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Techniques de l’Ingénieur
l’expertise technique et scientifique de référence
p224
Validation des méthodes d'analyse
quantitatives au moyen du profil
d'exactitude
Date de publication : 10/12/2012
Par :
Max FEINBERG
Ingénieur agronome, Docteur d'État en chimie,, Consultant en chimiométrie
Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite. © Editions T.I.
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des méthodes a-t-elle pris une place aussi importante ? Pour l’expliquer, il faut
rendre compte du développement de l’assurance qualité dans les laboratoires.
Les principes mêmes de l’assurance qualité sont bien connus et codifiés par
des normes très générales, publiées par l’Organisation internationale de nor-
malisation (ou International Organization for Standardisation, ISO). Elles
insistent sur le fait que la qualité des produits ou des services fournis par une
entreprise – comme des résultats d’analyse – a pour but de satisfaire les
besoins d’un client. L’assurance de la qualité est tout ce qui peut individuelle-
ment ou collectivement influencer le résultat d’une analyse.
Conceptuellement, c’est l’ensemble des dispositions à prendre pour assurer
que les résultats fournis seront de la qualité requise pour l’usage auquel l’utili-
sateur final les destine. Pratiquement, pour un laboratoire d’analyse et en
fonction de son domaine d’activité, chaque responsable peut s’appuyer sur des
référentiels qui fournissent des directives plus spécifiques pour organiser
l’assurance qualité. Il existe trois référentiels principaux qui règlent aujourd’hui
la vie des laboratoires d’analyse :
1) La norme ISO/CEI 17025 qui débouche sur l’accréditation, c’est-à-dire la véri-
fication de la compétence et l’aptitude d’un laboratoire à réaliser des analyses ;
elle est très générale et intéresse de nombreux types de laboratoires ;
2) Les bonnes pratiques de laboratoire (BPL) qui s’appliquent aux laboratoires
qui participent au développement de toute molécule chimique nouvelle pou-
vant avoir des effets sur la santé humaine ou l’environnement, tels les médica-
ments, les pesticides etc. ; c’est une démarche obligatoire pour un laboratoire
pharmaceutique ;
3) La norme ISO 15189 qui complète le « Guide de bonne exécution des
analyses » (GBEA) destiné spécifiquement aux laboratoires d’analyse de biolo-
gie médicale et qui précise comment peut se faire leur accréditation.
Tous ces textes affirment la nécessité de valider les méthodes mais sans
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Cartes de contrôle
a) Capacité de la méthode.
Essai d’aptitude
b) Plan de contrôle.
5. Utilisation en routine
Estimation de l’incertitude
Vérification d’aptitude
Optionnel
4. Validation externe
Expertise
de l’analyste a) Reproductibilité.
1. Sélection b) Répétabilité.
6. Revalidation
3. Validation interne
Optimisation
Test de robustesse a) Modèle d’étalonnage.
– Sensibilité.
Plan d’expérience b) Justesse.
– Spécificité.
2. Développement Procédure(s) c) Fidélité.
de validation
– Répétabilité (interne).
a) Optimisation de l’appareillage. – Fidélité intermédiaire.
b) Optimisation du mode opératoire. d) Limite de détection.
c) Mode opératoire normalisé (SOP). e) Limite de quantification.
(Cofrac). Toutefois, la façon de procéder à cette vérification n’est Validation de la méthode. Comme l’indique très explicitement la
pas très explicite et nous ne traiterons pas de ce cas de figure avec figure 1, la validation ne doit intervenir que sur une méthode
lequel nous sommes en désagrément. complètement mise au point. Son but est de démontrer que la
Étape 2 : Développement de la méthode. Ensuite, il convient de méthode employée permet effectivement d’atteindre les objectifs
mettre au point la méthode, c’est-à-dire optimiser les étapes du de performance exigés par un client. On distingue classiquement
mode opératoire pour les adapter à la matrice et aux conditions deux types de validation :
pratiques où elle sera utilisée. En particulier, il faut préciser – Étape 3 : Validation intralaboratoire ou interne. Elle est
l’ensemble des matrices auxquelles elle s’applique ainsi que la conduite dans un seul laboratoire. C’est surtout ce type de valida-
gamme de concentrations utilisables. En général, le développe- tion qui est traité dans cet article.
