ENSAYOS INMUNOLÓGICOS

Los ensayos inmunológicos se basan en la especificidad de la unión Ag.- Ac.

En base a esta unión podemos dosificar y caracterizar toda sustancia que pueda generar
anticuerpos específicos contra ella.

Antígenos (Ag)

Se denomina antígeno (Ag.) a toda sustancia que, introducida en un organismo

competente, provoque una respuesta inmunitaria, estimulando la producción de
anticuerpos o de células sensibilizadas.
Se trata en general de moléculas complejas con grupos determinados, los cuales constituyen
zonas restringidas que determinan la especificidad, estas zonas se denominan determinantes
antigénicos o epitopes.
Dado que en una molécula antigénica existen varios epitopes diferentes, de ahí que se diga
que un Ag. es polivalente , la inoculación de ésta originará en el receptor anticuerpos con
distinta especificidad, cada uno de los cuales provendrá de un clon celular distinto (
respuesta policlonal)
El número de determinantes antigénicos constituye la valencia del Ag.
Esta puede ser: valencia total = nº total de epitopes
valencia funcional = nº de epitopes expuestos, es decir disponibles para
ser captados por el sistema inmune del huesped.
Los Ag. tienen 2 características básicas:

1º Inmunogenicidad: capacidad de generar Ac.

2º Especificidad : capacidad de unirse a ellos.
Existen moléculas que no son inmunogénicas por sí mismas pero sí son capaces de unir
específicamente Ac, estas moléculas se denominan Haptenos ( ej. para aminobenceno,
dinitro fluor benceno y Ac. sulfanílico).

Características de las que depende la antigenicidad:

-PM: debe ser mayor de 10KD, sin embargo hay moléculas como la de la insulina
( PM:6KD) y el glucagon (PM: 3.8KD) que pueden generar RI si son inoculadas con un
adjuvante.
Otras sustancias de bajo PM como es el caso de los haptenos en cambio, deben inyectarse
acopladas a una molécula inmunogénica llamada carrier para transformarse así en
antigénicas.
- Inmunogenicidad de especie: por ej. los polisacáridos neumococcicos son buenos
inmunógenos para el hombre pero no para el conejo.
-Relación propio-no propio: para ser inmunógeno, un Ag. no debe pertenecer a la especie
animal de la cual se pretende obtener la respuesta inmune hacia él.
-Grupos químicos: - los radicales ácidos o básicos fuertes en las proteínas las hace mas
inmunogénicas (principalmente los ácidos).
- la presencia de aminoácidos como tirosina o fenilalanina, ( la gelatina no los posee y por
ello solo es antigénica cuando se inyecta con adyuvante).
-Rigidez de la molécula: las largas cadenas de las moléculas de los hidratos de carbono
son fácilmente distorsionables y por lo tanto no generan una buena respuesta inmune. La
alta especificidad de los grupos aromáticos en los aminoácidos de síntesis es debida a la
rigidez del benceno. A su vez la posición de estos grupos también es significativa para la
especificidad dado que los derivados D o L pueden diferenciarse serológicamente.
La mayoría de los antígenos son proteínas de alto PM, con aminoácidos particulares (sobre
todo con grupos aromáticos) y estructura definida.
En los hidratos de carbono la antigenicidad esta dada por la condensación de 2 o más
grupos de hexosas.
Los ácidos nucleícos se tornan antigénicos sí se les rompe la doble hélice por
ej. por calentamiento y enfriamiento rápido.
Los ácidos grasos no son antigénicos pero si los son los lípidos complejos sobre todo los
asociados a glúcidos y proteínas ( ej. lipopolisacáridos).
En orden de antigenicidad tendríamos:

1º proteínas
2º hidratos de carbono
3º lípidos ( principalmente fosfo y gluco-lípidos) y ácidos grasos.

