Princípio da PCR em Tempo Real

Princípio da PCR em Tempo Real

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em Tempo Real é capaz de monitorar o progresso
da PCR enquanto ela progride (ou seja, em tempo real). Os dados são, desta forma, coletados
ao longo da PCR, ao invés de o serem apenas no final da reação. Isso revoluciona
completamente o modo de abordagem da quantificação de DNA e RNA pela PCR. A PCR em
tempo real utiliza o momento durante o ciclo da reação no qual a amplificação de um alvo é
detectada pela primeira vez, ao invés da quantidade de alvo acumulado após um número fixo
de ciclos. Quanto mais alto o número de cópias iniciais do ácido nucléico alvo, mais rápido será
observado o aumento significativo na fluorescência. A PCR em tempo real também pode ser
utilizada para realizar um ensaio endpoint (também chamado “ensaio de leitura de placa”), que
mede a quantidade de produto da PCR acumulado ao final dos ciclos da reação.

Sobre os Sistemas para Detecção de Seqüências

 Sistema TaqMan® (também conhecido como “ensaio para nuclease 5´ fluorescente”)
 Sistema do corante SYBR® Green I

Sistema TaqMan®
O sistema TaqMan utiliza uma sonda fluorescente para possibilitar a detecção de um produto
específico da PCR conforme esse se acumula durante os ciclos da reação.

Tipos de Ensaios que Utilizam o Sistema TaqMan

O sistema TaqMan pode ser utilizado para os seguintes tipos de ensaios:
 RT-PCR one-step (de uma etapa) para quantificação de RNA
 RT-PCR two-step (de duas etapas) para quantificação de RNA
 Quantificação de DNA/cDNA
 Discriminação alélica
 Presença/Ausência utilizando um controle positivo interno (IPC )

Sistema SYBR Green I

O sistema do corante SYBR Green I utiliza o corante SYBR Green I, que possui ligação
altamente específica ao DNA dupla-fita, para detectar o produto da PCR conforme ele se
acumula durante os ciclos da reação.
A diferença mais importante entre o sistema SYBR Green I e o sistema TaqMan é que o SYBR
Green I detectará todo DNA dupla-fita, inclusive produtos de reação não específicos. Uma
reação bem otimizada é, portanto, essencial para resultados precisos.

Tipos de Ensaio que Utilizam o Sistema SYBR Green I

O ensaio do corante SYBR Green I pode ser utilizado para os seguintes tipos de ensaios:

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 RT-PCR one-step (de uma etapa) para quantificação de RNA
 RT-PCR two-step (de duas etapas) para quantificação de RNA
 Quantificação de DNA/cDNA

Sistema TaqMan
Histórico
Inicialmente, foram utilizados corantes intercalantes do DNA para medir os produtos da PCR em
tempo real. A desvantagem desses corantes é que podem detectar não apenas o acúmulo de
produtos específicos, como também o acúmulo de produtos não específicos da PCR.

Desenvolvimento do Sistema TaqMan

Os sistemas em tempo real para PCR foram aperfeiçoados pela introdução de sondas
marcadas com fluorescência que utilizam atividade nuclease 5´ da Taq DNA polimerase. A
disponibilidade destas sondas fluorescentes permitiu o desenvolvimento de um método em
tempo real para detecção somente de produtos de amplificação específicos.

Como o Funciona o Sistema TaqMan

O sistema TaqMan utiliza uma sonda fluorescente para permitir a detecção de um produto
específico da PCR conforme este se acumula durante os ciclos da PCR. Eis aqui como ele
funciona:

Etapas do Processo
1. Uma sonda (oligonucleotídeo) é construída contendo um corante reporter fluorescente na
extremidade 5´ e um corante quencher (silenciador) na extremidade 3´. Enquanto a sonda está
intacta, a proximidade do quencher reduz bastante a fluorescência emitida pelo corante reporter
através da transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) através do
espaço.
2. Se a seqüência alvo estiver presente, a sonda se anela logo após um dos primers e é clivada
através da atividade da nuclease 5´ da Taq DNA polimerase enquanto o primer é estendido.
3. Esta clivagem da sonda:
 Separa o corante reporter do corante quencher, aumentando o
sinal do corante reporter.
 Remove a sonda da fita alvo, permitindo que a extensão do
primer continue até o final da fita molde. Assim, a inclusão da sonda não inibe o
processo geral da PCR.
4. Moléculas adicionais do corante reporter são clivadas de suas respectivas sondas em cada
ciclo, resultando em um aumento na intensidade de fluorescência, que é proporcional à
quantidade de amplicon produzido.

Dois Tipos de Sondas TaqMan®

A Applied Biosystems oferece dois tipos de sondas TaqMan:

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  Sondas TaqMan® (com corante TAMRA™ como o corante quencher)
 Sondas TaqMan® MGB

Sondas TaqMan® MGB Recomendadas para Ensaios de Discriminação Alélica

A Applied Biosystems recomenda o uso das sondas TaqMan MGB para os ensaios de
discriminação alélica, principalmente quando as sondas TaqMan convencionais excedem 30
nucleotídeos. As sondas TaqMan MGB contêm:
 Um quencher não-fluorescente na extremidade 3´ – Os
instrumentos SDS podem medir as contribuições do corante reporter mais
precisamente, pois o quencher não fluoresce.
 Um minor groove binder na extremidade 3´ – O minor groove
binder aumenta a temperatura de melting (Tm) das sondas, permitindo o uso de
sondas menores.
Conseqüentemente, as sondas TaqMan MGB apresentam diferenças maiores nos valores Tm
entre as sondas específicas e não específicas, o que fornece uma discriminação alélica mais
precisa.

Vantagens do sistema TaqMan

As vantagens do sistema TaqMan são as seguintes:
 É necessário a hibridização específica entre a sonda e o alvo
para gerar sinal fluorescente.
 As sondas podem ser marcadas com corantes reporter distintos
e distinguíveis, os quais permitem a amplificação de duas seqüências distintas em um
mesmo tubo de reação.
 O pós-processamento da PCR é eliminado, o que reduz a mão-
de-obra do ensaio e os custos de materiais.

Desvantagem do Sistema TaqMan

A principal desvantagem do sistema TaqMan é a necessidade de síntese de diferentes sondas
para seqüências distintas.

Sistema SYBR® Green I

Histórico
Pequenas moléculas que se ligam ao DNA dupla-fita podem ser divididas em duas classes:
 Intecalantes
 Minor-groove binders
Independentemente do método de ligação, há duas exigências para um corante de ligação ao
DNA ser utilizado para detecção em tempo real da PCR.
 Aumento da fluorescência quando ligado ao DNA dupla-fita.

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  Nenhuma inibição da PCR
A Applied Biosystems desenvolveu condições que permitem o uso do corante SYBR Green I na
PCR sem inibição da reação, e aumento da sensibilidade de detecção quando comparado ao
brometo de etídio.

Como funciona o Sistema SYBR® Green I

O sistema SYBR Green I utiliza corante SYBR Green I para detectar produtos da reação em
cadeia de polimerase (PCR) através da ligação ao DNA dupla-fita formado durante a reação.
Eis aqui como ele funciona:

Etapas do Processo
Quando o corante SYBR Green I é adicionado à amostra, ele imediatamente se liga a todo DNA
dupla-fita presente na amostra.
1. Durante a PCR, a DNA Polimerase AmpliTaq Gold ® amplifica a seqüência alvo, o que cria
os produtos da PCR, ou “amplicons”.
2. O corante SYBR Green I se liga a cada nova cópia de DNA dupla-fita.
3. Conforme a PCR progride, mais amplicons são criados. Como o SYBR Green I se liga a
todo DNA dupla-fita, o resultado é um aumento na intensidade da fluorescência
proporcional à quantidade de produto gerado pela PCR.

Vantagens do SYBR Green I

As vantagens do sistema do corante SYBR Green I são as seguintes:
 Pode ser utilizado para monitorar a amplificação de
qualquer seqüência de DNA dupla-fita.
 Não é necessário sonda, o que reduz a configuração do
ensaio e os custos de execução.

Desvantagem do SYBR Green I

A principal desvantagem do sistema SYBR Green I é poder gerar sinais falso-positivos, ou seja,
ele também pode se ligar a seqüências não específicas de DNA dupla-fita uma vez que o a
molécula de SYBR Green I se liga a qualquer DNA dupla-fita.

Considerações Adicionais
Outro aspecto da utilização dos corantes de ligação ao DNA é que múltiplos corantes se ligam a
uma única molécula amplificada. Isso aumenta a sensibilidade de detecção para produtos de
amplificação. Uma conseqüência da ligação de múltiplos corantes é que a quantidade de sinal é
dependente da massa de DNA dupla-fita produzido na reação. Assim, se as eficiências de
amplificação são as mesmas, a amplificação de um produto mais longo irá gerar mais sinal do
que um mais curto. Com a utilização da sonda fluorescente, um único fluoróforo é liberado da
supressão pelo quencher para cada molécula amplificada sintetizada, independentemente de
seu comprimento.

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Sobre Ensaios de Quantificação
O que é um Ensaio de Quantificação?
Um ensaio de quantificação é um ensaio da PCR em tempo real. Esse ensaio mede (quantifica)
a quantidade de ácido nucléico alvo durante cada ciclo de amplificação da PCR. O alvo pode
ser DNA, cDNA, ou RNA. Há três tipos de Ensaios de Quantificação discutidos nesse manual:
 Quantificação de DNA/cDNA
 Quantificação de RNA utilizando reação em cadeia de polimerase com transcrição
reversa (RT-PCR) one step (de uma etapa).
 Quantificação de RNA utilizando RT-PCR two step (de duas etapas)

Termos Utilizados na Análise de Quantificação

Amplicon: Um curto segmento de DNA gerado pelo processo da PCR.

Gráfico da amplificação (Amplification Plot): O gráfico do sinal fluorescente em comparação
ao número do ciclo
Baseline: Os ciclos iniciais da PCR, nos quais há pequena alteração no sinal fluorescente
Ct (ciclo threshold): O número do ciclo no qual a fluorescência passa o threshold
NTC (no template control) – Uma amostra que não contém o alvo. É utilizado para verificar a
qualidade da amplificação.
Ácido nucléico alvo (target template) – Seqüência de DNA ou RNA que você deseja amplificar.
Referência passiva: Um corante que fornece uma referência interna para a qual o sinal do
corante reporter pode ser normalizado durante a análise dos dados. A normalização é
necessária para corrigir as flutuações causadas por alterações na concentração ou volume. Um
corante de referência passiva está incluído em todos os kits de reagentes da Applied
Biosystems.
Rn (reporter normalizado): A intensidade de emissão de fluorescência do corante reporter
dividida pela intensidade de emissão de fluorescência do corante da referência passiva.
Rn+: O valor Rn da reação contendo todos os componentes, incluindo o template
Rn – O valor Rn de uma amostra não reagente. O valor Rn pode ser obtido a partir de :
 Ciclos iniciais de uma PCR em tempo real (aqueles ciclos
antes de um aumento detectável na fluorescência), OU
 Uma reação que não contenha nenhum template
ΔRn (delta Rn): A magnitude do sinal gerado por um determinado conjunto de condições da
PCR. O valor ΔRn é determinado pela seguinte fórmula: (Rn+) – (Rn-)
Padrão: Uma amostra de concentração conhecida utilizada para construir uma curva padrão.
Correndo padrões de concentrações variadas, você cria uma curva padrão da qual você pode
extrapolar a quantidade de uma amostra desconhecida.