ment d’une méthode est synonyme d’optimisation. Pour cela la – Étape 4 : Validation interlaboratoires ou externe. Elle n’inté-
méthodologie de la surface de réponse est maintenant largement resse, en principe, que les méthodes utilisées par plusieurs labora-
reconnue comme l’approche la mieux adaptée à cet objectif [1] toires dont les résultats servent lors d’échanges commerciaux ou
[P 228] [P 229]. de contrôles officiels ; on peut la considérer comme optionnelle.
Si la méthode est « indirecte », une première tâche est d’établir Elle fait l’objet d’un article spécifique des Techniques de
un modèle d’étalonnage. Cependant, il existe aussi de nombreuses l’Ingénieur [P 226].
méthodes quantitatives « directes » qui ne requièrent pas d’étalon-
À l’issue de la validation, le mode opératoire peut évoluer mais,
nage. Un point important est aussi de vérifier l’existence d’éven-
surtout, on peut le compléter des performances effectivement
tuelles interférences. Dans certains cas favorables, un seul plan
constatées de la méthode.
d’expérience suffit pour optimiser les conditions opératoires et
évaluer les interférences. L’étape finale consiste à rédiger le mode Estimation de l’incertitude et vérification d’aptitude. La notion
opératoire retenu sous la forme de ce qu’on appelle dans le cadre d’incertitude de mesure appliquée aux analyses chimiques est
des Bonnes pratiques de laboratoires (BPL) un mode opératoire détaillée dans un article des Techniques de l’Ingénieur [P 105] et
normalisé ou Standard Operating Procedure (SOP). dans le guide désigné de façon abrégée par GUM (Guide pour
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l’expression de l’incertitude de mesure) [2]. C’est un concept relati- Exemple : la Décision européenne 2002/657 est un texte régle-
vement récent en chimie analytique, largement repris dans la mentaire facile à se procurer sur Internet [3]. Selon ce document « La
norme ISO/CEI 17025:2005 : la nouvelle exigence d’estimation de validation doit démontrer que la méthode d’analyse est conforme aux
l’incertitude de mesure revêt une importance particulière pour les critères applicables pour les caractéristiques de performances corres-
laboratoires accrédités. pondantes. Des objectifs de contrôle différents exigent des catégo-
ries de méthodes différentes ».
Étape 5 : Utilisation en routine. La vie de la méthode se poursuit
par son utilisation en routine. L’obligation de maîtrise de la qualité Le tableau 1 reprend un des tableaux de ce texte réglementaire.
implique un contrôle des performances dans le temps. Pour On constate que les critères à déterminer varient en fonction du type
effectuer ce contrôle, il existe des outils spécifiques que sont les de méthode, selon qu’elle sert au dépistage ou à la confirmation. La
cartes de contrôle et les essais d’aptitude. définition des critères CCα et CCβ est fournie par ailleurs dans le
texte.
Étape 6 : Revalidation. Ensuite, après un certain temps d’utilisa-
tion, on peut être amené à apporter des améliorations qui, selon Un point intéressant souligné dans ce texte est que la validation
leur importance, amènent à une revalidation plus ou moins consiste :
complète. – d’une part, en des obligations de résultats sous la forme de
valeurs cibles pour certains critères, comme le taux de récupération ;
– d’autre part, en des obligations de moyens à mettre en œuvre ;
1.2 Méthodologie classique par exemple, pour la détermination de certaines substances toxiques,
la CPG avec un détecteur à capture d’électrons ne peut être utilisée
de validation que si on a deux colonnes de polarités différentes.
Dans plusieurs documents référencés dans la partie Pour en À travers cet exemple, on voit se dessiner une nouvelle tendance,
savoir plus, la validation est présentée comme une suite d’études à savoir qu’à côté des critères de validation, on va associer des
expérimentales servant à calculer des critères de validation. valeurs seuils de performances en fonction de la méthode et de ses
Prenons un exemple pour illustrer les problèmes qu’ils soulèvent. objectifs, comme l’illustre le tableau 2.