Ag. bacterianos :
- Pueden ser la parte constitutiva del microorganismo:- proteínas frecuentemente
situadas en la membrana celular y el espacio periplásmico.
- Hidratos de carbono, los cuales
constituyen sobre todo los Ag. de superficie. En el caso de las enterobacterias son
complejos glúcido-fosfolípidos que constituyen la pared celular y se
denominan endotoxinas, su toxicidad se pone en evidencia cuando se produce una masiva
destrucción bacteriana dentro del huesped.
Otro tipo de Ag. bacteriano lo constituyen las exotoxinas, estas son generalmente proteínas
antigénicas con marcado poder tóxico que son volcadas al medio por el microorganismo.
Son Ag. eficaces a pequeñas dosis y pueden ser neutralizados por los Ac. que genera, (
toxina botulínica, toxina tetánica) .

Anticuerpos (Ac.)

Los anticuerpos son proteínas séricas pertenecientes al grupo de las gamma-globulinas o

inmunoglobulinas, constituidas por la asociación de cuatro cadenas polipeptídicas unidas
entre sí mediante puentes disulfuro, dos cadenas se denominan pesadas y las otras dos
ligeras. A su vez, cada una de las cadenas ligeras y pesadas, incluye una región variable,
cuya secuencia de aminoácidos es peculiar de cada anticuerpo, y una región constante, con
la misma secuencia en todos los anticuerpos.
Existen 5 clases: IgM; IgG; IgA; IgD e IgE

La estructura básica de un Ac. Se puede esquematizar con la estructura de la IgG

( Fig.1):
Fig.1

Los sitios de unión al Ag. son 2 por eso se dice que un Ac. es bivalente y se denominan
paratopes, estos se ubican en la zona variable de la molécula .

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro.

La unión antígeno-anticuerpo depende de la complementaridad entre ambas moléculas. En

el sitio del determinante antigénico y en el de combinación del anticuerpo hay estructuras
que se corresponden (modelo llave-cerradura), cada anticuerpo reconoce y se une al
antígeno que le dio origen. Esta complementaridad o especificidad no sólo está dada por la
estructura primaria de la molécula sino también, en algunos casos, por la secundaria y
terciaria.
Las fuerzas de esta unión no son de tipo covalente sino más lábiles (uniones electrostáticas,
puentes de hidrógeno , fuerzas de Van der Waals) , de manera que permiten, en ciertas
condiciones, la disociación de los complejos.

En la interacción in vitro de un Ag. con su correspondiente Ac. se distinguen 2 etapas:

1º Interacción primaria: es la mera unión de un Ag. y su correspondiente Ac. No es

visualizable directamente y no es demasiado influenciada por la temperatura, la
concentración salina o la fuerza iónica ni la agitación. Sólo depende de la
complementaridad ya que cuando mayor sea ésta mayores serán las fuerzas de unión
( afinidad) y menores serán las fuerzas de repulsión (ej. repulsión estérica).
Los ensayos inmunológicos basados en la interacción primaria son, por ej. ELISA, RIA
(radioinmunoensayo), IF (inmunoflorescencia).
En estos ensayos la visualización del complejo se hace marcando uno de los reactivos
( Ag. o Ac.), con alguna sustancia detectable.
En el caso del ELISA ( Fig.2), la marcación se realiza con una enzima como por
ej. la peroxidasa, de manera que al agregar un cromógeno y el sustrato de dicha enzima, se
puede calcular la cantidad de complejos formados midiendo la intensidad del color
producido.

Fig 2

En el RIA, (Fig. 3) la
marcación es por un
isótopo radiactivo, de
manera que en este caso
medimos radiación
asociada al complejo.
Fig. 3

En IF (inmuno fluorescencia) marcamos con una sustancia fluorescente.