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Threshold: O desvio padrão médio de Rn para os ciclos iniciais da PCR, multiplicado por um
fator ajustável. O threshold deve ser ajustado na região associada com um crescimento
exponencial de produto da PCR.
Desconhecida: Uma amostra contendo uma quantidade de template desconhecida. Esta é a
amostra cuja quantidade você quer determinar.

Como Funcionam os Ensaios de Quantificação para PCR em Tempo Real

Nos ciclos iniciais da PCR, há uma pequena alteração no sinal de fluorescência. Essa define o
Baseline para o gráfico de amplificação. Um aumento na fluorescência acima do Baseline indica
a detecção de alvo acumulado. Um threshold de fluorescência fixa pode ser ajustado acima do
Baseline. O parâmetro CT (ciclo threshold) é definido como o ciclo no qual a fluorescência
ultrapassa o threshold.

Quantificação Relativa e Quatificação Absoluta

Visão Geral
Para calcular os resultados dos seus ensaios de quantificação, você pode utilizar quantificação
absoluta ou relativa.

O que é Quantificação Absoluta?

O ensaio de quantificação absoluta é utilizado para quantificar amostras desconhecidas
interpolando suas quantidades a partir de uma curva padrão.

Exemplo
A quantificação absoluta deve ser utilizada para correlacionar o número de cópias virais com um
estado de uma doença. É de interesse para o pesquisador saber o número exato de cópias do
RNA alvo em uma determinada amostra biológica para monitorar o progresso da doença.
A quantificação absoluta pode ser realizada com os dados de todos os instrumentos SDS, no
entanto, as quantidades absolutas dos padrões devem ser conhecidas inicialmente por algum
método independente.

O que é Quantificação Relativa?

Um ensaio de quantificação relativa é utilizado para analisar alterações na expressão gênica em
uma determinada amostra relativa à outra amostra de referência (tal como uma amostra
controle não tratada).

Exemplo
A quantificação relativa deve ser utilizada para medir a expressão gênica em resposta a um
medicamento. O nível de expressão gênica de um gene específico em uma amostra tratada

7
pelo medicamento seria comparada em relação ao nível de expressão gênica desse mesmo
gene em uma amostra não tratada.

Métodos de Cálculo para a Quantificação Relativa

A quantificação relativa pode ser realizada com dados de todos os instrumentos SDS. Os
métodos de cálculo utilizados para quantificação relativa são:
 Método da Curva Padrão
 Método CT Comparativo

Determinação do Método a Ser Utilizado

Todos os métodos podem oferecer resultados equivalentes. Ao determinar o método que você
deseja utilizar, observe o seguinte:
 Realizar amplificações do alvo e do controle endógeno em tubos separados utilizando
o método de análise de curva padrão exige uma menor quantidade de otimização e
validação.
 Para utilizar o método CT comparativo, um experimento de validação deve ser
realizado para mostrar se as eficiências das amplificações do alvo e do controle
endógeno são aproximadamente iguais. A vantagem de utilizar o método CT
comparativo é que não é necessário utilizar uma curva padrão. Isso aumenta o
rendimento, pois não é mais necessário a utilização dos poços para as amostras da
curva padrão. Isso também elimina a possibilidade de qualquer erro de diluição das
amostras para montagem da curva padrão.
 Para amplificar o alvo e o controle endógeno no mesmo tubo, as concentrações
limitantes de primer devem ser identificadas e não devem afetar os valores CT. Ao
executar as duas reações no mesmo tubo, o rendimento é maior e os efeitos dos
erros de pipetagem são reduzidos.

Termos Utilizados
Os seguintes termos são utilizados nesta discussão de quantificação absoluta e relativa.
Padrão: Uma amostra de concentração conhecida utilizada para construir uma curva padrão.
Referência: Um sinal ativo ou passivo utilizado para normalizar os resultados experimentais.
Os controles endógenos e exógenos são exemplos de referências ativas. Referência ativa
significa que o sinal é gerado como resultado da amplificação da PCR. A referência ativa
apresenta seu próprio conjunto de primers e sondas.
Controle endógeno: RNA ou DNA presente isoladamente em cada amostra experimental. Ao
utilizar um controle endógeno como uma referência ativa, você pode normalizar a quantificação
de um RNA mensageiro (mRNA) alvo para diferenças na quantidade de RNA total adicionado a
cada reação.
Controle exógeno: RNA ou DNA conhecido inserido em cada amostra numa concentração
conhecida. Uma referência exógena ativa é normalmente uma construção in vitro que pode ser
utilizada como um controle positivo interno (IPC) para diferenciar os verdadeiros alvos negativos
da inibição da PCR. Uma referência exógena também pode ser utilizada para normalizar

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diferenças na eficiência da extração da amostra ou da reação para síntese de DNA
complementar (cDNA) pela transcriptase reversa. Se uma referência ativa for utilizada ou não, é
importante sempre utilizar uma referência passiva contendo o corante ROX, para normalizar
flutuações no sinal fluorescente não relacionadas à PCR.
Quantidade do alvo normalizada: O menor número de unidades que pode ser utilizado para
comparar a quantidade relativa do alvo em diferentes amostras.
Calibrador: Uma amostra utilizada como a base para resultados comparativos.

Método da Curva Padrão para Quantificação Relativa

Visão Geral
É fácil preparar curvas padrões para quantificação relativa, pois a quantidade é expressa
relativa a uma amostra de referência, tal como o calibrador. Para todas as amostras
experimentais, a quantidade do alvo é determinada a partir da curva padrão e dividida pela
quantidade alvo do calibrador. Assim, o calibrador se torna a amostra 1× e todas as outras
quantidades são expressas como uma diferença de n vezes em relação ao calibrador. Como um
exemplo, em um estudo do efeito de um medicamento na expressão gênica, o controle não
tratado seria um calibrador apropriado.

Instruções Importantes
As instruções abaixo são importantes para o uso apropriado do método de curva padrão para
quantificação relativa.
 É importante que o DNA ou RNA estoque seja diluído com
precisão, mas as unidades utilizadas para expressar esta diluição são irrelevantes. Se
utilizar uma diluição na ordem de duas vezes, de uma preparação de RNA total de uma
linhagem celular controle, para construir uma curva padrão, as unidades podem ser os
valores de diluição 1; 0,5; 0,25; 0,125; e assim por diante. Ao utilizar o mesmo RNA ou
DNA estoque para preparar as curvas padrão para múltiplas placas, as quantidades
relativas determinadas podem ser comparadas entre as placas.
 É possível utilizar uma curva padrão de DNA para
quantificação relativa de RNA. Isso requer a suposição de que a eficiência da
transcrição reversa do alvo seja a mesma em todas as amostras, mas o valor exato
desta eficiência não precisa ser conhecido.
 Para a quantificação normalizada para um controle
endógeno, curvas padrão são preparadas para o alvo e para o controle endógeno. Para
cada amostra experimental, a quantidade do alvo e do controle endógeno é determinada
a partir de uma curva padrão apropriada. Então, a quantidade alvo é dividida pela
quantidade do controle endógeno para obter um valor alvo normalizado. Novamente,
uma das amostras experimentais é o calibrador ou a amostra 1×. Cada valor alvo
normalizado é dividido pelo valor do calibrador (também normalizado pelo seu
endógeno), para criar os níveis de expressão relativa.

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Controle Endógeno
A amplificação de um controle endógeno pode ser realizada para padronizar a quantidade da
amostra de RNA e DNA adicionada à reação. Para a quantificação da expressão gênica, os
pesquisadores têm utilizado como um controle endógeno a ß-actina, o gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase (GAPDH), o RNA ribossômico (rRNA), ou outros RNAs.

Padrões
Visto que a quantidade de amostra é dividida pela quantidade do calibrador, a unidade da curva
padrão desaparece. Assim, tudo que é necessário para os padrões é que sejam conhecidas
suas diluições relativas. Para a quantificação relativa, isso significa que qualquer DNA ou RNA
estoque contendo o alvo apropriado pode ser utilizado para preparar uma curva padrão.

Método CT Comparativo para Quantificação Relativa

O método CT comparativo é semelhante ao método da curva padrão, exceto pelo fato que este
utiliza a fórmula aritmética 2-CT para atingir o mesmo resultado para a quantificação relativa.

Fórmulas Aritméticas:
Para o método CT comparativo seja validado, a eficiência da amplificação do alvo (seu gene de
interesse) e a eficiência da amplificação da referência (seu controle endógeno) devem ser
aproximadamente iguais.
Para mais informações sobre a utilização do método CT comparativo para a quantificação
relativa, consulte o Manual do Usuário Nº 2: Quantificação Relativa de Expressão Gênica (PN
4303859).

Método da Curva Padrão para Quantificação Absoluta

Visão Geral
O método de curva padrão para quantificação absoluta é semelhante ao método de curva
padrão para quantificação relativa, exceto que as quantidades absolutas dos padrões devem
ser inicialmente conhecidas através de algum método independente.

Instruções Importantes
As instruções abaixo são importantes para o uso apropriado do método de curva padrão para
quantificação absoluta.
 É importante que o DNA ou RNA seja uma de espécie única e
pura. Por exemplo, o DNA plasmidial preparado a partir de E. coli freqüentemente está
contaminado com RNA, o que aumenta a medido de A 260 e, consequentemente aumenta
o número de cópias determinadas para o plasmídeo.
 É necessária uma pipetagem precisa, pois os padrões devem ser
diluídos em várias ordens de magnitude. O DNA plasmidial ou RNA transcrito in vitro
devem ser concentrados para medir um valor A 260 preciso. Esse RNA ou DNA

10
 concentrado deve então ser diluído 106-1012 vezes para estar em uma concentração
semelhante ao alvo nas amostras biológicas.
 A estabilidade dos padrões diluídos deve ser considerada,
principalmente para o RNA. Divida os padrões diluídos em pequenas alíquotas,
armazene-as à -80ºC e descongele-as somente uma hora antes do uso.
Geralmente não é possível usar o DNA como um padrão para quantificação absoluta de RNA,
pois não há um controle quanto à eficiência da etapa de transcrição reversa.

Construção de Curva Padrão para Quantificação Absoluta

As quantidades absolutas dos padrões devem ser conhecidas em primeiro lugar através de
algum método independente. O DNA plasmidial e o RNA transcrito in vitro são comumente
utilizados para preparar padrões absolutos. A concentração é medida pelo A260 e convertida ao
número de cópias utilizando o peso molecular do DNA ou RNA.

Curva Padrão de DNA:

1. Amplificar o segmento de DNA alvo do teste, utilizando preferencialmente primers externos,
por meio de PCR convencional.
2. Clonar o produto da PCR acima por meio de ligação a vetor do tipo plasmídeo e replicação
em bactérias competentes.
3. Selecionar cerca de 5 a 10 colônias que apresentem o plasmídeo recombinante e isolar o
DNA por meio de miniprep.
4. Confirmar a presença do inserto (segmento alvo) nas colônias selecionadas por meio de
PCR e/ou seqüenciamento.
5. Linearizar o clone contendo o inserto de interesse por meio de digestão com enzima de
restrição com sítio único na região “polylinker” do plasmídeo (esta informação consta do mapa
do plasmídeo, no manual que acompanha o kit de clonagem). Certifique-se de que o produto de
PCR que foi clonado não possui sítio de restrição para a enzima selecionada.
6. Purificar o produto da reação acima utilizando acetato de sódio e etanol e verificar a
presença de uma única banda do tamanho esperado (plasmídeo + inserto) por eletroforese em
gel de agarose.
7. Quantificar de forma precisa o DNA acima.
8. Utilizar os seguintes parâmetros para converter a concentração obtida em ng/uL para n°
moléculas/uL: PM médio de 1 pb de DNA =649 g/mol; 1 mol = 6,02 x 1023 moléculas.
9. Realizar as diluições seriadas utilizando algum tipo de carreador como diluente
(recomendamos Yeast tRNA 100 ng/uL, Ambion P/N AM7119).

