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SECCIÓN I
INTRODUCCIÓN
El Comité de ensayos biológicos sobre el vertido oceánico declaró que el número mínimo
de especies que se utilizarán en la evaluación de un permiso de vertido debería ser de
tres. Estas especies deben seleccionarse de los diferentes grupos taxonómicos
enumerados en la sección sobre el método de flujo continuo para la prueba de toxicidad
aguda con peces y macroinvertebrados (vea la página 71).
Tenga en cuenta que el camarón de salmuera (Artemia salina) no está en esta lista. El
comité consideró que el camarón de salmuera no era un organismo satisfactorio para su
uso en bioensayos marinos. Sin embargo, están disponibles y se pueden realizar pruebas
fácilmente para comparar su sensibilidad para un material de desecho seleccionado con
la de los organismos nativos, siempre que sea posible, además de los organismos
recomendados en este manual.
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Manual Bioensayos con Fitoplancton en Aguas Contaminadas – Método para medir Toxicidad con
Fitoplancton – Método para medir Toxicidad con Artemia salina
SECCION II
1. Selección de Especies
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En la elección de las especies para los bioensayos, los siguientes criterios son guías
útiles:
a. Siempre que sea posible, se deben estudiar las especies nativas que
representan una diversidad de tipos filogenéticos de las principales sucesiones
estacionales.
b. Dado que las sensibilidades varían entre las especies, cuando sea posible,
seleccione las especies más sensibles para el bioensayo.
También se recomienda que estas especies se usen junto con otras para servir como
controles en el sistema que se está probando. Skeletonema costatum es un
fitoplanceador de importancia ecológica que es común a una amplia gama geográfica de
aguas neríticas. Thalassiosira pseudonana, aunque tiene menos importancia ecológica,
es sensible a los metales pesados y tiene un tiempo de generación de 8 horas que ofrece
un valor más práctico en el establecimiento de respuestas toxicológicas.
2. Condiciones de cultivo
Las condiciones de cultivo para la prueba de especies generalmente deben reflejar sus
condiciones naturales. Para desarrollar cierta apariencia de uniformidad, se recomiendan
dos regímenes básicos. Para las especies templadas, es deseable una temperatura de
ciclo oscuro (ciclo 14:10). Para las formas de agua fría, se recomienda una temperatura
de 8 +/- 2 ° C, 2500-500 lux en un ciclo de 10:14. Los cultivos madre de la prueba de
especies deben mantenerse en enriquecido natural (Tabla 1 A). O aguas marinas
sintéticas (Tabla 2 A).
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Vitaminas:
Metales Traza:
Buffer:
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Los enriquecimientos de esterilidad que se deben añadir al medio de agua del mar antes
de la autoclave:
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
Componentes Concentraciones
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3. Agua de mar
La elección del agua de mar está dictada por la disponibilidad, calidad y costo. El agua de
mar natural a menudo se puede utilizar para bioensayos, aunque las variabilidades
inherentes en la calidad pueden complicar el análisis de los resultados. El agua limpia en
alta mar es adecuada si se observan las precauciones adecuadas durante la recolección y
el procesamiento. En general, se prefiere el agua de mar sintética por la constancia de su
composición y calidad, aunque los restos de contaminantes deben eliminarse mediante
purificación adicional. El costo de los productos químicos requeridos y la purificación es
generalmente equivalente al gasto de recolección, transporte y procesamiento de agua de
mar natural.
c. Salinidad
La salinidad de 30 °/oo se recomienda para todos los bioensayos. Los ajustes de salinidad
en aguas marinas naturales o sintéticas deben hacerse con vidrio destilado (silicato de
sodio) o agua desionizada.
d. Esterilización
Nutriente Cantidad
________________________________________________________________________
NaNO3 (Nitrato de sodio) 4.42 mg/l (50 µMN)
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4. Cristalería
Para trabajos relacionados con la toxicidad de los metales, la cristalería debe recibir el
siguiente tratamiento posterior al lavado. Para eliminar los problemas de contaminación
positiva o negativa, se aplica una monocapa de silico-polímero a todas las superficies que
entran en contacto con el agua de mar. El SC-87 * disponible comercialmente se prepara
como una solución al 5% en ciclohexano, se vierte en el drenaje y deja una película en las
superficies de los artículos de vidrio que han estado en contacto con la solución. El
resultado es una superficie completamente no productiva que, después de un doble
enjuague con agua destilada, está lista para su uso. Un recubrimiento a menudo dura dos
o tres ensayos antes de volver a recubrir. El recubrimiento nuevo se puede realizar sobre
el recubrimiento anterior o un álcali fuerte (2N NAOH + 10% ETOH) puede eliminar
completamente el recubrimiento anterior antes de volver a recubrir. En la mayoría de los
casos, el decapado alcohólico-alcalino se puede evitar usando un detergente caliente
cada vez antes de volver a recubrir.
