultivo usando material juvenil. Este buen resultado
se debe al conocimiento adquirido previamente en el
cultivo del material de injerto de invernadero.
En ambos casos, material adulto de injerto y mate-
rial adulto de terreno, durante los primeros meses de
cultivo los explantes presentan una baja proliferación
de brotes. Pero al subcultivarse y estabilizarce se al-
canzan niveles interesantes de multiplicación, es decir
se requieren 12 meses para alcanzar tasas de propaga-
ción adecuadas (Figura 1B). En esta especie hubo un
efecto positivo de los subcultivos sucesivos en medio
con reguladores de crecimiento, respecto a otras espe-
cies que pierden la capacidad morfogénica de los teji-
dos (Vieitez et al., 1985).
Enraizamiento
No hubo diferencias significativas entre los por-
centajes de enraizamiento (Figura 4) obtenidos en el
año 1 (un año del cultivo in vitro) y en el año 2 (cuatro
70
3 250
Promedio de brotes por explante
60 23
38
50 43
53
40 55
58
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Mes
Figura 2. Tasa de multiplicación de brotes en siete fenotipos ini-
ciados a partir de injerto de material adulto y evalua-
dos durante 12 meses.
Figure 2. Rate of shoot multiplication of seven phenotypes from
grafted adult material and evaluated during 12 months.
600 VOLUMEN 42, NÚMERO 5
In both cases, during the first months of culture
adult grafted material and adult field-grown material
had low rates of shoot proliferation. But with subcultures
and after stabilization, they reached interesting levels
of multiplication; that is, 12 months are required to
achieve acceptable levels of propagation (Figure 1B).
In this species, there was a positive effect of successive
subcultures in medium with growth regulators,
compared with others species, whose tissues lose their
morphogenic capacity (Vieitez et al., 1985).
Rooting
There were no significant differences between
percentages of rooting (Figure 4) obtained in year 1
(one year in vitro culture) and year 2 (four years in
vitro culture). This indicates that successive subcultures
in nutritive media with the constant concentration of
BAP used did not significantly affect rooting potential
over time. This contrasts with Castanea sativa and
Eucalyptus sp., whose response decreases during the
rhizogenic process (Ríos et al., 2005, Gómez et al.,
2007).
In the analysis of the results of rooting for year 1
and year 2, differentiated by origin of the phenotype
(adult graft and adult field), no significant differences
were found (Figure 5).
The phenotypes differentiated by source for
percentage of rooting obtained in year 2 were classified,
and a variation (40 and 90%) in rhizogenic responses
was found among phenotypes. Besides, most of the
phenotypes decreased percentage of rooting during year
2, relative to year 1. However, as mentioned above,
the average rooting percentage of the clones analyzed
per year did not exhibit significant differences (Figures
4 and 5).
10 88
Promedio de brotes por explante
11 93
200 12 120
33 121
37 131
150
40 141
44
100
50
8 9 10 11 12 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Mes
Figura 3. Tasa de multiplicación de brotes en 13 fenotipos adul-
tos de terreno evaluados durante 12 meses.
Figure 3. Rate of shoot multiplication of 13 field-grown adult
phenotypes evaluated during 12 months.
 AVANCES DE CLONACIÓN IN VITRO DE ÁRBOLES ADULTOS DE RAULÍ (Nothofagus alpina Poepp. et Endl.) Oerst.)

100 Laboratory conditioning and pre-acclimatation

80 Laboratory conditioning (Figures 1C and D)

Enraizamiento (%)

enhanced increases in leaf area and apex and root

60
elongation before transferring plants to the greenhouse,
40 thus reducing stress and mortality (Kosai, 1991).

20 Acclimation in the greenhouse

0 The procedure used to condition and acclimate

Año 1 Año 2
contributed to plant survival of 94.3% (12 328) of 35
Figura 4. Porcentaje de enraizamiento de los fenotipos para el phenotypes taken to the greenhouse, after reducing
año 1 y año 2. No hubo diferencias significativas humidity to normal environmental conditions (Figure
(p>0.05). Año 1, media± ±95% intervalo de confianza: 1E and F).
77.8±±22.77. Año 2, media±±95% intervalo de confian-
±13.43.
za: 71.9±
Figure 4. Percentage of rooting of tested phenotypes for year 1 CONCLUSIONS
and year 2. There were no significant differences
(p>0.05). Year 1, mean± ±95% confidence interval: Rauli (Nothofagus alpina) is a species that can be
77.8±±22.77. Year 2, mean± ±95% confidence interval:
±13.43.
71.9±
cultivated in vitro for long periods. For this species,
shoots of different phenotypes were rooted; after four
years of successive culture, they were propagated in
años del cultivo in vitro). Esto indica que los subcultivos vitro with no decline in morphogenic potential to
sucesivos en medios nutritivos con la concentración produce shoots and roots.
constante de BAP usada no afectan significativamente The use of a pre-acclimatation system in the
el potencial de enraizamiento en el tiempo. Lo contra- laboratory before transfer to a greenhouse reduced plant
rio ocurre en Castanea sativa y Eucalyptus sp, donde mortality by 5.7%, significantly increasing rauli plant
production. Plant growth was not detained by transfer
100 100 to the greenhouse, indicating a major decrease in stress.
90 90 Rauli production was 12 328 plants from 35 phenotypes.
80 80
It is concluded that it is possible to implement a
Enraizamiento (%)
Enraizamiento (%)