Podemos hacerlo directamente sobre un corte de tejido, impronta etc. y la observación se
realiza directamente con microscópio de fluorescencia.
También podemos marcar una suspención celular, en cuyo caso la medición se hará por
ej. por citometria de flujo, esta técnica se usa actualmente en clínica para cuantificar
células inmunes en el monitoreo del HIV,
Todas las técnicas de interacción primaria pueden ser Directas : marcamos uno de los
reactivos del complejo. Iindirectas: la marca estará en un 2ºAc. dirigido contra alguno de
los componentes del complejo.Esta es mas sencible que la anterior ya que al aumnetar el
tamaño del sistema podemos detectar menores cantidades.
Marca

2° Ac
 1° Ac

Fig.4

Directo Indirecto

2º Interacción secundaria: sigue a la anterior, los complejos iniciales que se forman

rápidamente y sobre los cuales la temperatura y la concentración salina no tienen
demasiada influencia, se agregan para dar diferentes fenómenos visibles cuya característica
dependerá principalmente de la naturaleza del antígeno.
Esta etapa se acelera con la temperatura, la agitación y es dependiente de la concentración
de electrolitos.

Las reacciones de interacción secundarias son:

Para Ag. solubles:

Precipitación:
En este caso el antígeno es una molécula soluble y al ponerse una solución del mismo, en
contacto con los anticuerpos que originó, se forman complejos Ag-Ac que al
insolibilizarse en su mayor parte, dan una reacción de precipitación.
Esto se da en 2 etapas, la primera se desarrolla rápidamente formándose los complejos Ag-
Ac, esta etapa es influenciada muy poco por la temperatura, la concentración de electrólitos
y la agitación.
En la 2º etapa los complejos se agregan formando micelas o redes que al alcanzar
determinado tamaño precipitan. Esta etapa se acelera con el aumento de la Tº (se la lleva a
cabo normalmente a 37ºC) y es además dependiente de la concentración de electrolito (
se usa generalmente ClNa 0,15M) . Es mucho más lenta que la anterior.
La formación de estas redes esta dada por la bivalencia del Ac. y la polivalencia del Ag.,
esta polivalencia se debe, como ya mencionamos, a la presencia de distintos determinantes
antigénicos.
Los sueros inmunes obtenidos de animales inoculados con este tipo de Ag. poseen una
mezcla de Ac. cada uno de los cuales interacciona con un epitópe distinto (antisuero
policlonal). Con Ac. monoclonales en general no se produce precipitación, esto es porque
en la mayoría de los casos están dirigidos contra un único epitope de manera que para el
caso el Ag. será monovalente, y solo se evidencia el fenómeno cuando se trata de
Ag. con epitopes muy repetidos.
Con haptenos monovalentes o Ag. que posean un solo determinante antigénico, o cuando
los Ac. son funcionalmente monovalentes como es el caso de los anticuerpos asimétricos
tampoco se formará precipitado.
Como se dijo anteriormente, la aparición de precipitado se produce cuando las redes de
complejos Ag. Ac. alcanzan un determinado tamaño.
Si en una serie de tubos colocamos cantidades constantes de uno de los reactivos ( por ej. el
Ac. y en cada uno cantidades variables del otro ( en este caso Ag.) veremos que se
producen distintas cantidades de precipitado en cada tubo, existiendo en algunos de ellos la
máxima cantidad posible para el caso.
Esto se da porque la formación de una red óptima depende de la relación molecular entre
Ag. y Ac. y esto va a depender de la cantidad de determinantes del Ag., ya que los
Ac. siempre son bivalentes.

Fig.5 Curva de precipitación:

Como vemos en la curva a medida que aumentamos la cantidad de Ag. aumenta la
cantidad de precipitado, llegando a una zona donde este es máximo; esta es la llamada
zona de equivalencia y representa la proporción molecular óptima de cada reactivo,
necesaria para generar la red de mayor tamaño.
Al seguir aumentando la concentración de Ag. que la cantidad de precipitado vuelve a
disminuir, esto es porque, otra vez, abandonamos la relación de equivalencia y los
complejos tienen menores tamaños.
Hay que tener en cuenta que si en una mezcla existen más de un sistema Ag-Ac los
precipitados de cada uno de ellos se encontrarán juntos en el fondo del tubo siendo
imposible distinguir uno de otro; lo que vamos a notar es que el pico de la curva en estos
casos será menos neto ya que se van a solapar distintas zonas de equivalencia.