a. Inóculo
b. Medio de bioensayo
c. Tóxicidad
d. Diseño
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La medición de los parámetros debe evaluarse al menos una vez cada 24 horas
durante la duración del experimento. Esto permite el cálculo de tasas de respuesta que
son importantes para interpretar el comportamiento del tóxico. La duración del
experimento debe ser adecuada para que la población de control complete su fase de
crecimiento logarítmico y alcance una tasa de crecimiento estacionario. También es
conveniente determinar para cultivos inhibidos: la duración de la fase de retraso, la tasa
máxima de crecimiento y el rendimiento máximo (Figura 1-A). Sin embargo, no toda esta
información puede estar fácilmente disponible en un solo ensayo y en todas las
concentraciones.
e. Modificaciones
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6. Parámetros
muestreo. El cual, cuando se grafica contra el tiempo, produce una curva de respuesta de
crecimiento. Esta curva se puede utilizar para determinar la fase logarítmica, la tasa o el
bajo crecimiento, y una densidad de población máxima para los cultivos de control y
eliminados.
a. Densidad de población
b. Biomasa poblacional
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c. Clorofila
La clorfila "a" se usa a menudo como una medida de la biomasa de algas. Están
disponibles las técnicas de absorbancia espectrofotométrica y de fluorescencia (in vivo e
in vitro) (Strickland y Parsons, 1968). La técnica espectofotométrica carece de sensibilidad
particularmente a bajas densidades celulares. Sin embargo, los sistemas fluorescentes
son más sensibles y se pueden usar a densidades celulares de menos de 1 x 10⁴
células/ml. La técnica de fluorescencia in vivo es particularmente útil porque no requiere
extracción y es muy sensible.
d. Asimilación de carbono 14
e. ATP – Concentración
La ATP, por otro lado, parece ser un excelente indicador de la biomasa viva,
aunque su medición rutinaria es algo costosa y puede no ser apropiada para desechos
biológicamente contaminados (es decir, lodo).
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7. Presentación de datos
K = ln _N t__ / ∆T
No
K = tasa de crecimiento
y el tiempo de generación:
G = ∆T
K
G = tiempo generacional
K = Tasa de crecimiento
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8. Toxicante estándar
9. Aplicaciones
b. Otra aplicación del bioensayo de algas es como una evaluación de la calidad del
agua. Si está siendo investigado un área impactada, muestras de agua se pueden
recoger a lo largo de un transecto o matriz, en función de los datos hidrográficos.
El agua se recolecta y procesa de acuerdo con las técnicas descritas en la sección
4 y luego se introduce con la especie de prueba que se ha cultivado en agua
enriquecida desde una estación de control. La tasa de crecimiento y la densidad
de población se pueden comparar de una estación a otra.
10. Observaciones
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Referencias Bibliográficas
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1. Introducción
El método descrito aquí es el diseñado para el análisis de los efectos del material vertido
en el océano en el crecimiento de algas marinas unicelulares, implica la adición de
residuos líquidos o extractos de lodos al medio de crecimiento de algas, adición de algas
al medio y medidas de crecimiento de 96 horas.
Debido a la capacidad de calcular EC50, los valores de los datos de bioensayos son
requeridos por la ley son necesarias diluciones de material vertido al mar, como es
imposible estimar la toxicidad potencial de algas, o Acción estimulante de cada lote de
material vertido en el océano. Las diluciones recomendadas pueden no ser suficientes
para producir EC50 valores en cada caso. La logística del bioensayo de algas es
complicada y requiere mucho tiempo, deben considerarse cuidadosamente antes de
imponer requisitos definidos a las organizaciones de prueba.
Number Species
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Filtre (con succión) el medio de agua de mar a través de un filtro de membrana de 0,22 U
(como el fabricado por Millipore Corporation, Bedford. Massachusetts 01730, número de
catálogo GSWP 047 00). Antes de filtrar, pasar 1 litro de HCl 0.1 N y 5 litros de agua
destilada de vidrio a través del filtro. Dispense 200 ml de medio en 500 ml de matraces
Erlenmeyer y use tapones de espuma de poliuretano para sellar los matraces, Autoclave a
120 ° C y presión de 20 lb durante 15 minutos. Los matraces deben haberse limpiado
lavándolos con detergente, empapándolos en HCl al 10% y aumentando 10 veces con
agua destilada.
