LEMBAR KERJA MAHASISWA

MIKROBIOLOGI

Kelompok :4
1. Dina Afriyanti (1610211004)
2. Ahmad Junaidi (1610211018)
3. Rifqiatul Badriyah (1610211039)
Sift :1

LABORATORIUM BIOLOGI DASAR

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI
JURUSAN PENDIDIKAN MIPA
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH JEMBER
2018
 LEMBAR KERJA MAHASISWA 2

1. Acara : Pembuatan Media

2. Rumusan Masalah :
a. Bagaimana kebutuhan dasar mikroorganisme dapat terpenuhi dalam prosedur pembuatan
media pertumbuhan?
b. Bagaimana peran macam-macam media pertumbuhan untuk memenuhi kebutuhan dasar
mikroorganisme?
c. Bagaimana langkah-langkah pembuatan media pertumbuhan?
d. Bagaimanakah prosedur umum pembuatan media pertumbuhan dengan memperhatikan
kebutuhan dasar mikroorganisme?
e. Bagaimana cara pembuatan media padat Potato Dextrose Agar (PDA) dan Nutrient Agar
(NA)?
f. Syarat apa saja agar mikroba dapat tumbuh dengan baik?
3. Hipotesis
a. Mikroba sama dengan makhluk hidup lainnya, memerlukan suplai nutrisi sebagai sumber
energi dan pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebut adalah : karbon, nitrogen,
hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi dan sejumlah kecil logam lainnya. Ketiadaan atau
kekurangan sumber-sumber nutrisi ini dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba hingga
pada akhirnya dapat menyebabkan kematian.
b. Peran dari macam-macam media pertumbuhan disini sangat bervariasi, bisa dilihat dari segi
macam-macam media pertumbuhan itu sendiri, yakni berdasarkan sifat fisik, berdasarkan
kandungan bahan, dan berdasarkan tujuan. Misal dari segi fisik yakni berperan untuk
menjaga sel tidak berpindah tempat sehingga akan mudah dihitung dan dipisahkan jenisnya
ketika tumbuh menjadi koloni. Selain itu, juga menampakkan difusi hasil metabolit bakteri
sehingga memudahkan dalam pengujian suatu hasil metabolit.
c. Langkah-langkah pembuatan media pertumbuhan terdiri dari 3 langkah yakni : Pembuatan
Nutrient Agar, Pembuatan Nutrient Broth, dan Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA).
d. Pertama, menggunakan taoge, lalu gula C6H12O6, setelah itu agar, Akuades, dan strelisasi.
e. 1) Pembuatan PDA (Potato Dextros Agar) yaitu : kentang dikupas dan dicuci hingga bersih,
kemudian dipotong dadu dan timbang sebanyak 100 gr, kentang direbus dengan
 aquades sebanyak 400 ml sampai kentang masak, ekstrak kentang di saring dan
ditambah dengan dextrose sebanyak 10 gr dan agar 10 gr, kemudian di aduk sampai
campuran bahan tersebut larut, larutan tersebut ditambah dengan aquades hingga
volumenya mencapai 500 ml, larutan dimasukkan dalam labu Erlenmeyer/botol,
disumbat dengan kapas dan ditutup dengan cling worp dan media di autoklaf selama 15-
20 menit pada suhu 1210 C dengan tekanan 15 Psi.
2.) Pembuatan NA (Natrium Agar) yaitu : aqudes sebanyak 500 ml, dibagi menjadi 2