Los tipos de reacciones de precipitación son:

a) En medio líquido:
Cualitativa: se usa poco ya que existen mejores
métodos para detectar presencia o ausencia, además, debido a lo que mencionamos antes
sobre la posible existencia de mas de un complejo en la mezcla, para utilizar este método
debemos asegurarnos de que uno de los reactivos este puro.
Semicuantitativa: tampoco se usa, constituye un
método poco práctico.
Cuantitativa: esta es la primera técnica que
permitió medir en masa la cantidad de Ag. o Ac. presente en una solución.
Por ej. queremos medir la masa de Ac. anti neumocóccico en un suero.
Disponemos del polisacárido purificado (esto es importante para asegurarnos de tener un
solo sistema reaccionante). Se colocan en una serie de tubos cantidades crecientes del
antisuero y constantes del polisacárido, se incuba la mezcla 1hr a 37ºC y luego se
centrifuga, lavamos el precipitado para eliminar las proteínas contaminantes y lo
resuspendemos, finalmente medimos la cantidad de proteínas por ej. por absorbancia a
280nm. En este caso como el Ag. no es proteico, la medida obtenida corresponderá solo a
los Ac. presentes en el suero.
Si ambos reactivos fueran proteicos, el cálculo se haría restando la cantidad agregada del
reactivo conocido.
Para obtener la masa debemos tener una curva de calibración: masa de proteína vs DO y, a
partir de la DO medida en nuestros tubos, obtenemos la masa incognita.
La medición de DO se realiza en el tubo de máximo precipitado, donde sabemos que todo
el Ag. y Ac. presentes formará parte del mismo.

b) En medio sólido ( precipitación en gel) :

Se usa como soporte de la reacción un gel de manera que las moléculas difundirán
libremente a través de él de manera que, a lo largo del recorrido se irá formando un
gradiente de concentraciones que hará que en un determinado punto los reactivos se
encuentren en su relación de equivalencia, en ese punto se producirá un precipitado que
sobre el gel se verá como una nítida banda blanca que permanece estable mientras un
mayor flujo de reactantes no provoque su re disolución.
Como se recordara, en la precipitación en medio líquido no era posible distinguir en el
precipitado la presencia de más de un sistema reaccionante, en el caso de que las moléculas
estén disueltas en un medio gelificante sumamos a los fenómenos de la precipitación, los de
la difusión simple, de manera que aquellos complejos cuyos coeficientes de difusión sean
distintos formaran bandas en distinta posición. De esta manera podemos resolver la
existencia de más de un complejo reaccionante en la mezcla. Sin embargo no podremos
separar complejos con igual coeficiente de difusión, y decimos que cada banda que se
forme estará compuesta por lo menos por 1 sistema .
Como soporte se usan medios semi sólidos como agar blando (agar 1% en solución salina)
agarosa 0,5% etc. Todos aquellos que permitan una libre difusión de macromoléculas.

La precipitación en gel puede ser:

Cualitativa: existen diferentes esquemas que nos permiten

detectar la presencia de un Ag. o un Ac. (según el caso).