Type de méthodes
Dépistage Confirmation Dépistage Confirmation
Justesse/récupération – – – +
Fidélité – – + +
Sélectivité/spécificité + + + +
Applicabilité + + + +
Robustesse + + + +
Stabilité + + + +
Tableau 2 – Valeurs seuils retenues par la Commission européenne pour le contrôle des résidus
de médicaments vétérinaires
Critère Niveau de concentration Valeurs seuils
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– λ < Z − X < +λ
Les quantités – λ et + λ représentent ces « distances
raisonnables » maximales qu’un client est prêt à accepter. Elles
forment ce que nous appelons l’intervalle d’acceptabilité. Si ces
distances sont les mêmes de chaque côté de la valeur vraie, l’inter-
valle est symétrique et l’équation précédente devient : Limite Valeur
d’acceptabilité de référence
Z −X < λ
Elle peut aussi s’écrire sous la forme d’un écart relatif : La limite d’acceptabilité représente
« l’emploi prévu » de la méthode.
Z −X
<λ % a méthode 1 (valide)
X
Quant à l’idée de « fournir une garantie », elle peut s’écrire sous
la forme d’une probabilité supérieure ou égale à une proportion β :
Prob ( Z − X < λ ) β
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∑z
à ce qu’on appelle globalement l’erreur de mesure ou erreur totale.
i − z2
Z i=1
s=
I −1
2.2 Critère de fidélité
Malgré la similitude entre les premiers mots des définitions de
la justesse et de la fidélité, la fidélité est un critère qui quantifie la
dispersion des mesurages sans faire intervenir la valeur de réfé-
rence, alors que la justesse caractérise un décalage par rapport à
la valeur de référence. La fidélité est toujours évaluée au moyen
d’écarts-types. Mesure Z
+
Principaux termes en relation avec la fidélité L’estimation de la fidélité requiert le calcul d’écarts-types.
Fidélité de mesure (VIM 2.15) : étroitesse de l’accord entre
les indications ou les valeurs mesurées obtenues par des Figure 5 – Estimation de la fidélité
mesurages répétés du même objet ou d’objets similaires dans
des conditions spécifiées.
Condition de répétabilité (VIM 2.20) : condition de mesurage écarts-types : c’est ce qui est défini comme conditions de répétabi-
dans un ensemble de conditions qui comprennent la même lité, de fidélité intermédiaire ou de reproductibilité. Le paramètre
procédure de mesure, les mêmes opérateurs, le même système statistique utilisé pour estimer la fidélité est l’écart-type et, prati-
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Sr = Sr2 + S 2I
Sr
Sources de variation
0 1 2 n Plusieurs
Jour ou Jour et Sources laboratoires
Opérateur Opérateur
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Vendredi Étalonnage 3
La procédure la plus simple, qui est généralement retenue pour 3.3 Utilisation du coefficient de variation
établir un profil d’exactitude, consiste à effectuer des répétitions
sur plusieurs jours sur le même échantillon. Les opérateurs Le coefficient de variation (CV) de la fidélité intermédiaire (ou de
peuvent avoir changé, les réactifs évolué, l’échantillon à analyser la répétabilité) est défini comme le rapport de l’écart-type à la
aussi, etc., on va ainsi pouvoir mesurer les effets de différentes moyenne, ce qui donne selon les notations choisies et décrites
sources de variation et simuler, en quelque sorte, les conditions dans le paragraphe 7 :
effectives d’analyse. En effet, lorsqu’un échantillon arrive à la porte
d’un laboratoire, sa date d’analyse n’est pas exactement prévisible, sF
ni l’opérateur qui s’en chargera, etc. CVF = 100 ×
Z
Exemple : pour estimer la fidélité d’une méthode HPLC sous Les analystes aiment bien l’utiliser pour exprimer la perfor-
condition de fidélité intermédiaire, on va sélectionner un échantillon mance d’une méthode. On peut y trouver plusieurs avantages :
homogénéisé, puis réaliser le plan d’expérience présenté tableau 3
– il permet d’additionner des sources de variation ;
comprenant 4 séries et 3 répétitions. Les notations sont celles qui
sont utilisées dans le paragraphe 7. – il est facile à calculer ;
– il permet de comparer facilement deux méthodes appliquées
sur un même échantillon sans tenir compte de la concentration.