bagian, 10 gr beef ekstrak di larutkan kedalam 200 ml aqades dan di aduk hingga
homogeny, 10 gr agar dilarutkan ke dalam 300 ml aqudes yang dipanaskan dan diaduk
hingga homogeny, larutan beef ekstrak dimasukkan kedalam larutan agar dan di aduk
hingga homogeny, larutan dimasukkan kedalam botol, sumbat dengan kapas dan ditutp
dengan cling wrap dan media di autoklaf selama 15-20 menit pada suhu 1210C dengan
tekanan 15 Psi.
f. Mikroba dapat tumbuh dengan baik dipengaruhi oleh beberapa factor yakni :
a.) Sumber energy,
b.) Nutrisi,
c.) Derajat keasaman (PH),
d.) Suhu,
e.) Air,
f.) Oksigen.
4. Prosedur Kegiatan
a. Menimbang powder media NA pabrikan sesuai petunuk pada botol/kemasan.
b. Menempatkan hasil timbangan pada bejana dan tambahkan aquadest sebagai pelarut dan
panaskan sambil diaduk hingga homogeny/tercampur.
Pembuatan Media NA
1) Menimbang 4,0 g NA dan masukkan ke dalam Erlenmeyer yang mengandung 200 mL
aquadest.
2) Memanaskan dan aduk sampai rata (pH ± 7).
3) Menuang pada tabung reaksi yang masing-masing 10 mL dan 5 mL, tutup dengan kapas.
4) Mensterilisasi pada autoclave suhu 1210C selama 15 menit.
 c. Hal yang sama untuk media biakan padat pabrikan lainnya.
d. Membuat media NA sederhana/modifikasi :
1) Membuat air kaldu daging yaitu 20 g daging (sapi/ayam/kambing) + 200 mL aquadest,
rebus sampai menjadi kaldu sambil diaduk sampai rata.
2) Menyaring dan didapat ekstrak daging.
3) Menimbang 8 g gula pasir dan 15 g agar batang, kemudian masukkan kedalam
Erlenmeyer yang berisi 200 mL ekstrak daging, rebus sampai mendidih sambil diaduk
sampai rata.
4) Mengukur pH.
5) Mensterilisasi pada autoclave suhu 1210C selama 15 menit.
e. Untuk media padat sederhana lainnya (PDA gunakan kentang atau talas atau ketela rambat
200 g dan TEA gunakan kecambah 200 g), dengan prosedur sama.
f. Membuat media glukosa both :
1) Membuat air peptone yaitu 2 g pepton + 1 g NaCl + 200 mL aquadest, aduk sampai rata.
2) BTB 0,4 % g BTB + 50 mL alkohol 96% + 50 mL aquadest.
3) Menimbang 1 g glukosa dan masukkan kedalam Erlenmeyer yang berisi 100 mL air
peptone, aduk sampai rata.
4) Menetesi dengan 1-2 tetes BTB 0,4 %.
5) Mensterilisasi pada autoclave suhu 1210C selama 15 menit.
g. Pembuatan media both lainnya sama dengan glukosa both hanya gula diganti sesuai yang
akan dibuat (fruktosa, sukrosa, maltose, dll).
5. Alat dan Bahan
Alat :
a. Bejana (gelas backer, Erlenmeyer)
b. Gelas ukur
c. Timbangan
d. Cawan petri
e. Tabung reaksi
f. Autoclave
Bahan :
a. Media biakan padat pabrikan (NA = Nutrient Agar, PDA = Potato Dextro Agar dll)
b. Media NA sederhana : daging (sapi, ayam, kambing), agar batang, glukosa/gula pasir
c. Media PDA sederhana : kentang/talas/ketela rambat, agar batang, glukosa/gula pasir
d. Media TEA (Tauge Ekstrak Agar) sederhana : kecambah (kacang hiau, kedelai, lainnya),
agar batang, gula pasir
e. Fruktosa broth, Glukosa broth
 LEMBAR KERJA MAHASISWA 3