70 70
program for clone production of rauli plants of suitable
60 60
size and form from adult material for commercial scale
50 50
40 use. This is very important to achieve diversity of
40
30 30 species used in forest plantations.
20 20
10 10 End of the English version—
0 0
Terreno InjertoTerrenoTerrenoInjertoInjerto Terreno Injerto pppvPPP
Año 1 Año 1 Año 1 Año 2 Año 1 Año 2 Año 2 Año 2

Fenotipo Fenotipo

Figura 5. Porcentaje de enraizamiento por origen de fenotipos disminuye la respuesta durante el proceso rizogénico
(injerto y terreno) y año de enraizamiento (año1 y año (Ríos et. al., 2005, Gómez et. al., 2007).
2). No hubo diferencias significativas (p>0.05). Al analizar los resultados de enraizamiento para el
Terreno Año 1, media±
±95% intervalo confianza: 76.99±±8.7
año 1 y año 2, diferenciados por origen del fenotipo
±95% intervalo confianza: 79.57±
InjertoAño 1, media± ±20.6 (adulto de injerto y adulto de terreno), no hubo dife-
±95% intervalo confianza: 71.82±
Terreno Año 2, media± ±5.57 rencias significativas para estos factores (Figura 5).
±95% intervalo confianza: 71.57±
InjertoAño 2, media± ±12.76 Se clasificaron los fenotipos diferenciados por ori-
Figure 5. Percentage of rooting by source of phenotypes (grafted
gen para el porcentaje de enraizamiento obtenido el
and field-grown) and year of rooting (year 1 and year año 2 (Figura 6) y se encontró una variación (40 a
2). There were no significant differences (p>0.05). 90%) en las respuestas rizogénicas entre fenotipos.
Además, la mayoría de los fenotipos presentaron una
Field Year 1, mean±95% confidence interval: 76.99±
±8.7
±20.6
Grafted Year 1, mean±95% confidence interval: 79.57±
disminución en el porcentaje de enraizamiento durante
±5.57
Field Year 2, mean±95% confidence interval: 71.82± el año 2 respecto al año 1. Sin embargo, como ya se
±12.76
Grafted Year 2, mean±95% confidence interval: 71.57± indicó, el promedio del porcentaje de enraizamiento

SABJA et al. 601

AGROCIENCIA, 1 de julio - 15 de agosto, 2008

de los clones analizados por año no mostró diferencia 120

Terreno
Injerto
significativa (Figura 4 y 5).
100
Acondicionamiento y pre-aclimatación

Enraizamiento (%)
en laboratorio 80

El acondicionamiento en laboratorio (Figura 1C y 60

D) permitió aumentar la superficie foliar, elongación
apical y radicular de las plantas antes de su traspaso a 40
invernadero, aminorando así el estrés y la mortandad
(Kosai, 1991). Año 1
20
Año 2
Aclimatación en invernadero
0

131
44

121

141

33
23
58

43

128

93

105

11
138

88
7
53

38
55
10

120

12

37

102
98
80
126

42
18

97
0

40

69

26
6
66
El procedimiento usado para el acondicionamiento Fenotipo
y aclimatación permitió alcanzar 94.3% (12 328) de
sobrevivencia de plantas de 35 fenotipos llevadas a Figura 6. Clasificación de los fenotipos según origen (injerto y
invernadero, luego de reducir la humedad a condicio- terreno), de acuerdo al porcentaje de enraizamiento
para el año 2.
nes ambientales normales (Figura 1E y F). Figure 6. Classification of phenotypes by source (graft and field),
according to the percentage of rooting for year 2.
CONCLUSIONES

Raulí es una especie que puede cultivarse in vitro
por períodos prolongados. Brotes de diferentes fenotipos
enraizados después de cuatro años de cultivo sucesivos
se propagan in vitro sin declinar el potencial morfogé-
nico en proliferación de brotes y enraizamiento.
El uso de un sistema de pre-aclimatación en labora-
torio redujo la mortandad de plantas después del tras-
paso a invernadero a 5.7%, aumentando significativa-
mente la producción de plantas de raulí. El crecimien-
to de las plantas no se detuvo al traspasar a invernade-
ro, lo que indica una disminución importante del estrés.
Se produjeron 12 328 plantas de raulí proveniente de
35 fenotipos.
Se concluye que es posible implementar un progra-
ma de producción clonal de plantas de raulí de tamaño
y forma adecuada a partir de material adulto, para usar
a escala comercial. Esto es muy importante para lograr
diversidad de las especies usadas en plantaciones fo-
restales.
AGRADECIMIENTOS
Este estudio es parte del Proyecto FDI 00C7FT-12. Silvicultura
Clonal en Raulí para Aumentar la Productividad de Sitios Forestales
en la IX y X Regiones del país.
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602 VOLUMEN 42, NÚMERO 5

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