Pour certains types d’analytes difficiles à conserver, comme les
comptages bactériens, cette solution peut être problématique. Par Malheureusement, ces avantages qu’on attribue au coefficient
exemple, si le laboratoire analyse des échantillons très instables, de variation sont souvent fallacieux :
comme des échantillons de sang non congelables, on ne peut plus – d’abord, pour une méthode donnée, le CVF dépend de la
utiliser le jour comme série. On va alors demander à plusieurs concentration, comme on le verra au paragraphe 5.8.1. Donc, si on
opérateurs de faire des répétitions sur un seul jour et si le labora- l’utilise pour comparer des méthodes, il faut s’assurer qu’elles ont
toire possède plusieurs appareils, de même modèle ou non, on va été appliquées sur des échantillons ayant des niveaux de
combiner l’opérateur et l’appareil. Dans le cas de 2 opérateurs et 2 concentrations proches ;
appareils, on peut ainsi obtenir 4 séries, comme suit : – ensuite, c’est une mesure relative qui dépend de deux
paramètres : la moyenne et l’écart-type. On peut facilement voir
que, si l’écart-type est constant lorsque la moyenne varie, le
Série 1 Appareil 1 Opérateur 1 coefficient de variation n’est pas constant ;
Série 2 Appareil 1 Opérateur 2 – enfin, il convient donc d’être très prudent vis-à-vis d’un CV car
il peut masquer des situations très différentes et, tout compte fait,
Série 3 Appareil 2 Opérateur 1
n’apporter que peu d’information.
Série 4 Appareil 2 Opérateur 2
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Z
R % = 100 ×
X Étalon
national
– biais relatif :
Institut
de métrologie
Z −X
B % = 100 × Étalon
X de référence Laboratoires
d’étalonnage
Ils sont à peu près équivalents. En particulier, si la valeur du Étalon accrédités
biais absolu ou relatif est négative, cela signifie que la méthode de transfert
sous-estime la valeur de référence, par contre si elle est positive
elle la surestime. Pour le taux de recouvrement, la comparaison Étalonnage
Étalon interne
doit se faire par rapport à 100 %. Le taux de recouvrement est de travail
parlant, car il s’apparente à un facteur de correction qui mesure la
proportion de ce qu’on a effectivement mesuré par rapport à ce
Départements
qu’on aurait dû mesurer. de l’entreprise
La difficulté pour évaluer la justesse tient aux problèmes
rencontrés pour connaître la valeur de référence X. C’est même un Qualification
problème si délicat que beaucoup d’analystes pensent que c’est de l’appareillage
souvent impossible.
Pour essayer d’y voir plus clair, il est intéressant de considérer
comment la métrologie propose d’établir des valeurs de référence
en chimie. Pourquoi la métrologie ? Par définition, c’est l’ensemble Figure 9 – Conception de la traçabilité métrologique
des techniques et des savoir-faire qui permettent d’effectuer des à partir des unités SI
mesures et d’avoir une confiance suffisante dans leurs résultats.