- Difusión simple monodimensional ( método de Oudin): Se coloca en un tubo de

ensayo agar fundido mezclado con un vol. igual del antisuero a analizar (en este caso
queremos detectar la presencia de un Ac.)
Se deja solidificar y se añade la solución de Ag., este va a difundir por el agar formando,
como dijimos, un gradiente de concentración decreciente hacia el fondo del tubo, significa
que en determinada zona Ag. y Ac. alcanzarán la relación de equivalencia, formándose ahí
la banda de precipitado.
Se formarán tantas bandas como sistemas haya, siempre que la velocidad de difusión sea
distinta para cada uno de ellos.
Se ha intentado utilizar este sistema con fines cuantitativos, ya que la distancia a la que se
forma la banda es directamente proporcional a la concentración del reactivo que difunde,
entonces mediante distintas fórmulas matemáticas se puede calcular la concentración en
función de la distancia recorrida.
- Difusión doble monodimensional ( método de Oakley Fulthorpe): En este caso
colocamos en la parte inferior del tubo un vol. de agar 1% fundido, mezclado con un vol.
igual del antisuero, dejamos solidificar y agregamos igual vol. de agar 0,5%, dejamos
solidificar y por ultimo agregamos agar 1% donde se encuentra disuelto el Ag.
Tanto el Ag. como el Ac. migrarán hacia la zona media de menor concentración, de manera
que, otra vez, se formarán gradientes que harán que en deteminado punto los reactivos estén
en equivalencia y precipiten.
Vemos acá, que si la concentración de Ag. y Ac. están en relaciones óptimas (equivalentes)
la banda se formará en un punto intermedio del tubo, mientras que si, por ej. la cantidad de
Ag. esta en exceso necesitará recorrer una mayor distancia para alcanzar una dilución tal
que se encuentre en equivalencia con el Ac. y así la banda se formará más cerca del fondo.
Lo contrario ocurrirá cuando la cantidad de Ac. sea la que esta en exceso.

Fig. 6
 - Difusión doble bidimensional (método de Oüchterlony) : Constituye un método muy
completo ya que permite obtener mas información que los anteriores.
Consiste en colocar en una placa de Petri agar 1,5% al cual luego de solidificar se le
realizan perforaciones en forma de pocillos a distancia conveniente y en dichas
perforaciones se colocan pequeñas cantidades de Ag. y Ac.
En este caso los reactivos difunden en forma radial a partir del pocillo generando bandas de
precipitación cuyas características dependerán de varios factores.

Fig.7

Igual que en el caso anterior, cuando las concentraciones colocadas en los pocillos estén
cerca de la de quivalencia la banda se formará a mitad de distancia entre ellos.
Además, nos permite tener idea de los PM de cada reactivo ya que al tratarse de una
difusión radial, la concavidad de la banda estará hacia el lado del pocillo donde se halla
colocado el reactivo de mayor PM, y viceversa, si ambos PM son semejantes la banda será
recta.
Por otro lado, la posibilidad de hacer varios pocillos en una placa permite obtener
información sobre similitud de los Ag. reaccionantes.
Recordemos que las macromoléculas antigénicas tienen en su superficie zonas llamadas
determinantes antigénicos y que son los sitios reconocidos por el Ac.
Así, dos Ag. emparentados ( por ej. dos albúminas de distinta espécie) tendrán
probablemente determinantes antigénicos comunes a ambos.
Mediante la técnica de Ouchterlony podemos determinar la existencia o no de
determinantes comunes entre Ag. según las características de las bandas formadas.

Fig.8

La reacción de identidad (I), corresponde a los Ag. que comparten todos los determinantes
antigénicos, es decir que estamos ante la misma molécula, en la de no identidad (II), ningún
determinante es compartido y por lo tanto son Ag. distintosmientras que en la identidad
parcial ( III), hay determinantes en común, o sea que hablamos de Ag. emparentados, esto
se ve como un espolón dirigido hacia el pocillo con menos determinantes reactivos. Notese
que en este caso último, ab es una sola molécula
Acá, otra vez nos referimos a un sistema reaccionante con un determinado coeficiente de
difusíón. En caso de que los sistemas sean varios tendremos tambien distintas bandas según
las velocidades de difusión de cada uno. Esto nos va a permitir determinar la pureza de una
solución antigénica, recordando siempre que cada banda corresponderá a, por lo menos, un
sistema.
Fig.9

En este esquemas vemos, en el caso I, que en el pocillo ac , hay 2 sistemas reaccionantes

(a y c) uno de los cuales ( a) presenta reaccion de identidad con el otro pocillo a (ya que se
trata del mismo Ag.), mientras que el sistema c da una banda separada ( es decir que su
concentración y su coeficiente de difusión son distintos, por lo tanto es otra molécula
antigénica).
En el caso II, se enfrenta la solución ab con la solución b, acá vemos la banda de no
identidad correspondiente a los Ag a y b de cada pocillo, y la banda de identidad
correspondiente a b, presente en los dos. La diferencia con el caso I radica en que
en II, a esta en mayor concentración relativa de lo que esta c en el I.
En el esquema III, vemos la identidad parcial de ab y b, y las bandas c y d que no
presentan identidad ni con a ni con b. Notese que en este último caso ab es tambien una
sóla molécula.
Evaluacón de los pasos de purificación de albumina sérica humana.