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Curva Padrão de RNA:
1. Amplificar o segmento alvo do teste por meio de transcrição reversa e PCR convencional
(protocolo “one” ou “two-step”), utilizando preferencialmente primers externos.
2. Clonar o produto da PCR acima por meio de ligação a um plasmídeo contendo promotor
T7, SP6 ou T3 e replicação em bactérias competentes.
3. Selecionar cerca de 5 a 10 colônias que apresentem o plasmídeo recombinante e isolar o
DNA por meio de miniprep.
4. Identificar, por seqüenciamento, as colônias que apresentam o inserto (segmento alvo) na
orientação correta para transcrição por seqüenciamento.
5. Linearizar o clone contendo o inserto de interesse por meio de digestão com enzima de
restrição com sítio único na região “polylinker” do plasmídeo correspondente à extremidade 3’
do transcrito esperado (esta informação consta do mapa do plasmídeo, no manual que
acompanha o kit de clonagem). Certifique-se de que o produto de PCR que foi clonado não
possui sítio de restrição para a enzima selecionada.
6. Transcrever com a RNA polimerase apropriada (recomendamos a utilização do
“MEGAscript® High Yield Transcription Kit” da Ambion P/N AM1330, AM1333 e AM1338 para as
RNAs polymerases SP6, T7 e T3, respectivamente). Tratar o produto da transcrição com Dnase
antes de prosseguir para a próxima etapa.
7. Purificar o transcrito (recomendamos a utilização do MEGAclear™ Kit da Ambion P/N
AM1908). Concentrar o transcrito utilizando acetato de amônia (incluso no kit).
8. Quantificar de forma precisa o trasncrito acima.
9. Utilizar os seguintes parâmetros para converter a concentração obtida em ng/uL para n°
moléculas/uL: PM médio de 1 b de ssRNA = 320 g/mol; 1 mol = 6,02 x 10^23 moléculas.
10. Realizar as diluições seriadas utilizando algum tipo de carreador como diluente
(recomendamos Yeast tRNA 100 ng/uL, Ambion P/N AM7119).

12
Guia para Quantificação Relativa da Expressão
Gênica Utilizanda PCR Quantitativa em Tempo
Real

13
Introdução: PCR em Tempo Real e Quantificação Relativa da
Expressão Gênica

1. Introdução

2. O que é Quantificação Relativa?

Os métodos para Quantificação Relativa da Expressão Gênica permitem quantificar diferenças
no nível de expressão de um alvo específico (gene) entre as diferentes amostras. A produção
de dados é expressa como uma alteração ou uma diferença no número de vezes nos níveis de
expressão. Por exemplo, você verificar a alteração na expressão de um gene em particular em
um determinado período de tempo nas amostras tratadas em comparação a amostras não
tratadas. Para esse estudo hipotético, você pode escolher uma amostra de calibrador (ou seja,
não tratada no dia 0) e um gene de controle endógeno para normalizar seus resultados. Para
todas as amostras, tanto os níveis dos genes alvos e controle endógeno seriam avaliados pela
PCR em tempo real. Os resultados (níveis do alvo normalizados pelos níveis do controle
endógeno) seriam expressos em um formato como "No dia 30, a amostra A apresentou um nível
de expressão do gene alvo 10 vezes maior do que no dia 0”.
Se desejar obter quantidades absolutas dos genes alvos, você precisa realizar a quantificação
absoluta, que está além do escopo deste documento.

3. Termos e Acrônimos
Termos/ Acrônimos Definição
Referência Ativa Um sinal ativo usado para normalizar os resultados
experimentais. Os controles endógenos são exemplos de uma
referência ativa. Referência ativa significa que o sinal é gerado
como resultado da amplificação da PCR. A referência ativa tem
seu próprio conjunto de primers e sonda.
Amplicon Um produto de PCR gerado a partir de um template de DNA ou
cDNA.
Eficiência de A taxa na qual um amplicon da PCR é gerado, geralmente
amplificação medida como um valor percentual. Se um amplicon dobrar em
quantidade durante a fase geométrica de amplificação da PCR,
então se diz que a PCR foi 100% eficiente. O valor designado
para a eficiência de uma reação de PCR é uma medida de
desempenho global do ensaio de PCR em tempo real.
Baseline O sinal fluorescente de fundo (Background) emitido durante os
primeiros ciclos da PCR antes do instrumento de PCR em
tempo real detectar a amplificação do produto da PCR.
Calibrador Uma amostra utilizada como base para resultados de
expressão comparativa
CT Ciclo threshold. O CT é o número do ciclo no qual a
fluorescência gerada dentro de uma reação cruza a linha
14
 threshold. Os valores de CT são logarítmicos e são usados
diretamente (método CT comparativo) ou indiretamente
(interpolação para curvas padrões para criar valores lineares)
para as análises quantitativas.
Produtos de Custom TaqMan® Gene Expression Assays (Ensaios de
Expressão Gênica Expressão Gênica Custom TaqMan®) são produtos
Custom TaqMan®1 desenhados, sintetizados e entregues como cojuntos de
primers e sonda MGB TaqMan® pré-misturados baseados nas
informações de seqüência enviadas pelo cliente.
Produtos de Custom TaqMan® Genotyping Assays (Ensaios de
Genotipagem Genotipagem Custom TaqMan®) são produtos desenhados,
Custom TaqMan®2 sintetizados e entregues como conjuntos de primers e sonda
MGB TaqMan® pré-misturados baseados nas informações de
seqüência enviadas pelo cliente.
Faixa de dinâmica A faixa (máxima para mínima) de concentrações de amostra ou
quantidade inicial que um determinado ensaio é capaz de
detectar.
Controle endógeno Seqüência de um gene contida em uma amostra que é usada
para normalizar as quantidades do alvo. Além da seqüência
alvo, um controle endógeno é quantificado como um meio de
correção dos resultados que podem ser distorcidos pelas
diferenças da quantidade inicial de ácido nucléico. Os controles
endógenos são exemplos de uma referência ativa.
Réplica experimental Uma amplificação que usa os mesmos reagentes da PCR
como em outra amplificação e que usa templates de amostras
semelhantes, porém não idênticas. As réplicas experimentais
fornecem informações sobre a precisão geral do experimento.
Por exemplo, se você deseja examinar o efeito do tratamento
com um medicamento no nível de expressão do mRNA de
camundongo, você trataria vários camundongos de forma
idêntica com o medicamento para determinar a variação de
resposta na população de camundongos. Um grupo de dez
camundongos representaria dez réplicas experimentais.
Réplica idêntica Uma amplificação realizada em múltiplos poços usando a
mesma preparação de template e os mesmos reagentes da
PCR. As réplicas idênticas fornecem:
 Preservação de dados: Se a amplificação falhar em um
poço, as réplicas em outros poços podem, potencialmente,
fornecer os dados.
 Monitoramento: As réplicas podem ser usadas para
monitorar a precisão da amplificação da PCR e das etapas
de detecção.
Referência Passiva Um corante que forneça uma referência de fluorescência
interna para a qual um sinal do corante reporter pode ser
normalizado durante a análise dos dados. O corante de
referência não participa da PCR. Esta normalização corrige as

15
 flutuações de fluorescência que são causadas por alterações
na concentração ou no volume da reação. A falha em usar um
corante de referência passiva pode comprometer a precisa
quantificação do alvo. A Applied Biosystems incorpora o
corante ROXTM como referência passiva interna em todos os
ensaios de PCR em tempo real.
PDAR TaqMan® TaqMan® Pre-Developed Assay Reagents (Reagentes de
Ensaio Pré-Desenvolvidos TaqMan®) (PDARs TaqMan®) são
conjuntos de primers e sondas desenhados para amplificar
seqüências do alvo específico e do controle endógeno em
amostras de cDNA usando o ensaio da nuclease 5’.
Testes de Estatíticos Etapa de Amplificação e Detecção: O grau para o qual as
de Precissão réplicas idênticas fornecem valores semalhantes (grau de
concordância). Este tipo de precisão pode ser usado para
monitorar a precisão da pipetagem do reagente e do template,
homogeneidade do template e desempenho do instrumento.
Experimental: O grau para o qual as réplicas experimentais
fornecem valores semelhantes.
Observação: Para quantificação relativa, uma melhor precisão
(idêntica e experimental) permite que menores diferenças no
número de cópias de um ácido nucléico sejam distinguidas
com maior confiança estatística.
Orientações para Uma série de orientações sobre o desenho de experimentos
desenvolvimento de desenvolvidas pela Applied Biosystems especificam:
ensaios rápidos
 O uso dos Ensaios Genômicos da Applied Biosystems ou
desenho automatizado de primer e sonda usando o
Software Primer Express ®
 O uso de TaqMan® Universal PCR Master Mix ou SYBR®
Green I PCR Master Mix (fornece concentrações
padronizadas dos componentes e simplifica a configuração
do ensaio)
 Os parâmetros de ciclagem universais (permite que vários
ensaios sejam executados na mesma placa)
 Concentrações padrões do primer e da sonda (para
eliminar a otimização do ensaio).
Gene de Referência Um sinal fluorescente ativo usado para normalizar os
resultados experimentais. Os controles endógenos e exógenos
são exemplos de referência ativa. Uma referência ativa gera o
sinal como resultado da amplificação da PCR usando seu
próprio conjunto de primers/sonda.
Padrões Uma amostra de concentração conhecida usada para construir
uma curva padrão.
Ensaios de Ensaios de Expressão Gênica TaqMan® são ensaios de
Expressão Gênica expressão gênica pré-formulados e biologicamente

16
TaqMan®3 informativos para rápida detecção e quantificação de
transcritos de mRNA de ratos, camundongos e seres humanos.
Cada produto é entregue como um pré-mix de primers e sonda
MGB TaqMan® em uma concentração de 20X.
Ensaios de Ensaios de Genotipagem TaqMan® são conjuntos de primers e
Genotipagem sonda validados, biologicamente informativos para detecção de
TaqMan®4 SNPs humanos. Cada produto é entregue como um pré-mix de
primers e sondas MGB TaqMan® em uma concentração de
20X.
Sondas MGB Sondas fluorescentes que são desenhadas e sintetizadas
TaqMan® como sondas MGB TaqMan® que contêm um motivo minor-
groove-binding que aumenta a diferença Tm entre as sondas
que se anelam perfeitamente das que não se anelam
perfeitamente. Além disso, as sondas MGB TaqMan ® contém
um quencher não fluorescente que fornece melhor resolução
espectral quando são utilizados múltiplos fluoróforos em uma
reação. As sondas MGB TaqMan® são ideais para o uso tanto
em ensaios de expressão gênica como em ensaios de análise
de SNP.
Alvo Uma seqüência de RNA ou DNA ou gene de interesse.
Amostra Uma amostra comparada com um calibrador como um meio de
testar uma alteração no parâmetro (por ex., o nível de
expressão de um gene) após uma intervenção como um
tratamento com medicamento, transformação em tumor,
tratamento com fator de crescimento e outros.
Threshold Um nível d sinal reporter normalizado que é usado para
determinação do CT nos ensaios de Real Time. Ele deve ser
ajustado acima do Baseline, mas deve ser suficientemente
baixo para se encontrar dentro da região de crescimento
exponencial de uma curva de amplificação. O número do ciclo
no qual o sinal fluorescente associado a um acúmulo de
amplicon cruza o threshold é referido como CT.
1
Também referido como TaqMan® Assays-By-Design® para Produtos de Expressão Gênica.
2
Também referido como TaqMan® Assays-By-Design® para Ensaios de SNP.
3
Também referido como TaqMan® Assays-on-DemandTM para Produtos de Expressão Gênica.
4
Também referido como TaqMan® Assays-By-DesignTM para Produtos de Genotipagem SNP.