comme l’explique la norme ISO 17043 [7]. La matrice utilisée est
souvent bien adaptée. Ils sont meilleur marché, leur incertitude est
4.2 Traçabilité en chimie connue ;
Pour bien appréhender l’idée de justesse sous l’angle de la 4/ Matériaux de référence internes. La valeur de référence est assi-
gnée par l’utilisateur, parfois en collaboration avec d’autres labora-
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Effet
multiplicatif
5. Méthode du profil
d’exactitude
Les bases théoriques du profil d’exactitude et les raisons de son
introduction ont été décrites dans le paragraphe 1.3. D’un point de
0 100 vue pratique, c’est la combinaison, sous la forme d’un graphique,
Concentration de référence X de plusieurs intervalles de tolérance (β-IT) calculés à partir de
mesures réalisées sur des échantillons à différents niveaux de
Figure 10 – Interférences à effet additif ou multiplicatif concentration et d’un intervalle d’acceptabilité. Cette méthode a
fait l’objet de nombreuses publications dont certaines sont indi-
quées dans les sources bibliographiques. Une normalisation
férences spécifiquement liées à un type de méthode. La liste complète de cette méthodologie a été réalisée, d’une part, par la
suivante est un essai de classification non exhaustif : Société des sciences et techniques pharmaceutiques (SFSTP) [8],
– interférences spectrales dans les méthodes spectroscopiques ; d’autre part par l’Afnor [9]. Divers projets de normes ISO en cours
– interférences dues au mode de préparation de l’échantillon, de rédaction la reprennent.
pertes à la minéralisation ou pollution par les réactifs ; Cette méthodologie s’appuie sur deux concepts complémen-
– réactions croisées très classiques dans les méthodes taires :
immunologiques ;
– la limite d’acceptabilité qui sert à chiffrer les objectifs de la
– recouvrement de pics en chromatographie...
méthode. C’est le seuil de performance globale fixé par l’utilisateur
Nombre d’interférences sont aussi dues à la présence d’autres du résultat. La plupart du temps, elle s’exprime comme un pour-
constituants que celui qui est recherché dans l’échantillon : on centage autour de la valeur de référence, par exemple ± 10 % ;
parle alors d’effets de matrice. – l’intervalle de tolérance (β-IT) qui délimite un intervalle dans
Pratiquement, les interférences ont deux conséquences lequel se trouvera une proportion moyenne β % de futures
néfastes : mesures.
– soit, elles entraînent une surestimation de la concentration de Elle peut se résumer par les 10 étapes suivantes.
l’échantillon, car la réponse est plus élevée que ce qu’elle devrait
être ;
– soit, elles causent une sous-estimation de la concentration, car Les 10 étapes pour valider une méthode avec le profil
le signal est partiellement masqué. d’exactitude
Dans les deux cas, elles occasionnent donc un biais de justesse. 1. Disposer du mode opératoire et définir le mesurande ;
On peut proposer de représenter graphiquement l’effet du 2. Définir le domaine de validation (gamme de
manque de spécificité en considérant la droite de justesse. La concentrations) et l’objectif attendu de la méthode sous la
figure 10 illustre cette droite de justesse selon trois situations forme d’un intervalle d’acceptabilité ;
hypothétiques : 3. Sélectionner des échantillons de validation dont les
– les cercles pleins produisent une droite confondue avec la valeurs de référence sont connues ;
première bissectrice ; la spécificité est parfaite ; 4. Choisir un plan d’expérience de validation ;
– les carrés illustrent un décalage systématique des
5. Pour les méthodes indirectes, choisir du plan d’expérience
concentrations retrouvées ; on parle d’effet additif ;
d’étalonnage ;
– les losanges illustrent une autre situation dans laquelle le biais
est proportionnel à la concentration ; on parle d’effet multiplicatif. 6. Collecter les données ;
En conservant nos notations, à savoir X la valeur de référence et 7. Pour les méthodes indirectes, calculer les concentrations
Z la concentration retrouvée par étalonnage inverse, ces trois retrouvées par étalonnage inverse ;
droites correspondent aux équations suivantes : 8. Calculer les critères de validation à partir des
– absence d’effet : concentrations retrouvées : principalement les écarts-types de
fidélité de fidélité intermédiaire et des biais de justesse ;
Z =X
9. Calculer les intervalles de tolérance et construire le profil
– effet multiplicatif : d’exactitude ;
Z = b1X 10. Interpréter les résultats et décider si la méthode est valide
ou non.
– effet additif :
Z = b0 + X
Les étapes 5 et 7 sont optionnelles dans le cas des méthodes qui
Mais, on peut aussi supposer qu’il existe des situations où ces fournissent directement la concentration retrouvée sans étalon-
effets se combinent : nage, comme la détermination de l’azote de Kjeldahl.