1. Acara : Sterilisasi pada Media

2. Rumusan Masalah :
a. Bagaimana cara untuk mensterilkan alat dan media?
b. Bagaimana proses sterilisasi dan apa saja jenis-jenis dari sterilisasi ?
c. Bagaimana proses pembuatan medium ?
d. Bagaimana metode sterilisasi?
e. Apa saja macam-macam sterilisasi?
f. Infeksi akibat proses sterilisasi yang salah?
3. Hipotesis
a. Cara untuk mensterilkan alat dan medium ialah dengan beberapa macam yaitu :
1) Mendidihkan medium tersebut selama beberapa jam,
2) Tyndallisasi,
3) Autoklaf,
4) Filtrasi.
b. Teknik ataupun proses dari sterilisasi ialah dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik,
fisik dan kimiawi. Sementara jenis-jenis sterilisasi ialah sebagai berikut : Sterilisasi uap,
Sterilisasi panas kering, Sterilisasi gas, Sterilisasi radiasi ionisasi, dan Sterilisasi filtras.
c. Proses pembuatan medium terdiri dari 4 langkah yakni : Pembuatan Nutrient Agar,
Pembuatan MEA, pembuatan LB dan Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA).
d. Secara umum metode pembuatan sediaan steril dibagi menjadi 2 yaitu :
1) Metode sterilisasi akhir, dan
2) Metode aseptis.
Pemilihan metode disesuaikan dengan stabilitas zat aktif, formula dan metode sterilisasi
yang digunakan.
e. Macam Macam Metode Sterilisasi yakni :
1) Sterilisasi Panas/thermal,
2) Sterilisasi Radiasi,
3) Sterilisasi Gas,
4) Sterilisasi Filtrasi
 f. Kesalahan dari proses sterilisasi dapat menyebabkan diare, tetanus, hepatitis B, hepatitis C,
dan HIV.
4. Variabel :
a. Variabel manipulasi/bebas : Proses sterilisasi pada media Pembuatan Nutrient Agar,
Pembuatan MEA, pembuatan LB dan Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)
membutuhkan konsentrasi 100% 75% 50% 25%
b. Variabel respon/terikat : zona hambat sterilisasi pada media terhadap pertumbuhan bakteri
Vibriocholerae, Nutrient Agar, Malt Extract Agar, Lactose Broth
c. Variabel Kontrol : Faktor - faktor yang mempengaruhi sterilisasi yaitu jenis pemanasan,
kering atau basah, suhu dan waktu, jumlah organisme yang ada, apakah organisme tersebut
memiliki kemampuan untuk membuat spora, jenis bahan yang mengandung organisme
yang harus dibunuh.
Prosedur :
Definisi Operasional variabel
a. Variable manipulasi/bebas : Pembuatan Nutrient Agar, Pembuatan MEA, pembuatan LB
dan Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA) membutuhkan konsentrasi 100% 75% 50%
25%
b. Variable respon/terikat : Media adalah suatu substrat makanan yang diperlukan untuk
pertumbuhan dan perkembangan mikroba. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan
otoklaf dengan tekanan uap air hingga suhu mencapai 1210C dan tekanan 1 atm selama ±
15 menit. Hal ini bertujuan agar dapat meminimalisasi tumbuhnya mikroba pencemar.
c. Variable control : Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga memerlukan pH
yang tepat. Kebanyakan bakteri tidak dapattumbuh pada kondisi yang terlalu basa, kecuali
Vibriocholerae yang dapat hidup pada pH lebih dari 8. Suhu jugamerupakan variabel yang
perlu dikendalikan. Kelompok terbesar yaitu mesofil, suhu optimum untuk pertumbuhan
20-400C
5. Prosedur Kerja
a. Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)
Sebanyak 6 gram NA ditimbang dengan menggunakan neraca analitik dan dimasukkan ke
dalam beaker glass kemudian ditambah 300 ml aquades kemudian diaduk rata. Setelah
larutan homogen, pengaduk magnet (stirrer) dimasukkan ke dalam beaker glass, kemudian
 larutan dipanaskan dengan menggunakan hot plate. Pemanasan dilakukan hingga seluruh
agar larut yaitu ketika larutan berwarna bening. Kemudian, saat agar masih dalam keadaan
cair, dimasukkan ke dalam 24 tabung reaksi masing-masing sebanyak 10 ml, dan 6 tabung
reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Selanjutnya, mulut tabung reaksi ditutup dengan
menggunakan kapas agar tetap steril, dan tabung reaksi diberi label media yang digunakan
(NA). Setelah itu, tabung reaksi dibungkus dengan menggunakan plastik bening dan diikat
dengan karet gelang. Selanjutnya, seluruh tabung reaksi disterilisasi dengan menggunakan
otoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. Setelah proses sterilisasi
selesai. 18 tabung reaksi yang masing-masing diisi sebanyak 10 ml dibuat dalam keadaan