Fig. 10
Otra utilidad de este método es la de testear los pasos de purificacion por ej. de una proteína
, a partir del material a purificar ( 1) vemos la desaparición de bandas en los distintos pasos,
asi el resultante del 1º paso, pocillo 2, presenta una banda menos que el 1, y en el pocillo 3
ya vemos solamente la banda continua correspondiente a la albúmina, es decir que el paso 4
no sería necesario. En el pocillo central debemos colocar un antisuero total que nos revele
todas las proteínas del suero a purificar. En este ejemplo será antisuero humano total.
Como control debemos colocar un pocillo con albumina humana purificada para verificar
su identidad con la banda presente en el ultimo paso de purificación. La banda de albumina
esta representada por la linea continua que rodea el pocillo central.

Semicuantitativo:En este tipo de pruebas se busca

determinar la cantidad de un determinado reactivo .
Cuando la cuantificación es relativa, el resultado depende del método usado, los reactivos
empleados etc., entonces hablamos de ensayos semicuantitativos.
En inmunología el resultado de estos ensayos se expresan como “título”.
El título se define como la inversa de la última dilución que da resultado positivo.
La metodología empleada consiste en colocar sobre un porta objetos, agar 1,5% en
sol. fisiológica y sobre él realizar perforaciones delimitanto pocillos en los que se colocarán
los reactivos, uno de ellos en concentración constante y el otro, el que se va a cuantificar,
en diluciones crecientes.
Fig. 11

TC 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32

En este caso, el título del antisuero 1 es 8, y el del anti suero 2 es 4.

Cuantitativo: En estos casos la cuantificación se realiza

en masa, es decir que el resultado obtenido no debe variar de una técnica a otra ya que
representa una medida absoluta.
La técnica de precipitacion usada en este caso es una difusión simple en
placa o inmunodifusión radial ( Mancini ).
Consiste en una placa de agar o agarosa al 3% en solución salina, en el que se encuentra
disuelto el Ac.Sobre el agar se realizan perforaciones en las que se colocan las muestras a
dosar.
Como mencionamos en párrafos anteriores, la distancia a la que difunde un
Ag. hasta alcanzar la relación de equivalencia con su correspondiente Ac. y precipitar, es
proporcional a la concentración del mismo. Entonces, cuando los sistemas son
equivalentes, aparece alrededor del pocillo un circulo de precipitación.
Debido a que la concentración del reactivo disuelto en el agar es constante, el diámetro del
círculo descripto por la banda de precipitación será directamente proporcional a la
concentracion del reactivo que difunde.
Para realizar el ensayo, se colocaran en una serie de pocillos cantidades conocidas de un
estandar del Ag. a dosar y en los otros la o las muestras incógnitas.
Luego se incuba la placa a temperatura ambiente hasta que el diámetro de los halos no se
modifique (48-72 hs).
Se mide el diámetro de los halos y con aquellos correspondientes a los estandares se
construye una curva de calibración relacionando la superficie de los mismos (el r2 o d2) con
la concentración. Con la medida de los halos de las muestras incógnitas y mediante esta
curva, se calcula la concentración de las mismas.
Este método, en el cual el precipitado alcanza su punto de equilibrio y ya no se modifica,
constituye la llamada determinación de alta precisión.
Se puede realizar una determinación rápida de orientación en la cual se incuba la placa
entre 16 y 20 hs. y se gráfica diámetro vs. log de la concentración de Ag.
 Fig. 12 Curva de calibración

Existen kits comerciales que traen la placa con el Ac. ya incluido en ella , un estándar de
concentración conocida y una tabla de concentración en función de los diámetros o radios;
de manera que sólo sembramos ese estándar y nuestras muestras. Al cabo de la incubación
medimos el halo del estándar para verificar que corresponda a la concentración establecida
y, si es así, sólo medimos los halos de nuestras incógnitas y con esto obtenemos la
concentración en la tabla adjunta.