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5.1 Disposer du mode opératoire – les méthodes pour lesquelles il existe une méthode de
référence ;
et définir le mesurande – les méthodes pour lesquelles des essais d’aptitude sont orga-
nisés et des MRE disponibles ;
Ce point sert à rappeler qu’une validation ne doit se faire que
– les autres méthodes pour lesquelles aucune des solutions
pour une méthode complètement mise au point. Essayer de
précédentes n’est disponible.
valider une méthode en même temps qu’on procède à sa mise au
point, débouche la plupart du temps sur un échec et, pour le
moins, sur une perte de temps et d’argent. Toujours poursuivant notre exemple, on a en fait, combiné les
propositions 3 et 4, car il n’existe ni MRC, ni essai d’aptitude spécia-
De même, il est important de bien définir la quantité mesurée lement dédié au sucralose. Mais, le sucralose est disponible sous la
(mesurande). Tout comme la procédure qui sert à estimer l’incerti- forme d’un réactif commercial de pureté connue (95 %) et peut ainsi
tude d’une mesure, c’est un point de départ obligé [6]. servir, d’une part pour des solutions d’étalonnage, d’autre part à des
ajouts dosés. Ensuite, il existe des essais d’aptitude sur des aliments
Exemple : à titre d’exemple et comme support de calcul, nous uti- et on peut disposer de matériaux dont l’homogénéité a été vérifiée.
liserons les résultats d’une étude de validation qui a porté sur une Finalement, un échantillon de jus de fruit a été sélectionné qui ne
méthode de quantification d’un édulcorant – le sucralose ou contenait pas de sucralose et qui était disponible en quantité suffi-
trichlorogalactosaccharose – dans les aliments par couplage chroma- sante pour faire tous les essais. Pour faire varier la valeur de réfé-
tographie haute performance avec une colonne échangeuse d’anions rence, on a décidé d’utiliser la méthode des ajouts dosés.
et un détecteur ampérométrique à alimentation pulsée (HPAE-PAD).
Le sucralose a un pouvoir sucrant 500 à 600 fois plus élevé que le
saccharose (à poids égal), soit 2 fois plus que la saccharine et 3 fois 5.4 Plan d’expérience de validation
plus que l’aspartame. Comme il n’apporte que peu de calories, il est
très apprécié dans les industries agroalimentaires pour la formulation La contrainte primordiale est de se situer en condition de fidélité
d’aliments allégés. intermédiaire et de réaliser les séries de mesures de façon à tenir
Le mode opératoire employé a été adapté de la référence [10], en compte des diverses sources d’incertitude. Dans ce cas, le plus
fonction des équipements disponibles au laboratoire et ne fera pas simple est de faire les essais sur plusieurs jours ce qui permet de
l’objet d’une description détaillée. mettre en jeu un grand nombre de sources de variation : évolution
des échantillons ; changements d’opérateurs ; changements
La méthode de quantification se fait par un étalonnage externe à d’étalonnages ; évolution des réactifs ; modification des réglages
l’aide de solutions étalons de sucralose commercial. La réponse instrumentaux, etc. La série est donc équivalente au jour, dans cet
instrumentale est la surface des pics chromatographiques. exemple.
Se posent alors trois questions :
5.2 Définir les objectifs – sur combien de jours (séries) I faut-il faire les mesures ?
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Tableau 4 – Plan de validation. Les réponses instrumentales sont exprimées en unités arbitraires
(ua) et les concentrations de référence (mg/L)
Référence Réponse 1 Réponse 2 Réponse 3
Séries Niveaux
(mg/L) (ua) (ua) (ua)
À ce stade préparatoire, l’utilisation d’un tableur est tout à fait Les paramètres J′ et K′ peuvent être différents de ceux utilisés
commode. On peut alors faire des calculs complémentaires, pour le plan de validation ; ce qui n’est pas le cas pour le nombre
comme prévoir la quantité d’échantillons nécessaire, définir un de séries. En effet, il faut réaliser un étalonnage pour chaque série
calendrier et un planning des travaux entre opérateurs, etc. (jour) et l’utiliser pour quantifier les échantillons de validation. Le
but est de prendre en compte la variabilité de la réponse instru-
Exemple : dans le tableau 4, le plan d’expérience est présenté mentale d’une série à l’autre et de vérifier sur plusieurs jours si la
comme 4 ensembles de mesures. Les 4 séries sont notées en méthode est capable de quantifier de façon constante le même
utilisant les codes : Jour 1, Jour 2, Jour 3 et Jour 4 ; et pour les échantillon.