tegak, 6 tabung reaksi yang masing-masing diisi sebanyak 5 ml dibuat dalam keadaan
miring dan 6 tabung reaksi masing-masing diisi sebanyak 10 ml dipindahkan ke dalam
cawan petri secara aseptis kemudian dibungkus kembali dengan menggunakan kertas
buram untuk disimpan. Setelah agar memadat, hasilnya diamati dan digambar kemudian
diberi keterangan warna dan wujud agar.
b. Pembuatan Media Potato Dextrose Agar (PDA)
Mula-mula 1,17 gram PDA ditimbang dengan menggunakan neraca analitik dan
dimasukkan kedalam beaker glasskemudian diisi 30 ml aquades kemudian diaduk rata.
Setelah larutan homogen, pengaduk magnet (stirrer) dimasukkan ke dalam beaker glass,
kemudian larutan dipanaskan dengan menggunakan hot plate. Pemanasan dilakukan hingga
seluruh agar larut yaitu ketika larutan berwarna bening. Kemudian, saat agar masih dalam
keadaan cair, larutan agar dimasukkan ke dalam 6 tabung reaksi masing-masing sebanyak 5
ml. Selanjutnya, mulut tabung reaksi ditutup dengan menggunakan kapas agar tetap steril,
dan tabung reaksi diberi label yang bertuliskan media yang digunakan (PDA). Setelah itu,
tabung reaksi dibungkus dengan menggunakan plastik bening dan diikat dengan
menggunakan karet gelang. Lalu disterilisasi dengan menggunakan otoklaf pada suhu
121°C dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. Setelah proses sterilisasi selesai, masing-
masing tabung reaksi diambil dan diletakkan pada alas miring untuk membuat agar-agar
miring hingga memadat. Setelah agar memadat, medium diamati lalu digambar dan diberi
keterangan wujud dan warnanya.
 c. Pembuatan Media Malt Extract Agar (MEA)
Pertama-tama, sebanyak 0,96 gram MEA ditimbang dengan menggunakan neraca analitik
dan dimasukkan kedalambeaker glass kemudian dimasukan 20 ml aquades kemudian
diaduk rata. Setelah larutan homogen, pengaduk magnet (stirrer) dimasukkan ke
dalam beaker glass, kemudian larutan dipanaskan dengan menggunakan hot plate.
Pemanasan dilakukan hingga seluruh agar larut yaitu ketika larutan berwarna bening.
Kemudian, saat agar masih dalam keadaan cair, larutan agar dimasukkan ke dalam 4 tabung
reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Selanjutnya, mulut tabung reaksi ditutup dengan
menggunakan kapas agar tetap steril, dan tabung reaksi diberi label yang bertuliskan media
yang digunakan (MEA). Setelah itu, tabung reaksi dibungkus dengan menggunakan plastik
bening dan diikat dengan karet gelang. Lalu disterilisasi dengan menggunakan otoklaf pada
suhu 121°C dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. Setelah proses sterilisasi selesai,
masing-masing tabung reaksi diambil dan diletakkan pada alas miring untuk membuat
agar-agar miring hingga memadat. Setelah agar memadat, medium diamati lalu digambar
dan diberi keterangan wujud dan warnanya.
d. Pembuatan Lactose Broth (LB)
Lactose Broth sebanyak 7,8 gram ditimbang dengan menggunakan neraca analitik dan
dimasukkan ke dalam beaker glass kemudian diisi 600 ml aquades kemudian diaduk rata.
Setelah larutan homogen, larutan tersebut dimasukkan ke dalam 54 tabung reaksi. Pada
masing-masing tabung reaksi, dimasukkan tabung durham yang telah diisi dengan larutan
LB dengan kondisi terbalik. Tabung durham yang dimasukkan ke dalam tabung reaksi
tidak boleh membentuk gelembung udara. Larutan LB yang dimasukkan ke dalam tabung
reaksi dan tabung durham diisi sebanyak 10 ml. Selanjutnya, mulut tabung reaksi ditutup
dengan menggunakan kapas agar tetap steril. Setelah itu, tabung reaksi dibungkus dengan
menggunakan plastik bening dan diikat dengan karet gelang. Lalu disterilisasi dengan
menggunakan otoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. Setelah
proses sterilisasi selesai, tabung reaksi diambil kemudian medium diamati lalu digambar
dan diberi keterangan wujud dan warnanya.
6. Alat dan Bahan
Alat
a. Autoclave dengan perlengkapannya
b. Oven dengan perlengkapannya
c. Erlenmeyer 250 ml dan Erlenmeyer 500 ml.
d. Batang Pengaduk
e. Tabung reaksi
f. 3 Rak tabung reaksi
g. Cawan petri
h. Bunsen
i. Botol semprot alcohol
Bahan
a. Media biakan padat pabrikan (NA dan PDA pabrikan)
b. Media biakan padat sederhana (NA, PDA, TEA)
c. Kapas
d. Aluminium foil
e. Plastik Warp
f. Kertas pembungkus
g. Tissue
h. Kertas label
i. Alcohol 70%
j. spiritus