Agregue 10 ml de cultivo de algas madre a cada matraz e incube sin agitar a una
iluminación de velas de 450-500 pies a 20 ° +/- 2 ° C con períodos alternos de luz (16
horas) y oscuridad (8 horas). Use técnicas microbiológicas estándar para flamear los
cuellos de los matraces cuando se transfieran algas.
a. Residuos líquidos
Los residuos líquidos deben ser probados, No será modificado antes de su uso.
Cuando se toman muestras líquidas para análisis, sin embargo, deben tomarse en
recipientes de vidrio con tapas forradas de teflón. La cristalería y los revestimientos se
deben tomar con detergente. Remojo durante la noche en HCl al 10%, se enjuaga 10
veces con agua destilada, se enjuaga una vez con acetona y se enjuaga de nuevo 10
veces con agua destilada el vidrio.
Fe Cl2. 6 H2 O*…………………………………………………….0.480 g
Mn Cl2. 4 H2 O*…………………………………………………….0.144 g
Zn SO4. 7 H2 O*…………………………………………………….0.045 g
Cu SO2. 5 H2 O*…………………………………………………….0.157 mg
Co Cl2. 6 H2 O*……………………………………………………..0.404 mg
H3BO3…………………………………………………………………0.140 g
Na2EDTA………………………………………………………………1.000 g
Agua Destilada…………………………………………………………1 l
Mezcla de Vitaminas:
Clorhidrato de Tiamina………………………………………………..50.0 mg
Biotina…………………………………………………………………..0.01 mg
B12………………………………………………………………………0.10 mg
Agua Destilada…………………………………………………………100 ml
K3PO4……………………………………………………………………3.0 g
NaNO3……………………………………………………………………50.0 g
Na2SIO3 . 9 H2 O……………………………………………………….20.0 g
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Agua Destilada…………………………………………………………..1l
Las soluciones acuosas preparadas de estas sales metálicas se mantienen a concentraciones tan altas
que se agrega 1 ml de cada una a un 1 litro de mezcla.
La Biotina se mantiene como 1 mg / 100 ml de solución madre alcohólica;
B12 en una solución acuosa de 10 g / 100 ml.
4. Agregue 1 parte de 3. a 9 partes de agua de mar artificial. Esta es una solución al 0,1%
de medio no diluido.
b. lodo
Cuando se van a analizar los lodos, se utilizará como agente de extracción agua
de mar artificial sin metales traza, sales menores o vitaminas. La salinidad del extractante
es de 30 partes por mil y el procedimiento es el siguiente:
4. Bioensayo
a. Preparación de algas.
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Agitar cada matraz para lograr una suspensión homogénea de células. Rápidamente,
extraiga una muestra de la suspensión homogénea con una pequeña pipeta y rellene
cada lado de una cámara de Neubauer o hemocitómetro Spencer de línea brillante.
Asegúrese de que la suspensión no se desborde en los canales del hemocitómetro
(cámara de Neubauer). Con un aumento de 100 x, cuente todas las celdas dentro y que
inciden en las 4 esquinas 1 mm2 de cada cuadrícula. Para encontrar el número de células
en 1 ml de la suspensión original, multiplique el recuento de los 10 cuadrados por 25.000.
b. Crecimiento de algas.
Incubar los cultivos agitados durante 96 horas. En ese momento, agregue dos
gotas de formalina al 10% en agua de mar artificial a cada matraz, espere cinco minutos,
agite los cultivos para resuspender las células a una suspensión homogénea y cuente en
una cámara de Neubauer ó hemocitómetro como se describe anteriormente.
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c. Controles no tratados
5. Análisis de resultados
Calcule los valores promedio para el número de células de algas por mililitro en
control y cada dilución de matraces tratados con desechos.
Eso produjo más de la mitad, y el recuento celular promedio en una dilución que
produjo menos de la mitad del recuento celular promedio de los matraces de control. La
dilución se debe trazar en el eje logarítmico. Dibuja una línea recta entre los dos puntos.
La concentración a la que esta línea cruza la línea de crecimiento del 50% es el valor de
EC50.