niveaux de concentration : A, B, C, D et E. Seules les réponses instru-
mentales sont reportées correspondant aux 3 répétitions. Les unités
arbitraires utilisées pour les surfaces de pics sont celles fournies par Dans l’exemple, lors du développement de la méthode, on a pu
le logiciel d’intégration du chromatographe. vérifier que le modèle d’étalonnage était bien une droite ; il est donc
inutile de multiplier les points de la gamme d’étalonnage. Pour se
situer dans les conditions les plus proches possible de celles qui
5.5 Plan d’expérience d’étalonnage seront utilisées en routine, à savoir un étalonnage basé sur 2 solu-
tions étalons de concentration différentes répétées 2 fois, on a choisi
Pour bien des méthodes d’analyse, le plan d’étalonnage est J′ = 2 et K′ = 2. Bien sûr, si on a observé une courbure ou si on
optionnel car il n’est utile que si la méthode est indirecte et utilise un modèle d’étalonnage plus compliqué qu’une droite, il faut
requiert un étalonnage externe ; ce qui est le cas dans l’exemple augmenter le nombre de niveaux K′.
présenté.
Finalement, on a réalisé 4 × 2 × 2 = 16 essais d’étalonnage. Le
Le plan d’étalonnage dépend aussi de trois paramètres : tableau 5 illustre la disposition qu’on peut adopter pour une feuille de
– I le nombre de séries (qui est le même que pour le plan de calcul. Les deux niveaux étalons sont codés « Bas » et « Haut ».
validation) ; Dans ce cas, ils valent 0,02 et 1,5 mg/L et représentent les deux solu-
– J′ le nombre de répétitions ; tions étalons préparées chaque jour, à partir d’une même solu-
– K′ le nombre de solutions étalons de concentrations tion-mère de sucralose à 10 g/L, elle-même préparée chaque jour par
différentes. pesée.
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Haut 1,5 338 208 Exemple : on utilise les réponses du tableau 4, en veillant à bien
utiliser les coefficients correspondant au jour où les mesures ont été
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A B C D E F G H I
1
Profil d’exactitude du sucralose dans le lait
2 Plan d’étalonnage. Réponses instrumentales en UA
3
4 Série Niveau Concentration Réponse Sensibilité Blanc
5 Jour 1 Bas 0.02 15849 Jour 1 223923.311 11620.034
6 Jour 1 Bas 0.02 16348 en G6 =PENTE(D5:D8;C5:C8)
7 Jour 1 Haut 1.5 351436 en H6 =ORDONNEE.ORIGINE(D5:D8;C5:C8)
8 Jour 1 Haut 1.5 343574
9 Jour 2 Bas 0.02 15600 Jour 2 220550.338 11625.493
10 Jour 2 Bas 0.02 16473
11 Jour 2 Haut 1.5 343574
12 Jour 2 Haut 1.5 341328
13 Jour 3 Bas 0.02 14601 Jour 3 218400.338 10482.493
14 Jour 3 Bas 0.02 15100
15 Jour 3 Haut 1.5 337958
16 Jour 3 Haut 1.5 338208
17 Jour 4 Bas 0.02 14476 Jour 4 223333.446 10695.831
18 Jour 4 Bas 0.02 15849
19 Jour 4 Haut 1.5 341952
20 Jour 4 Haut 1.5 349440
21
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Variance de répétabilité (sr2 ) 3,6083 × 10–5 0,0000585 4,1417 × 10–5 0,00010658 0,00020475
Variance inter-séries (sB2 ) 4,0815 × 10–5 4,5741 × 10–6 1,3046 × 10–5 9,6278 × 10–5 0,00017494
Variance de fidélité
7,6898 × 10–5 6,3074 × 10–5 5,4463 × 10–5
intermédiaire sF2 ( ) 0,00020286 0,00037969
de la répétabilité CVr
Coefficient de variation
24,2 % 6,2 % 2,9 % 2,9 % 2,0 %
de la fidélité intermédiaire CVF
Même pour gamme de concentrations aussi faible, on Tableau 8 – Calcul du taux de recouvrement
constate un fait important et universel : l’écart-type de fidélité
dépend largement de la concentration ; il augmente avec elle et Niveaux A B C D E
doit toujours être relié à la concentration où il a été estimé.