4. Quantificação Relativa da Expressão Gênica Exige Quantificação de Dois Genes

Diferentes (Alvo e Controle Endógeno)

Para obter uma quantificação relativa do mRNA alvo com precisão, recomenda-se que também
seja avaliado o nível de expressão de um controle endógeno. Ao usar um controle endógeno
como uma referência ativa, você pode normalizar a quantificação dos alvos quanto às
diferenças na quantidade do ácido nucléico total adicionada inicialmente em cada reação. Por

17
exemplo, se você determinar que o calibrador apresenta uma quantidade duas vezes maior de
controle endógeno do que uma amostra em teste, você esperaria que a amostra do calibrador
apresentasse inicialmente duas vezes mais cDNA do que a amostra em teste. Portanto, você
teria que normalizar o alvo da amostra em teste em duas vezes, para quantificar precisamente
as diferenças no nível de expressão do alvo entre o calibrador e as amostras em teste. Alguns
fatores que podem causar diferenças na quantidade de amostra de RNA total:
 Quantificação imprecisa do RNA após a extração
 Integridade do RNA
 Pipetagem imprecisa

5. Fatores que Afetam a Precisão dos Resultados da PCR em Tempo Real

Uma variedade de fatores deve ser considerada na configuração da PCR em tempo real.
Durante a configuração inicial é importante incluir réplicas idênticas para cada amostra. O uso
destas réplicas pode ajudar na identificação de problemas de precisão. Após realizar uma PCR
em tempo real, você pode aferir a precisão dos resultados. Se as as réplicas idênticas das
amostras apresentarem um desvio padrão de CT >0,3 e/ou uma curva padrão apresentar um
coeficiente de correlação (valor R2) <0,99, a precisão dos dados é questionável. Alguns
experimentos somente podem tolerar apenas pequena variação entre as réplicas idênticas, por
exemplo, se você estiver procurando por pequenas variações na expressão de um alvo. É
importante considerar que devido à distribuição estatística, sempre há um alto nível de variação
de CT quando as quantidades do alvo se aproximam de uma única cópia (valores de CT de 34 –
40). Portanto, amostras que produzem valores de C T nesta faixa inevitavelmente originarão uma
menor precisão e, conseqüentemente, menor capacidade em detectar pequenas alterações.

Algumas práticas, descritas a seguir, ajudarão a atingir resultados mais precisos da PCR em
tempo real .

a. Usar RNA de alta qualidade

Amostras de RNA de baixa qualidade não originam bons resultados da PCR em tempo real.
Uma preparação de RNA de baixa qualidade pode ser caracterizada por um ou mais dos
seguintes fatores:

Tabela 1: Efeitos de uma amostra de RNA de baixa qualidade nos resultados da PCR
Características de uma
amostra de RNA de baixa Impacto potencial nos resultados da PCR
qualidade
Proteínas co-extraídas incluindo Inibição da PCR devido à presença de proteínas
RNases e/ou à degradação do template de RNA devido à
presença de RNases
Substâncias residuais do Inibição da PCR
processo de extração dos ácidos
nucléicos (ex. Fenol)

18
Template de RNA degradado Perda da detecção de transcritos raros
DNA genômico co-extraído Pode servir como um template de PCR e pode
confundir os resultados de detecção do RNA

19
b. Massa da amostras que produzem resultados dentro da faixa dinâmica do ensaio
Consultar “Determinação das quantidades de RNA a serem usadas em um estudo de
quantificação relativa".

c. Usar o mesmo pool de padrões e/ou calibrador durante todo o estudo

Para cada estudo, recomenda-se a preparação de grandes pools de cDNAs para a curva
padrão e para o calibrador e, em seguida, aliquotar estes cDNAs em tubos para serem
utilizados uma única vez. A preparação e utilização do mesmo pool de cDNAs para a curva
padrão e para o calibrador até a conclusão do estudo pode fornecer resultados da PCR em
tempo real mais consistentes.

d. Usar reagentes que contenham corante de referência interna ROXTM

O software da Applied Biosystems normaliza os sinais do corante reporter para o corante de
referência passiva ROXTM. Esta normalização pode compensar as pequenas variações do sinal,
o que resulta em uma melhor precisão. Todos os reagentes de PCR em tempo real da Applied
Biosystems contêm corante ROXTM.

e. Usar master-mix de PCR e mix de reagentes de PCR

O uso de master-mix de PCR e de mix de reagentes da PCR ajudará a reduzir a potencial
variabilidade introduzida a partir da pipetagem de vários reagentes durante a montagem da
reação.
(i) Master-mix da PCR em tempo real: Os Master-mix de PCR em tempo real da
Applied Biosystems contêm todos os componentes da reação, exceto primers, sonda e
template de ácido nucléico. O uso destes mix reduz bastante as chances de erros de
pipetagem durante a montagem da reação.
(ii) Mix de reagentes da PCR: Misturar todos os componentes de uma reação em um
mix de reagentes (reagentes da PCR, primers, sondas, água e outros) e em seguida
colocar nos poços da placa da reação. Para um exemplo de uma mix de reagentes de
PCR em tempo real, consultar o tutorial Reconstituting and Diluting Primers and
TaqMan® Probes (Reconstittuição e Diluição de Primer e Sondas TaqMan®), páginas 3
e 4.

f. Realizar pipetagem precisa da amostra e do reagente

A pipetagem precisa com pipetas calibradas regularmente é crucial para obter dados exatos e
precisos. A pipetagem de pequenos volume (ou seja, <5μL) pode contribuir com a imprecisão e,
a pipetagem de volumes menores que este não é recomendada, a menos que as pipetas
apresentem a capacidade de pipetar pequenos volumes e sejam regularmente calibradas.
Também se recomenda que as placas seladas sejam realizado um rápido spin, através de uma
centrifugação com baixa velocidade, antes de colocar a reação no equipamento. A tabela a
seguir lista algumas das conseqüências de uma pipetagem imprecisa.

20
Tabela 2: Conseqüências de uma pipetagem imprecisa
Problema de pipetagem Conseqüência
Amostra: Pipetagem incorreta das Altos desvios-padrões de CT
réplicas idênticas
Padrões: Pipetagem incorreta dos Altos desvios-padrões de CT (réplicas
padrões idênticas), valor R2 <0,99
Padrões: Constante excesso de Valor R2 potencialmente bom ≥0,99,
pipetagem do solvente na diluição seriada entretanto, o slope da curva padrão será
(ex. 100 μL ao invés de 90 μL) impreciso; indicará menor eficiência da
PCR
Padrões: Constante déficit de pipetagem Valor R2 potencialmente bom ≥0,99;
do solvente na diluição seriada (ex. 80 µL entretanto, o slope da curva padrão será
ao invés de 90 µL) impreciso; indicará maior eficiência da
PCR
Padrões: Constante excesso de Valor R2 potencialmente bom ≥0,99;
pipetagem da amostra padrão na diluição embora declínio da curva padrão será
seriada (ex. 12 µL ao invés de 10 µL) impreciso; observada maior eficiência da
PCR do ensaio
Padrões: Constante déficit de pipetagem valor R2 potencialmente bom ≥0,99,
da amostra padrão na diluição seriada (ex. entretando, o slope da curva padrão será
8 μL ao invés de 10 µL) impreciso; indicará menor eficiência da
PCR

g. Homogeinizar completamente os reagentes da PCR

Se os vários componentes de uma reação de PCR em tempo real não forem completamente
homogeneizados, a reação pode apresentar um efeito na precisão. É importante descongelar e
homgeneizar completamente todos os reagentes durante a montagem da reação.

h. Usar de ensaios com alta eficiência da PCR

A eficiência da PCR pode ser usada para determinar o desempenho de um ensaio de PCR em
tempo real. Eficiências deficientes da PCR podem resultar em quantificação deficiente. Para as
informações sobre o cálculo da eficiência da PCR, consultar a seção intitulada “O que é
Eficiência de Amplificação da PCR?”
Os TaqMan® Gene Expression Assays da Applied Biosystems apresentam eficiências de
amplificação de 100%.
Altas eficiências de amplificação da PCR (próximo de 100%) podem ser atingidas seguindo
algumas orientações:
 Utilizar TaqMan® Gene Expression Assays da Applied Biosystems ou o desenho
automatizado de primers e sonda, utilizando o Software Primer Express®.
 Utilizar o Universal PCR Master Mix TaqMan® da Applied Biosystems ou SYBR®
Green I PCR Master Mix (fornece concentração padronizada dos componentes
da reação, simplificando sua montagem).

21
  Utilizar parâmetros de ciclagem universais da PCR (permite que vários ensaios
sejam executados na mesma placa).
 Utilizar concentrações padrões de primers e sonda: 900nM de primer forward,
900 nM de primer reverse e 250 nM de sonda, quando usar cDNA ou DNA como
substrato. Recomenda-se um estudo de otimização do primer ao usar reagentes
do SYBR® Green I, devido à natureza não específica da detecção do SYBR ®
Green I.

i. Ajustar o baseline e o threshold apropriados

Para obter valores precisos de CT , é crucial ajustar os baseline e threshold apropriados. Alguns
software dos sistemas de PCR em tempo real da Applied Biosystems podem realizar cálculos
automáticos de CT e baseline. Se o seu software não realizar cálculos automáticos de C T e
baseline ou se você escolheu não usar esta configuração, você precisa ajustar os thresholds e
o Baseline manualmente. Para orientações sobre os ajustes manuais do Baseline e do
threshold, consultar o Manual do Usuário.

6. O que é Eficiência de Amplificação da PCR?

Observação: A estimativa precisa da eficiência da PCR depende de uma série de fatores tais
como os reagentes, montagem do experimento, qualidade da amostra e análise.
A eficiência de amplificação da PCR é a taxa na qual um amplicon de PCR é gerado,
geralmente expressa como porcentagem. Se um amplicon de PCR dobrar em quantidade
durante a fase geomética da amplificação da PCR, então a PCR apresentou 100% de
eficiência.
O slope de uma curva padrão é comumente usado para estimar a eficiência de amplificação de
uma reação de PCR em tempo real. Uma curva padrão de PCR em tempo real é graficamente
representada como um gráfico de regressão linear semi-log do valor CT em comparação ao log
do quantidade inicial do ácido nucléico. Um slope da curva padrão de –3,32 indica uma reação
de PCR com 100% de eficiência. Os slopes mais negativos que –3,32 (p. ex. -3,9) indicam
reações com menos de 100% de eficiência. Os slopes mais positivos que –3,32 (p. ex. -2,5)
podem indicar má qualidade da amostra ou problemas de pipetagem.
Observação: Uma reação 100% eficiente produzirá um aumento de 10 vezes no amplicon da
PCR a cada 3,32 ciclos durante a fase exponencial de amplificação (log2 10 = 3,3219).