Para antígenos particulados:

Aglutinación:
En la reacción de aglutinación, los principios son los mismos que en la precipitación, la
diferencia radica en que en este caso el Ag. no es soluble sino particulado ( ej. bacterias,
células, glóbulos rojos etc.)
La formación de las redes dará como consecuencia agregados en forma de grumos en el
fondo del tubo. El Ag. no se encuentra en solución sino en suspensión y al ser una partícula
grande, se formen o no los agregados, sedimentará; la diferencia entre una reacción
negativa, donde lo que vemos en el sedimento es sólo el Ag. y una positiva, donde se
forman los complejos, esta dada por la característica visual del sedimento que, en el primer
caso será un botón homogeneo de células y en el segundo serán grumos.

Fig. 13 Placa de hemoaglutinación

Sedimentación

Cuando el anticuerpo está dirigido contra antígenos constitutivos de la partícula, se trata de

una aglutinación directa, por ejemplo la determinación de grupos sanguíneos o la detección
de Ag. bacterianos, mientras que la interacción del anticuerpo con un antígeno soluble
cualquiera acoplado a una partícula inerte o a una célula, como por ej. un glóbulo rojo, se
denomina aglutinación pasiva. Esta es más sensible que la directa debido a la posibilidad de
regular la densidad de los determinantes sobre la superficie de la partícula.

La aglutinación puede ser:

Cualitativa: es la típica reacción de determinación de
grupo sanguíneo, donde se ponen en contacto la sangre a determinar con sueros de distintos
grupos, y se considera la producción o no de aglutinación.

Fig. 14
 Cuantitativa: no es muy usada, al igual que en la
precipitación cuantitativa, consiste en medir proteínas en el aglutinado; se puede utilizar
por ej. para determinar los mg de anticuerpo contra un Ag. particulado, presente en un
suero inmune.
Para esto, se determina por micro Kjeldahl, el nitrógeno proteico correspondiente a un
volumen determinado de antígeno puesto en contacto con el suero inmune y por otro lado,
el nitrógeno correspondiente al mismo volumen de Ag. puesto en contacto con un suero
normal de la misma especie animal. La cantidad de proteína correspondiente al
Ac. específico será la diferencia entre ambas mediciones multiplicada por el factor de
conversión 6,25.
Como en el caso de la precipitación, previo a la medición de N, hay que lavar el aglutinado
para eliminar toda proteína no fijada específicamente y además, como se trata de células se
coloca EDTA para inhibir la fijación de complemento.

Semicuantitaviva: esta técnica se realiza normalmente en

microtubos o placas de fondo en U y consiste, al igual que en el caso de la precipitación, en
colocar concentraciones constantes de uno de los reactivos en contacto con concentraciones
variables del reactivo a determinar. Asi, obtenemos el título, que será, igual que en todo
ensayo semicuantitativo, la inversa de la mayor dilución que da un resultado positivo.
Debemos recordar que se trata de una medición relativa y no absoluta, por lo cual puede
variar de laboratorio en laboratorio y siempre debe ir acompañada de un control positivo y
otro negativo, realizado en el mismo laboratorio y por el mismo método.
Es una técnica muy útil, rápida y económica para determinar Ag. bacterianos y de hecho, se
la usó para clasificar serológicamente enterobacterias como por ej. las del género
Salmonella.

Fig. 15

En todos los pocillos se coloca la suspensión bacteriana a concentración constante y a

continuación en las filas A,B,C, etc. Se colocan diluciones crecientes al medio de los
antisueros anti bacteria que se quieren dosificar.
Debemos colocar como control negativo un suero normal ( no inmune) de la misma especie
en la que se hizo el antisuero para comprobar que la reacción que se produce no es una
aglutinación inespecífica. (Fila E).
Como vemos en la figura 15, el antisuero de la fila A da reacción de aglutinación hasta el
pocillo Nº7, si comenzamos en el 1 con concentración tal cual, el 7 seria 1/64, es decir que
el título sería 64.
El antisuero B da un título de 4 y el C, de 8.
El antisuero D no tiene anticuerpos contra dicha bacteria.