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1. Introducción
3. Agua Salada
Para la prueba de toxicidad aguda con Artemia, un criterio práctico para un agua
salada aceptable es que los animales de prueba sanos sobrevivan en ella durante la
incubación y las pruebas sin mostrar signos de estrés.
a. Diseño experimental
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Cada prueba requiere un control que consiste en que el mismo este en agua
salada, las condiciones y los animales que se utilizan en recipientes son material de
prueba. Una prueba no es aceptable si más del 10% de los animales de control mueren.
b. Temperatura
c. Salinidad
La salinidad del agua de prueba debe ser de 30 ° /oo antes de agregar el material a
probar.
d. Contenedores de prueba
Los recipientes de prueba deben limpiarse antes de su uso. Los recipientes nuevos deben
lavarse con detergente y enjuagarse con ácido clorhídrico (HCl) al 10%, acetona y agua
del grifo u otra agua limpia.
Al final de cada prueba, si los contenedores de prueba se vuelven a utilizar, deben (1)
vaciarse, (2) enjuagarse con agua, (3) limpiarse mediante el procedimiento adecuado para
eliminar el tóxico, por ejemplo. , ácido para eliminar metales y bases; detergente, solvente
orgánico o carbón activado para remover compuestos orgánicos; y (4) enjuagados con
agua. El ácido es útil para eliminar las incrustaciones y el hipoclorito (lejía) es útil para
eliminar la materia orgánica y para la desinfección. Todos los recipientes de prueba deben
enjuagarse con agua salada justo antes de usarlos.
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f. Concentraciones
g. Aireación de un bioensayo
h. Transferencia de animales
Los animales deben agregarse a los contenedores de prueba dentro de 1 hora después
de que se hayan realizado las diluciones adecuadas del material a probar y se haya
iniciado la aireación de un conjunto de contenedores de prueba.
i. Alimentación
j. Mediciones
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k. Observaciones
Para contar los animales muertos con precisión y con relativa facilidad, coloque los platos
de prueba en una superficie negra y sostenga un haz de luz estrecho paralelo al fondo del
plato. Al buscar en la superficie, el fondo y las áreas intermedias, se tienen en cuenta los
animales vivos. El uso de una pipeta de gotero para eliminar los animales vivos facilita el
conteo y disminuye la confusión de intentarlo.
Para contar los animales muertos con precisión y con relativa facilidad, coloque los platos
de prueba en una superficie negra y sostenga un haz de luz estrecho paralelo al fondo del
plato. Al buscar en la superficie, el fondo y las áreas intermedias, se tienen en cuenta los
animales vivos. El uso de una pipeta de gotero para eliminar los animales vivos facilita el
conteo y disminuye la confusión de tratar de contar las larvas en movimiento. Debido a la
turbidez que puede acompañar a las concentraciones más altas de materiales de lodo,
puede ser útil un período de sedimentación de 5 minutos. Verter el contenido del
recipiente de prueba en un recipiente limpio con una superficie mayor puede hacer que
los animales sean más visibles. También pueden ser útiles varios dispositivos de
aumento.
El efecto adverso más utilizado para estudiar la toxicidad aguda con animales acuáticos
es la muerte. Sin embargo, la muerte no se puede determinar fácilmente para algo de
Artemia, y por lo tanto una EC50 (concentración efectiva al 50% de los animales de
prueba). El efecto generalmente utilizado para determinar una EC50 es la inmovilización,
que se define como la incapacidad para moverse, excepto por una actividad menor de los
apéndices o pérdida de equilibrio.
5. Cálculos e informes
Al final del período de prueba, los bioensayos se terminan y se determinan los valores de
LC50 o EC50.
f. Cálculos
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Una LC50 es una concentración a la que murió el 50% de los animales experimentales y
una EC50 es una concentración a la que se afectó el 50% de los animales
experimentales. Cualquiera de los dos puede ser un valor interpolado basado en
porcentajes de animales que mueren o se ven afectados en dos o más concentraciones.
Estimar la LC50 o EC50 por interpolación implica trazar los datos en papel de
coordenadas semilogarítmicas o animales afectados en el eje aritmético. Se dibuja una
línea recta entre dos puntos que representan la muerte o el efecto en concentraciones
que fueron letales o efectivas contra más de la mitad y menos de la mitad del organismo.
La concentración a la que la línea cruza la mortalidad del 50% o la línea de efecto es el
valor de LC50 o EC50. Si el 50% de los animales de prueba no se ven afectados por la
concentración más alta, se debe informar el porcentaje de afectados.
g. Informes
Cualquier desviación de este método debe anotarse en todos los informes de resultados.
Un informe de los resultados de las pruebas aireadas y sin aire debe incluir:
2. Una descripción detallada del material analizado, que incluye la fecha y la hora
de la colección, la composición, las propiedades físicas y químicas conocidas y la
variabilidad del material analizado;
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