Figura 1: Curva-Padrão da PCR em Tempo Real representando 100 % de Eficiência da PCR

22
Um cálculo de estimativa de eficiência (E) de um ensaio de PCR em tempo real é:
E = (10 –1/slope –1) × 100

Alta eficiência de amplificação da PCR (próximas de 100%) pode ser rotineiramente atingidas
se você seguir as orientações acima descritas. A eficiência da PCR pode ser usada para
determinar o desempenho de um ensaio de PCR em tempo real. Baixa eficiências da PCR pode
resultar em baixa precisão da réplica da amostra (réplicas idênticas & réplicas experimentais) e,
como conseqüência, pode resultar em uma quantificação deficiente.
Para o método CT comparativo de quantificação relativa (discutida adiante neste tutorial) ser
validado, a eficiência da amplificação do alvo e a eficiência da amplificação da referência ativa
(controle endógeno) devem ser aproximadamente iguais.

23
Seção II

Preparação do RNA e Transcrição Reversa

1. Introdução
A quantificação bem-sucedida da expressão gênica exige que o RNA utilizado seja de alta
qualidade. O isolamento de RNA de alta qualidade depende da seleção de um sistema/método
de extração e purificação que forneça o produto de mais alta qualidade.
RNA é uma molécula muito instável. É susceptível à degradação por RNases, que são
proteínas altamente estáveis e persistentes. Alguns métodos de purificação de RNA podem co-
extrair altos níveis de proteínas – incluindo RNases. Proteínas co-extraídas e/ou RNA
degradados podem resultar em resultados ruins de PCR em tempo real. O RNA extraído que
apresenta valor de A260/280 ≥ 2,0 é considerado relativamente livre de proteínas.
O manuseio, processamento e armazenamento do RNA estão além do escopo deste
documento. Para informações, consultar um guia padrão de laboratório de biologia molecular
que discuta o manuseio adequado do RNA.
Após o RNA de alta qualidade ser preparado, o procedimento de transcrição reversa (RT) gera
o cDNA que será utilizado na PCR em tempo real. Se você suspeitar que o RNA contém
proteínas extraídas (ou seja, o valor A260/280 < 2,0), recomenda-se que Inibidor de RNase seja
adicionado à reação de RT na concentração final de 1,0 U/μL. Se você estiver usando o ABI
PRISM™ 6100 Nucleic Acid PrepStation e reagentes associados de purificação de ácido
nucléico, você não precisa adicionar Inibidor de RNase às reações de transcrição reversa.
A Applied Biosystems desenvolveu um sistema para a extração e purificação de RNA/DNA
(também isolar DNA) que produz RNA (ou DNA) de extrema alta qualidade e tem com
quantidades mínimas de proteínas contaminantes. Este sistema, o ABI PRISM™ 6100 Nucleic
Acid PrepStation, e as quimicas associadas, fornecem ao pesquisador o RNA da mais alta
qualidade para análise de expressão gênica (com valores A260/280 ≥ 2,0). O sistema também
co-purifica menos de 0,5% do DNA genômico ao usar as químicas PrepStation de RNA e menos
de 0,002% do DNA genômico se for realizado o tratamento adicional com DNase em coluna
com o Absolute RNA Wash Solution (Solução de Lavagem de RNA Absoluta).
Para informações sobre a seleção da química mais apropriada para seu tipo de amostra,
consultar o guia “ABI PRISMTM 6100 Nucleic Acid PrepStation: Selecting Appropriate Protocols,
Reagents and Consumables”.
Importante: As químicas e os consumíveis do ABI PRISMTM 6100 Nucleic Acid PrepStation não
podem ser usados independentemente do instrumento.

2. Quantificação do RNA
O RNA purificado em solução pode ser quantificado usando sua absorbância em 260nm (A 260).
Geralmente, uma pequena quantidade de RNA é diluída para a leitura em um
espectrofotômetro. Consultar o manual do usuário do espectrofotômetro para orientações sobre
o uso apropriado do instrumento. e produtos de consumo associados.
Observação: Se usar o ABI PRISMTM 6100 Nucleic Acid PrepStation, a solução de eluição deve
ser usada para a diluição do RNA e para calibração do branco do espectrofotômetro.

24
IMPORTAMTE! A absorção de 1 O.D. é aproximadamente equivalente a 40 μg/mL de RNA. Se
o valor de A260 não estiver dentro da faixa linear do espectrofotômetro, a quantificação pode não
ser precisa. Consultar o manual do usuário do espectrofotômetro para orientações sobre a faixa
linear de quantificação.

A concentração de RNA é calculada usando a equação:

Concentração de RNA (μg/mL) = A260 × 40 μg/mL × fator de diluição

Os valores de A260/280 podem ser usados para caracterizar a presença de proteínas em uma
preparação de RNA. O valor de A260/280 é calculado simplesmente pela divisão do valor de A 260
por A280. Se o valor de A260/280 ≥ 2,0; a amostra de RNA é considerada como relativamente livre
de proteína. A concentração de RNA é, então, usada para calcular o volume de RNA a ser
adicionado a uma reação de transcrição reversa.

Exemplo:
10 μL da amostra A de RNA foi diluída em 90 μL de solvente. O volume total desta diluição foi
pipetado em uma cubeta de 100 μL e o espectrofotômetro foi programado para ler a amostra
diluída em A260 e A280.

Tabela 1: Quantificação de RNA pela absorbância de UV

Volume da
solução
Amostra Diluição A260 A280 A260/280 Concentração Quantidade
estoque
de RNA
Amostra A 150 μL 1:10 0,58 0,29 2,0 232 μg/mL 34,8 μg
de RNA

A concentração de RNA da amostra A de RNA:

= 0,58 (OD260) × 40 μg/mL × 10 (fator de diluição) = 232 μg/mL

A Quantidade da amostra A de RNA:

= 232 μg/mL × 1 mL/1000 μL × 150 μL (volume do estoque) = 34,8 μg

O valor de A260/280 da amostra A de RNA:

,58
A260/280 =  2,0
,29

25
3. Transcrição Reversa para Quantificação Relativa da Expressão Gênica
Transcrição reversa é o processo pelo qual o RNA é usado como um molde para sintetizar
cDNA. Entre as primeiras opções a considerar na seleção de um método para realizar a
transcrição reversa está a opção de usar um método de RT de uma etapa (one-step) ou RT de
duas etapas (two-step). Também deve ser selecionado o tipo de primer para a transcrição
reversa.
Observação: Os kits de reagentes de transcrição reversa da Applied Biosystems recomendam
uma faixa e/ou uma quantidade máxima de RNA para a reação. Consultar o protocolo
apropriado para recomendações sobre a massa de RNA que deve ser utilizada.

As tabelas 2 e 3 descrevem características e benefícios dos métodos de one-step e two-step

etapas, assim como uma comparação dos diferentes primers que podem ser utilizados:

Tabela 2: Comparação entre RT-PCR one-step e two-step

Método Características e Benefícios
 Exige um único mix de reação, pois a RT e a PCR ocorrem no
mesmo tubo
 AmpErase® UNG pode ser usada (o kit TaqMan® EZ RT-PCR
RT-PCR one-step é exceção)
 Pode obter um melhor limite de detecção com raros transcritos
 Requer primer de seqüência específica para síntese de cDNA.
 Exige dois mix de reação (RT e PCR)
 O cDNA pode ser armazenado para uso posterior
 AmpErase® UNG pode ser usada se dUTP não for usado na
etapa RT
RT-PCR two-step  Quando utiliza random primers (primers randômicos), todos os
mRNAs, assim como a subunidade 18S do rRNA (ou seja,
alvos + controles endógenos) podem ser transcritos
reversamente simultaneamente
 Pode usar primer de seqüência específica, random primers ou
oligo d(T)16 para síntese de cDNA.

26
Tabela 3: Comparação dos primers para síntese de cDNA.
Primers para síntese de Considerações
cDNA
 Usado para realizar transcrição reversa somente da
de seqüências de RNA complementar
Primer de seqüência
específica
 Único tipo de primer recomendado para RT-PCR
one-step
 Pode ser usado em RT-PCR two-step
 Usado para realizar a transcrição reversa somente
de mRNAs eucarióticos e retroviros com cauda de
poli-A
 Não pode realizar transcrição reversa da
subunidade 18S do rRNA
Oligo d(T)16
 Pode apresentar problemas na transcrição de
longos transcritos de mRNA ou transcritos contendo
hairpin loops.
 Prejudica a transcrição em direção à extremidade 3’
do transcrito
 Pode realizar transcrição reversa de todos os
mRNAs simultaneamente, assim como da
subunidade 18S do rRNA (ou seja, alvos + controles
endógenos)
Random Primers (p.ex.,
hexâmeros)  Tentar primeiro quando trabalhar com longos
transcritos ou transcritos contendo hairpin loops.
 Não prejudica a transcriçào em direção à
extremidade 3’ do transcrito

4. Seleção de Reagentes para Transcrição Reversa e PCR em Tempo Real

5. Determinação da Quantidade de RNA um Estudo de Quantificação Relativa

O volume de amostra que é necessário na(s) reação(ões) de transcrição reversa (RT) pode ser
determinado, em primeiro lugar, pelo cálculo da concentração de RNA. Os kits de reagentes de
transcrição reversa da Applied Biosystems recomendam uma faixa e/ou uma massa máxima de
RNA por reação. Consultar o protocolo adequado pra recomendações da quantidade de RNA.
Embora a transcrição reversa não ocorra necessariamente com 100% de eficiência, se as
reações de transcrição reversa forem realizadas sob as mesmas condições, as eficiências de
RT de cada alvo são comparáveis entre as reações.
Após a RT, é comum não quantificar o cDNA resultante por absorbância de UV. Ao invés disso,
o cDNA é recebe uma unidade de concentração relativa à concentração original do RNA na
reação de RT. Por exemplo, se utilizar 10 μg de RNA em uma reação de RT de 100 μL, a

27
concentração de cDNA resultante seria de 100 ng/ μL; que significa 1 μL de amostra que
contém cDNA gerado a partir de 100 ng de RNA.
Cada vez que você usar uma nova fonte de RNA, especialmente ao iniciar um novo ensaio, é
importante verificar se a quantidade de cDNA testada produz resultados de PCR em tempo real
dentro da faixa linear dinâmica do ensaio de PCR em tempo real.
Para verificar se a quantidade de template produz resultados dentro da faixa linear dinâmica de
um ensaio, a Applied Biosystems recomenda a realização de uma curva padrão relativa. Usar o
conjunto de primer/sonda apropriado, com uma faixa de RNA (cDNA) de 100 ng a 10 pg (por
exemplo, 100 ng seriam 1/10 de 1 μg de uma reação de RT) em uma série de diluições de 10
vezes (em triplicatas) para cada diluição. Os resultados de PCR em tempo real (C Ts) de uma
curva padrão podem ajudar a determinar:

1. Faixa Dinâmica - A faixa de RNA (cDNA) que o ensaio pode detectar. Por exemplo,
em um ensaio com alv altamente expresso, supõe-se quantidade inicial de 100 ng
produza baixos valores de CTs (ou seja, CT de 3 a 10). Isto indicaria que a
quantidade de template inicial é muito alta e que 10 ou 1 ng de amostra pode
representar a faixa melhor para uso. Ao contrário, um alvo com baixos níveis de
expressão (ou seja, 100 pg ou 10 pg) pode produzir altos valores de C T (ou seja, 35
– 40). Se este for o caso, você deveria correr ensaios com uma quantidade de inicial
mais alta, por exemplo 1 ng. Devido à distribuição estatística, um alto nível de
variação CT sempre ocorre quando as quantidades de alvo se aproximam de uma
única cópia (valores de CT 35 a 40). As quantidades de amostra que produzem
valores de CT nesta faixa apresentam baixa precisão, conseqüentemente, pequenas
alterações são mais difíceis de serem quantificadas com precisão.
2. Precisão do Ensaio - As réplicas das amostras réplica em cada quantidade ajudarão
na identificação de problemas de precisão. As réplicas das amostras que
apresentam um desvio padrão de CT > 0,3 podem indicar problemas referentes à
pipetagem, homogeinização ou montagem da placa. Alguns experimentos podem
tolerar somente uma pequena variação das réplicas idênticas, se pesquisador estiver
procurando por pequenas alterações na expressão do alvo. Quando você avaliar a
curva padrão, um valor R2 <0,99 pode indicar problemas de precisão.
3. Eficiência do Ensaio – A curva padrão relativa pode ajudar na determinação da
eficiência do ensaio. Reveja a seção “O que é Eficiência de Amplificação da PCR”
para mais informações.