La reacción de las enterobacterias frente a antisueros específicos depende de 3 tipos de Ag.:

H: Ag. flagelar: es una proteína fibrosa del tipo de la miosina.
O : Ag. somático: está formado por un polisacárido específico, una proteína y un
fosfolípido. Se presenta como una masa de “barbas” de longitud variable cada una de las
cuales se une al lípido A a través de una cadena nuclear.
Vi: También conocido como “de virulencia”, se trata de una capa externa
de polisacáridos, ésta no es tan densa como una cápsula y no llega a cubrir completamente
al Ag. O. La presencia del este Ag. permite la absorción y neutralización con los sueros
anti-O, pero la aglutinación sólo será posible con sueros ant-H o anti-Vi.

Fig 16

Ag.H

Ag. O Ag. Vi

Fig. 17 Características del Ag. O.

Esquema de la membrana celular de las bacterias gram negativas

El LPS es la porción de la menbrana celular de las bacterias gram negativas que se conoce
como endotoxina. Puede extraerse de las células intactas y ser separado por hidrólisis en un
lípido A y un polisacárido ( constituyente del Ag.O ) que es el responsable de la
especificidad antigénica. En las enterobacterias, el LPS proporciona centenares de Ags. O
diferentes de importancia diagnóstica y cuya variación constituye la base principal para la
clasificación de las Salmonellas.
El polisacárido contiene colectivamente una gran variedad de azúcares, cinco de ellos son
comunes a todos los tipos salvajes de Salmonella. Estos azúcares comunes forman un
centro polisacárido nuclear constante al que se añaden los residuos O específicos.
La especificidad esta dada por los distintos azúcares solos o combinados que forman así el
determinante antigénico, cada uno de los cuáles se indica con un número arábico, por
ej. una manosa +una galactosa forman el determinate 15.
Cada Ag. O de Salmonellas poseen 2 o 3 determinantes específicos, cada uno de los cuales
es compartido por otros Ags. O, uno de ellos, llamado determinante principal, es el de
reacción mas fuerte y en base a éste se divide a las Salmonellas en grupos:
Ej. grupo C (Ag. O=6,7) determinante principal=6
Grupo E (Ag. O= 3,10) det. principal=3
Mediante los determinantes de menor importancia (de reacción mas débil) de pueden
establecer divisiones dentro de cada grupo.

Clasificación de las Salmonellas según Kauffmann-White:

Si tenemos por ej. dos cepas de Salmonella, a y b, y el antisuero preparado ante cada una
de ellas (anti-a y anti-b) y enfrentamos la suspensión de cada una de ellas con esos
antisueros y con los mismos antisueros después de ser absorbido con la suspensión
heteróloga, obteniendo los siguientes resultados :

Antisuero Organismos

a b

Anti-a no absorbido 4+ 2+

Anti-b no absorbido 2+ 4+

Anti-a absorbido con b 2+ 0

Anti-b absorbido con a 0 2+

Concluímos que a y b son diferentes pero comparten determinantes antigénicos.

Podríamos decir, por ej., que a tiene los determinantes 1 y 2, y b, los determinantes 2 y 3.
Al absorber un antisuero con una suspensión de bacterias lo que hacemos es capturar los
Ac. que se unan a dicha suspensión y separarlos del resto del antisuero.
Si cada cepa fuera capaz de eliminar todos los Ac. aglutinantes para la otra, concluíriamos
que son antigénigamente idénticas, y en ese caso los títuos de cada cepa con cada antisuero
serían iguales.

Bibliografía:
- Inmunología e inmunoquímica. Ricardo Margni.
- Tratado de Microbiología. David Dulbecco.