6. Identificação de Inibição da PCR

Observação: Resultados precisos da PCR em tempo real dependem de uma série de fatores
tais como reagentes, montagem do experimento, qualidade da amostra e análise. Para uma
lista de fatores que afetam a qualidade dos resultados da PCR em tempo real, consultar
“Fatores que Afetam a Precisão dos Resultados da PCR em Tempo Real”

7. Fatores que Afetam a Precisão dos Resultados da PCR em Tempo Real

Altos níveis de proteínas, assim como outros reagentes contaminantes nas preparações de
RNA, podem provocar inibição da PCR. Como discutido na seção anterior, os valores de A 260/280
< 2,0 podem indicar altos níveis de proteínas em uma amostra de RNA. Um valor de A 260/280 <
2,0 não prediz que os níveis de proteínas estão altos o suficiente para causar inibição da PCR,

28
porém, quanto mais o valor de A260/280 se desviar de 2,0; maior a chance de se obter resultados
imprecisos.
Você pode usar os dados da PCR em tempo real a partir de gráficos da Curva Padrão para
identificar se a inibição está ocorrendo em um nível que cause resultados impresisos. Quando
usadas para caracterizar a inibição, estas curvas de padrão semi-log (páginas 21 e 22) são
referidas como gráficos de inibição.

Exemplo: Gráfico de Inibição

Nas duas amostras dos experimentos que se seguem, o RNA foi purificado usando dois
métodos diferentes de extração. Os RNAs foram quantificados pela absorbância de UV. O RNA
foi coletado a partir de cada preparação e transcrito reversamente, em seguida uma série de
diluições foi preparada a partir de cada estoque de cDNA (Tabela 4).

Tabela 4: Diluições de cDNAs usadas nos Gráficos de Inibição

Diluições Amostra 1 (μg) Amostra 2 (µg)
nº. 1 1,0 1,0
nº. 2 0,25 0,25
nº. 3 0,063 0,063
nº. 4 0,016 0,016
nº. 5 0,0039 0,0039
nº. 6 0,00098 0,00098
nº. 7 0,00024 0,00024
Os cDNAs foram usados para PCR em tempo real.

Resultados
Os dados da PCR em tempo real gerados a partir das amostras 1 e 2 são apresentados na
tabela 5 e nas Figuras 2 e 3 nas páginas 21 e 22.

29
Tabela 5: Dados da PCR em tempo real (CT) a partir do experimento do gráfico de inibição
Massa das Log de CT médio, Diferenças CT média, Diferenças
Amostras Entrada amostra 1 entre os amostra 2 entre os
(μg) valores de valores de
CT, amostra CT, amostra
nº. 1 (ex. 22 nº. 2 (ex. 27
menos 20) menos 28)
1,0 0,0 20 N/A 28 N/A
0,25 -0,6 22 2,0 27 -1,0
0,063 -1,2 24 2,0 26 -1,0
0,016 -1,8 26 2,0 26 0,0
0,0039 -2,4 28 2,0 28 2,0
0,00098 -3,0 30 2,0 30 2,0
0,00024 -3,6 32 2,0 32 2,0

Figura 2: Amostra nº. 1 do Gráfico de Inibição não demostrando inibição

Figura 3: Amostra nº. 2 do Gráfico de Inibição demostrando presença de inibidor

Os dados no Gráfico de Inibição nº. 1 mostram um ensaio de PCR em tempo real com
amplificação de 100% de eficiência (slope = -3,3), sem inibição. O gráfico de Inibição nº. 2
apresenta um slope que é muito menor e a eficiência da PCR é calculada como sendo maior
que 100% (592%). Um slope que sugira uma eficiência de PCR maior que 100% pode ser um
indicador de inibição da PCR. O declínio na Figura 3 é causado por inibidores que estão
30
altamente concentrados nas amostras de cDNA menos diluídas. Conforme o cDNA é titulado, os
inibidores são diluídos da mesma forma. Como resultado, as amostras menos diluídas podem
apresentar valores de CT mais altos do que na diluição seguinte e/ou a diferença predita de C T
não é atingida (ou seja, neste exemplo uma alteração de 4 vezes deve produzir uma diferença
de CT +2). Este padrão de inibição pode ser menos dramático quando a eficiência calculada for
próxima, mas ainda acima, de 100% de eficiência. Examine as diferenças de C T entre cada
resultado para observar a inibição. Como os inibidores estão mais concentrados nas amostras
menos diluídas, a inibição mais dramática deve ser observada nas amostras que representem
os pontos da curva padrão com a mais alta concentração do template.
Se a eficiência da reação de PCR em tempo real for calculada para acima de 100%, mas ainda
houver uma diferença consistente de CT entre cada ponto padrão, então um erro constante de
pipetagem (amostra padrão ou solvente) pode ser o problema, ao invés de efeitos inibidores.
Consultar a seção “Realizar pipetagem precisa da amostra e dos reagentes” para informações
adicioniais.
Se você determinar que os inibidores da PCR estão na(s) sua(s) amostra(s) de RNA, realizar
um dos seguintes procedimentos.
1. Purificar novamente o RNA.
2. Realizar a purificação do RNA de uma amostra usando um novo método de purificação.
3. Testar sua amostra em uma concentração de template mais baixa onde se sabe que a
inibição de PCR não afeta os resultados da PCR em tempo real.

8. Quanto de DNA Genômico Contaminante Pode ser Tolerado em um Ensaio de

Expressão Gênica de Quantificação Relativa?
O DNA genômico é geralmente co-extraído com RNA e pode servir como template em
processos posteriores, assim como a PCR. No entanto, se sua sonda MGB TaqMan ® se
estender sobre uma junção éxon-éxon, o DNA genômico pode ser excluído como um template
em uma reação de PCR em tempo real.
Em contraste, se ambos os primers forem desenhados dentro de um éxon, então o DNA
genômico pode servir como um template para a amplificação da PCR. Nestes casos, deve-se
decidir se o DNA genômico é suficientemente desprezível.
As reações de RT sem transcrição reversa (controles negativos da RT) podem ser usadas para
avaliar os níveis de DNA genômico em uma preparação de RNA. Um controle negativo de RT é
uma reação que foi preparada para transcrição reversa (incluindo RNA, dNTPs, tampão e
outros), mas sem adição de transcriptase reversa. Pode-se assim, estimar a quantidade de
amplificação nas amostras que são atribuíveis aos templates de DNA genômico ao correr
controles negativos da RT. Por exemplo, se uma amostra controle negativo da RT apresentar
um valor de CT 10 ciclos a menos do que uma amostra teste de RT, então, a amostra de
controle negativo de RT iniciou com uma quantidade template aproximadamente 1000 vezes
menor (considerando 100% de eficiência, 1 CT ≈ diferença de 2 vezes na quantidade inicial do
template). Uma vez que o template alvo neste controle negativo de RT seria exclusivamente
DNA genômico, pode-se concluir que 0,1% (1:1.000) da amplificação na amostra de RT é
atribuível ao template de DNA genômico. Você deve, então, determinar se a amplificação da
PCR atribuível ao DNA genômico é desprezível comparada à amplificação da seqüência do
cDNA.

31
Se você determinar que a quantidade de DNA genômico nas amostras de RNA for
inaceitavelmente alta, realize um dos seguintes procedimentos:
1. Purificar o RNA usando um novo método de purificação.
2. Realizar um tratamento com DNAse ou repetir o tratamento com DNAse caso esse já
tenha sido realizado.
Observação: O ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation co-purifica menos de 0,5% do DNA
genômico aos usar as químicas de PrepStation RNA e menos de 0,002% de DNA genômico ao
usar o tratamento adicional com DNAse em coluna com Solução de Lavagem de RNA Absoluta.

32
Seção III

Seleção e Desenho do Ensaio para Quantificação Relativa

Entre os fatores a considerar no desenho de um estudo de quantificação relativa estão:

 Seleção ou desenho de primers e sondas para o(s) gene(s) alvo.

 Identificação e seleção ou desenho de primers e sondas para gene(s) controle
endógeno (controle interno).

Seleção ou Desenho de Primes e Sondas TaqMan® para Quantificação Relativa da

Expressão Gênica
Os estudos de quantificação relativa exigem conjuntos muito bem desenhados de primers e
sondas. Quando são desenhados, seguindo as mesmas orientações, todos os ensaios podem
correr ao mesmo tempo. Esta universalidade do desenho dos primers, que é central para todos
os ensaios oferecidos pela Applied Biosystems, assim como para o Software Primer Express®,
exige pouco, ou nenhuma otimização, quando se utiliza o TaqMan® Universal Master Mix em um
Sistema de PCR em Tempo Real da Applied Biosystems. A Applied Biosystems apresenta um
grande número de produtos disponíveis, assim como um várias de orientações para a seleção
ou desenho de um ensaio.
Observação: O uso de primers que foram usados em ensaios de PCR tradicional não é
recomendado. Os critérios para o desenho de primers para PCR em tempo real podem não ter
sido utilizados no desenho de primers de outras aplicações.

1. Ensaios de Expressão Gênica TaqMan® (TaqMan® Assays-on-Demand™ Gene

Expression Products)
Os ensaios de Expressão Gênica TaqMan® são ensaios de expressão gênica pré-formulados e
biologicamente informativos, utilizados para rápida detecção e quantificação de transcritos de
mRNA de ratos, camundongos e seres humanos. Estes ensaios foram desenhados a partir de
seqüências dos bancos de dados públicos e da Celera Genomics. Cada ensaio contém primers
pré-formulados e sondas TaqMan® em uma concentração de 20X. Cada tupo contém 250
reações com um volume de reação de 20 μL ou 100 reações com um volume de reação de 50
μL. Os Ensaios de Expressão Gênica TaqMan ® são desenhados para serem usados em RT-
PCR two-step.
Observação: Os Ensaios de Expressão Gênica TaqMan ® contêm sondas marcadas com FAM
TM
e são otimizadas para reações simplex.

33
Nomenclatura dos Ensaios de Expressão Gênica TaqMan®:
Cada Ensaio de Expressão Gênica TaqMan®é designado uma ID de Ensaio.
As primeiras duas posições designam a espécie para a qual o ensaio é desenhado:
Hs = Homo sapiens Mm = Mus musculus Rn = Rattus norvegicus.

A penúltima posição da identificação do Ensaio contém uma letra que indica o posicionamento
do ensaio:
Sufixo do Ensaio Posicionamento do Ensaio
_m Um ensaio cuja sonda se estende em uma junção éxon-éxon e
não detectará o DNA genômico.
_s Um ensaio cujos primers e sondas são desenhados dentro de
um único éxon, tais ensaio detectarão DNA genômico.
_g Um ensaio cuja sonda se estende em uma junção éxon-éxon,
mas o ensaio pode detectar DNA genômico caso ele esteja
presente na amostra.
_mH, _sH, ou _gH O ensaio foi desenhado para um transcrito pertencente a uma
família de genes com alta homologia de seqüência. Os ensaios
são desenhados para oferecer uma diferença entre 10 C T e 15
CT entre o gene alvo e o gene com homologia de seqüência mais
próxima. Um ensaio, portanto, detectará o transcrito alvo com
discriminação de 1.000 a 30.000 vezes (sensibilidade) maior do
que o gene homólogo mais próximo.
Observação: As amostras de RNA devem estar livres de DNA genômico ao usar um
ensaio “s” ou “g”.

2. Ensaios de Expressão Gênica Custom TaqMan® (TaqMan® Assays-by-DesignSM for

Gene Expression Service)
Os Ensaios de Expressão Gênica Custom TaqMan® são ensaios personalizados desenhados
para estudos de expressão. Os Ensaios de Genotipagem Custom TaqMan® são usados para
ensaios de SNP. Estes ensaios personalizados (Expressão Gênica e Genotipagem) fornecem
ao pesquisador a oportunidade de selecionar um local específico de seqüência ao qual a sonda
se liga e é útil para o desenho de um ensaio que não esteja atualmente disponível entre as
opções de Ensaios TaqMan®. As aplicações que envolvem detecção viral, outra espécie que
não seja humana, camundongo, rato e detecção de patógenos específicos são alguns
exemplos de aplicações que seriam beneficiadas a partir desta linha de produtos. Para ensaios
de expressão gênica em amostras humanas, de camundongo ou de rato, os Ensaios de
Expressão Gênica TaqMan® (TaqMan® Assays-on-Demand™ Gene Expression Products) estão
disponíveis. Se um gene alvo em particular não estiver atualmente disponível, você pode
realizar um ensaio personalizado.
Os Ensaios de Genotipagem e Expressão Gênica Custom TaqMan® (TaqMan® Assays-by-
DesignSM Service) exige que você verifique a integridade da seqüência que deseja submeter
usando várias ferramentas bioinformática. Após verificar a integridade da seqüência, você pode
submeter sua solicitação on-line. O processo de submissão é muito direto e exige os seguintes
passos:

34
a. Verificar a Qualidade da sua Seqüência.
Antes da submissão, é importante realizar uma “análise de bioinformática” sobre a seqüência
que você pretende submeter. Uma ferramenta que deve ser usada é o Repeat Masker,
disponível na Home Page RepeatMasker (www.repeatmasker.org/). O Repeat Masker escaneia
seqüências de DNA para repetições entremeadas (ex. seqüências ALU) e seqüências de DNA
de baixa complexidade. O resultado é uma versão modificada da sua seqüência na qual todas
as repetições e seqüências de baixa complexidade são mascaradas (substituídas por Ns). O
sofware de desenho de Ensaios Custom TaqMan® aceita seqüências com A, C, T, G ou Ns e os
primers e as sondas não são desenhados em regiões contendo Ns.
Você também deve alinhar sua seqüência utilizando o BLAST nos bancos de dados apropriados
(por exemplo, bancos de dados genômicos e de EST) para identificar regiões da seqüência que
apresentam alto grau de homologia com outras partes do genoma ou alta homologia dentro de
uma família de genes. Se você estiver trabalhando em um sistema transgênico, você deve se
certificar de que seus primers e sondas são únicos para as espécies de interesse queira
diferenciar entre as espécies. As regiões de alta identidade podem ser mascaradas
(substituídas) com Ns antes de submeter ao BLAST. O BLAST pode ser realizado na página
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

b. Submeter a seqüência.

3. Reagentes de Ensaio Pré-Desenvolvidos TaqMan® (PDARs TaqMan®)

Os Reagentes de Ensaio Pré-Desenvolvidos TaqMan® (PDARs TaqMan®) são conjuntos de
primers e sondas desenhados para amplificar um alvo específico e seqüências de controle em
amostras de cDNA usando o ensaio de determinação da nuclease 5'. Os PDARs TaqMan®
estão disponíveis para genes alvos em humanos, camundongos e ratos. Além disso, os PDARs
TaqMan® são otimizados para uso com o TaqMan® Universal PCR Master Mix com (P/N
4304437) ou sem AmpErase® UNG (P/N 4324018) e utilizam condições de ciclagem universais
idênticas à dos outros ensaios da Applied Biosystems. Como resultado, múltiplos alvos PDAR
TaqMan® podem ser testados em uma única placa de reação. Alguns controles endógenos
PDAR TaqMan® estão disponíveis como “primer limitado” e contêm sondas marcadas com o
corante reporter VIC®. Isto permite a realização de ensaios multiplex de controles endógenos e
alvos, considerando que o gene controle é mais abundantemente expresso do que o gene alvo.

4. Desenho de Ensaios para Aplicações com Reagentes SYBR® Green

O SYBR® Green I é um corante fluorescente que se liga ao sulco menor do DNA dupla-fita (ou
seja, amplicons) e que fluoresce quando ligado ao DNA e excitado por uma fonte de luz. Como
nenhuma sonda está envolvida nestas reações, há algumas desvantagens para o seu uso;
especificamente:
 O corante SYBR® Green I também se liga e apresenta fluorescência na ligação
com dímeros de primers e produtos não específicos de amplificação. Como
resultado, etapas adicionais de otimização são necessárias para garantir uma
amplificação robusta e uma quantificação precisa.

35
  Os reagentes SYBR® Green não podem ser usados em multiplex. Em ensaios de
expressão gênica, o controle endógeno deve ser corrido em um poço separado.
No entanto, o reagente SYBR® Green é útil como uma ferramenta de seleção se você quiser
avaliar rapidamente os níveis de expressão relativa de uma série de genes em uma variedade
de tipos de amostra. Após você obter os dados preliminares, recomenda-se que realize um
ensaio baseado na sonda TaqMan® para alcançar resultados quantitativos com maior precisão.
Para o desenvolvimento do ensaio utilizando o SYBR® Green, recomenda-se o desenho do
ensaio com o software Primer Express®. Submeter somente os primers para síntese; no
entanto, se o ensaio com sonda TaqMan® for corrido futuramente, a seqüência da sonda
compatível com o conjunto de primers já terá sido desenhada.

36
Seção IV

Identificação e Seleção de Controles Endógenos para Quantificação

Relativa

Uma das estapas mais importantes para um estudo com Quantificação Relativa é a seleção de
um controle endógeno adequado. A normalização para um controle endógeno (geralmente
referido como controle interno) permite que você corrija resultados que possam estar distorcidos
pelas diferentes quantidades iniciais de template de ácido nucléico. Qualquer gene que não
altere seu nível de expressão em todas as amostras do estudo pode ser potencialmente
utilizado como controle endógeno.

A seleção de um controle endógeno exige três critérios:

1. Uniformidade dos Níveis de Expressão do Controle Endógeno

Como o controle endógeno é utilizado para normalizar diferenças na quantidade de cDNA
que é colocado nos poços de reação da PCR, os níveis de expressão de controle endógeno
devem ser semelhantes em todas as amostras no estudo. Assim, é crucial determinar se o
tratamento de estudo ou intervenção está afetando o nível de expressão do gene(s) controle
endógeno candidato(s). Usando a PCR em tempo real, você pode testar a uniformidade da
expressão dos controles endógenos comparando os níveis de C T do controle endógeno em
várias ou em todas as amostras de estudo. No teste, você deve colocar quantidades
idênticas de cDNA para cada amostra em teste. É importante normalizar a quantidade de
RNA por alguma medida externa, tal como absorbância através de UV. Desta forma,
coloque quantidades equivalentes de RNA nas reações de RT e pegue volumes
equivalentes de cDNA para as reações de PCR em tempo real. Os níveis de expressão
gênica do controle endógeno não devem variar.
Observação: A pureza e integridade do RNA também são cruciais para esta análise. Altos
níveis de proteínas co-extraídas podem resultar em resultados duvidosos devido à inibição
da PCR. RNA altamente degradado também pode resultar em resultados duvidosos.
Consultar “Preparação do RNA e Transcrição Reversa”.
A quantidade de amostra deve se estender na faixa esperada da expressão do gene alvo no
estudo. É importante demostrar que enquanto os níveis de expressão do alvo podem variar
amplamente, a expressão do controle endógeno permanece constante.
Em resumo, para verificar a uniformidade daexpressão do controles endógenos:
a. Selecionar controles endógenos candidatos e obtenha ensaios (conjuntos de primers
e sondas).
b. Purificar o RNA a partir das amostras no estudo.
c. Usar um método externo (como absorbância de UV) para quantificar os níveis de
RNA.
d. Verificar a integridade do RNA (gel de eletroforese) e qualidade (A260/280).

37
 e. Colocar quantidades equivalentes de RNA nas reações de RT.
f. Colocar volumes equivalentes de cDNA de reações de RT em reações de PCR em
tempo real para todos os controles endógenos candidatos.
g. Analisar e interpretetar os resultados*.
h. Selecionar controle(s) endógeno(s) para usar no estudo.

2. Validação da Eficiência de Amplificação dos Genes Alvo e Controle para o Método

CT Comparativo
Na realização do método CT comparativo (também conhecido como método ΔΔC T),
certifique-se de que o(s) alvo(s) e o controle endógeno apresentam eficiências de PCR
semelhantes ou relativamene equivalentes.

3. Multiplex de Genes Alvos e Controles Endógenos

Quando você realizar um ensaio múltiplex, certifique-se de que:
 O nível de expressão do gene controle endógeno é maior do que o do gene alvo.
 O gene que está mais altamente expresso (ou seja, controle endógeno) está
configurado com seus primers em um nível limitante. Isto garante que a
amplificação do alvo menos expresso não seja comprometida pela amplificação
do alvo mais expresso. A exclusão desta competição entre alvos é necessária
para a quantificação precisa de ambos os genes.
 Alguns Controle Endógeno TaqMan® estão disponíveis como ensaios com
primers limitados, que contêm sondas marcadas com o reporter VIC®. Isto
permite o multiplex dos genes alvo e controle endógenos, considerando que o
gene controle é mais expresso do que o gene alvo.
Observação: Os Ensaios de Expressão Gênica TaqMan® são otimizados
somente para reações simplex.

Para testar se o controle endógeno é mais expresso do que o gene alvo, usar as amostras
em teste que se estendem na faixa esperada da expressão gênica do alvo. Corra as
reações do controle endógeno e de alvo separadamente para cada amostra e certifique-se
de que todos os CTs do controle endógeno são menores do que os CTs do alvo. Se não for
este o caso, você pode realizar um dos itens a seguir:
 Repetir usando outro controle endógeno que seja consistentemente expresso no
conjunto de amostra a ser testado.
 Conduzir o estudo correndo o controle e o alvo em poços separados (simplex).

38
Seção V

Análise e Desenho Experimental da Quantificação Relativa da

Expressão Gênica:

Método da Curva Padrão Relativa e Método CT Comparativo (ΔΔCT)

1. Introdução
A Applied Biosystems utiliza duas metodologias para a Quantificação Relativa da Expressão
Gênica.
 Método da Curva Padrão Relativa
 Método CT Comparativo (ΔΔCT)
Antes de começar o experimento, considere qual método atende suas necessidades.
Dependendo de uma série de fatores, um método pode ser mais apropriado que outro. As
vantagens de cada método e fatores a considerar estão descritos abaixo.

Método da Curva Padrão Relativa

Vantagem: Este método exige a menor quantidade de validação devido ao fato de que as
eficiências da PCR do alvo e o controle endógeno não precisam ser equivalente.
Considerações (e Aplicações): Este método exige que cada placa de reação contenha
curvas padrões e exige mais reagentes e mais espaço em uma placa de reação. Esta
abordagem oferece resultados quantitativos altamente precisos uma vez que os valores
quantitativos das amostras desconhecidas são interpolados a partir de uma curva padrão.
Considerar este método ao testar pequeno número de alvos e de amostras e se você estiver
procurando por alterações muito discretas na expressão gênica.

Método CT Comparativo (ΔΔCT)

Vantagem: Não é necessário correr uma curva padrão em cada placa. Isto pode resultar
numa economia de reagente.
Considerações (e Aplicações): Recomenda-se a utilização de uma curva padrão relativa
para validar as eficiências da PCR do alvo e do controle(s) endógeno(s), particularmente
quando você estiver procurando por discretas alterações na expressão gênica.
O método CT comparatvo é útil quando um grande número de alvos e/ou amostras são
testados. Considerar este método quando necessitar de uma alta demanda e e ao validar os
resultados de microarrays. A Applied Biosystems oferece softwares de PCR em tempo real
que realizam os cálculos de ΔΔC T além da configuração e análise da placa de PCR em
Tempo Real.
As informações que se seguem irão detalhar como os dados podem ser analisados usando
qualquer uma das duas metodologias.

39
2. Método da Curva Padrão Relativa
O método da Curva Padrão relativa usa um conjunto de padrões relativos a partir do qual
amostras desconhecidas são quantificadas. As curvas padrões para Quantificação Relativa
são fáceis de preparar, pois a quantidade é expressa em relação a alguma amostra de base,
como o calibrador. Um calibrador é uma amostra usada como base para comparação de
resultados. Por exemplo, em um estudo de efeitos de um medicamento sobre a expressão
gênica, um controle não tratado seria um calibrador apropriado. Para todas as amostras
experimentais, a quantidade de alvo é determinada pela interpolação a partir da uma curva
padrão e, em seguida, divida pela quantidade do alvo do calibrador. O calibrador, portanto,
se torna uma amostra 1X, e todas as outras quantidades são expressas como uma
diferença de n-vezes em relação ao calibrador.
Como a quantidade de amostra está dividida pela quantidade do calibrador, a unidade da
curva padrão está cancelada. Assim, tudo o que é exigido dos padrões é que suas diluições
sejam conhecidas. Para quantificação relativa, conseqüentemente, qualquer estoque de
cDNA, RNA ou DNA contendo o alvo apropriado pode ser usado para preparar os padrões.
Para o uso adequado de curvas padrões relativas:
1. O estoque de cDNA, RNA ou DNA deve ser diluído com precisão, porém as unidades
usadas para expressar as diluições não são importantes. Se diluições na ordem de
duas vezes de um produto de transcrição reversa (cDNA) de uma linhagem celular
controle for usada para construir uma curva padrão, as unidades podem ser os
valores de diluição 1; 0,5; 0,25; 0,125 e assim por diante. Ao usar o mesmo estoque
de cDNA, RNA ou DNA para preparar curvas padrões para múltiplas placas, as
quantidades relativas determinadas podem ser comparadas entre as placas.
2. Uma curva padrão de DNA pode ser usada para a quantificação relativa de RNA. Por
exemplo, você pode usar DNA genômico (se os primers forem desenhados dentro de
um único éxon) ou DNA plasmidial contendo o alvo de interesse. Isto assume que a
eficiência da transcrição reversa do alvo é a mesma em todas as amostras, mas o
valor exato desta eficiência precisa ser conhecido.
Como a quantificação deve ser normalizada para um controle endógeno, as curvas padrões
são preparadas tanto para o alvo como para o controle endógeno. Para cada amostra
experimental, você determina a quantidade de alvo e do controle endógeno a partir da curva
padrão apropriada.

3. Método CT Comparativo (Método ΔΔ CT)

O Método CT Comparativo, também referido como Método ΔΔC T, é semelhante ao Método
da Curva Padrão Relativa, exceto por que usa fórmulas aritméticas para alcançar o
resultado para quantificação relativa. É possivel eliminar o uso de curvas padrões e usar o
Método ΔΔCT para quantificação relativa enquanto as eficiências de PCR entre o(s) alvo(s) e
o(s) controle(s) endógeno(s) forem relativamente equivalentes. Isto é discutido em maiores
detalhes nesta seção.
Fórmula Aritmética:
A quantidade de alvo, normalizado para referência endógena e em relação ao calibrador, é
dada por:
2 –ΔΔCT

40
a. Um Experimento de Validação é Necessário para Determinar se o seu Cálculo de
ΔΔCT é Válido.
Observação: Os Ensaios de Expressão Gênica TaqMan® apresentam eficiências de
amplificação de 100%. Conseqüentemente, ao usar Ensaios de Expressão Gênica
TaqMan®, não é necessário medir a eficiência. A AB tem testado extensivamente os
parâmetros de desenho e acredita que os ensaios resultantes apresentarão 100% de
eficiência (± 10%) quando medidos em uma faixa de diluição de log 6, em amostras que não
apresentem inibidores de PCR.

Orientações para Validar um Experimento

Observação: Resultados precisos da PCR em tempo real dependem de fatores, tais como
reagentes, montagem do experimento, qualidade da amostra e análise.
As orientações para realizar um experimento de validação efetiva são:
1. A quantidade inicial de cDNA deve se estender por 5 ou 6 logs (ou seja, 100 ng
para 10 pg) e englobar os níveis de expressão do(s) alvo(s). Observação: Pode
não ser possível incluir todos os dados na análise de seu experimento de
validação, uma vez que alguns pontos de diluição podem estar fora da faixa
dinâmica do(s) ensaio(s).
2. Correr, pelo menos, 3 réplicas para cada ponto da curva padrão.
3. Correr as reações do alvo e do controle endógeno em poços separados (reações
únicas).
4. As concentrações de primers e sondas devem estar nos níveis recomendados de
900 nM para cada primer e 250 nM para cada sonda. Se os experimentos de
otimização produzirem concentrações alternativas de primers e/ou sondas,
ajustar as concentrações adequadamente.

Para um cálculo ΔΔCT válido, a eficiência da amplificação do alvo e a eficiência da

amplificação da referência devem ser aproximadamente iguais. Para determinar se as
reações de amplificação apresentam a mesma eficiência, você pode observar como o ΔC T
(CT alvo – CT referência) varia com a diluição do template. A avaliação das eficiências relativas da
amplificação do alvo e da amplificação do controle endógeno é alcançada pela corrida de
curvas padrões para cada amplicon ao utilizar a mesma amostra. A amostra no experimento
de validação deve expressar ambos os genes alvo e o controle endógeno. Por exemplo,
uma amostra que basicamente seja avaliada durante o experimento (como o calibrador)
poderia ser utilizada. Os valores CT gerados a partir dos pontos de massa da curva padrão
equivalente (alvo em comparação à referência) são usados no cálculo de ΔC T (CT alvo – CT
referência). Estes valores de ΔCT são colocados em gráfico em comparação ao log de entrada
para criar uma regressão linear semi-log. O slope da regressão linear semi-log resultante
pode ser usado como um critério geral para correr um experimento de validação. Em um
experimento de validação que é corrido, o valor absoluto do slope de ΔCT em comparação
ao log de entrada é < 0,1.
Observação: Se as eficiências das duas reações de PCR forem iguais, o gráfico da
quantidade do log de entrada em comparação ao ΔCT tem um slope de aproximadamente
zero.

No exemplo a seguir, as réplicas de cada ponto da curva padrão foram avaliadas por PCR
em tempo real. A média e desvios padrões dos valores C T das réplicas das amostra são
apresentados na tabela a seguir.

41
Tabela 9: Cálculos de ΔCT para o experimento de validação.
Quantidade de c-myc GAPDH ΔCT
Entrada do RNA
CT Média CT Média c-myc – GAPDH
Total (ng)
1,0 25,59 ± 0,04 22,64 ± 0,03 2,95 ± 0,05
0,5 26,77 ± 0,09 23,73 ± 0,05 3,04 ± 0,10
0,2 28,14 ± 0,05 25,12 ± 0,10 3,02 ± 0,11
0,1 29,18 ± 0,13 26,16 ± 0,02 3,01 ± 0,13
0,05 30,14 ± 0,03 27,17 ± 0,06 2,97 ± 0,07
0,02 31,44 ± 0,16 28,62 ± 0,10 2,82 ± 0,19
0,01 32,42 ± 0,12 29,45 ± 0,08 2,97 ± 0,14

b. Construção de Gráficos dos Resultados do Experimento de Validação

Exportar os dados analisados para o software Microsoft Excel® e, em seguida, tabular
novamente os dados conforme apresentado abaixo.

Tabela 10: Log de entrada do RNA e ΔCT de alvos para experimento de validação
Quantidade de Inicial de Log de Entrada: ng do ΔCT c-myc – GAPDH
RNA Total (ng) RNA Total
1 0,0 2,95
0,5 -0,3 3,04
0,2 -0,7 3,02
0,1 -1,0 3,01
0,05 -1,3 2,97
0,02 -1,7 2,82
0,01 -2,0 2,97

Para construir um gráfico destes dados no software Microsoft Excel®:

Após ter feito as curvas de diluição para o alvo e o controle endógeno, tirar as
médias de Ct para as triplicatas de cada ponto da curva. Em seguida calcular os ∆Ct entre
alvo e endógeno utilizando as médias de cada ponto (esses valores de ∆Ct irão compor o
eixo y do gráfico). Para cada ponto da curva, calcular o log da quantidade de material
(diluição) correspondente (esses valores irão compor o eixo x do gráfico).

Para montar o gráfico:

1) Selecionar os valores a serem plotados no gráfico (selecionando as células onde
estão listados)

42
 2) Ir em INSERIR – GRÁFICO – XY (Scatter)
3) Na opção “Series” remover “Series 2”.
4) Ainda na opção “Series”, clicar em X values e selecionar os valores correspondentes.
Fazer o mesmo para Y values
5) Com duplo clique em cada eixo do gráfico pode-se modificar as escalas dos eixos
6) Em seguida clicar com o botão direito em um dos pontos do gráfico e selecionar
“trendline”. Dentro de Trendline, na opção “type” selecionar “LINEAR”. Dentro de
Trendline, na opção “options” selecionar “Display equation on chart”. A equação que
aparece é do tipo y=ax+b. O valor que aparece na posição a corresponde ao slope
da reta e, se a eficiência de ambos o alvo e o endógeno estiverem semelhantes,
esse valor deverá ser entre -0,1 e 0.1.

Exemplo de gráfico

Figura 6: Gráfico de validação de ΔCT em comparação à quantidade do log de entrada de

RNA

43