Valeur
0,035 0,125 0,25 0,5 1
de référence
Mais, pour l’instant nous ne porterons pas de jugement sur les
valeurs individuelles trouvées pour chaque critère, étant donné que, Moyenne
0,036 0,128 0,25 0,49 0,98
par principe, le profil d’exactitude va combiner la fidélité et la jus- retrouvée
tesse et permettre un diagnostic global qui interviendra plus loin.
Taux
104 % 103 % 101 % 99 % 98 %
de recouvrement
5.8.2 Justesse par niveau
La justesse peut être alors calculée à partir des données du
tableau 6, sous diverses formes, comme un biais moyen absolu ou Exemple : le tableau 9 présente un récapitulatif des critères
relatif. Nous préférons l’évaluer à l’aide du taux de récupération d’exactitude pour les 5 niveaux de concentration. La probabilité β
(ou recouvrement) moyen R %, dans la mesure où les valeurs de associée à l’intervalle de tolérance est de 80 % et les limites d'accep-
référence sont obtenues par ajouts dosés. R % s’obtient en faisant tabilité sont de ± 10 %, comme décidé auparavant.
le rapport entre la moyenne des concentrations retrouvées et la On peut interpréter ces valeurs de la façon suivante. Par exemple au
valeur de référence (tableau 8) : niveau A, pour une concentration de référence égale à 0,035 mg/L,
80 % des futures mesures se situeront entre 0,0225 et 0,05 mg/L ; cet
Z intervalle est dissymétrique car la méthode présente un léger biais de
R % = 100 × justesse de 4 %. Si on passe en valeurs relatives, obtenues en divisant
X
les valeurs absolues par la concentration de référence correspondante,
on obtient 64 % et 143 %. Or, les limites d’acceptabilité sont entre
90 % et 110 %. La méthode n’est donc pas capable de produire au
5.8.3 Intervalle de tolérance par niveau moins 80 % de futures mesures entre les limites d’acceptabilité à ce
Les détails du calcul des intervalles de tolérance sont fournis niveau de concentration : elle n’est donc pas validée aux basses
dans le paragraphe 7.3, ainsi qu’un exemple de calcul sous Excel concentrations. Par contre, elle est valide pour les niveaux C, D et E.
qui porte sur les données du niveau B. Les valeurs qui indiquent un dépassement sont en italique.
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1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
Concentration de référence (mg/L)
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150
140
130
La flèche indique la position approximative de la
120 limite de quantification telle que définie dans le texte.
Son calcul précis est décrit dans le paragraphe 6.3.
Exactitude (%)
110
100
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
90
Concentration de référence (mg/L)
80
70
60
Figure 13 – Profil d’exactitude de la méthode de dosage du sucralose représenté à partir des valeurs relatives
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Les lignes représentent les droites étalons, les cercles, les concentra-
tions retrouvées pour des ajouts équivalents à la valeur en abscisse. Dans lequel Z est le résultat observé, µ la valeur vraie du mesu-
Les différentes droites d’étalonnage illustrent les effets de matrice. rande, δ une expression du manque de fidélité de la méthode
(biais), β la composante qui traduit l’effet de la série – comme le
Figure 14 – Données brutes non corrigées pour l’acide nicotinique jour – et E une erreur résiduelle de répétabilité qui est supposée
dans du lait distribuée selon une loi normale.
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Z = µ +δ +B +E 20
10
En appliquant l’équation de la loi de propagation des incerti-
tudes décrite dans le GUM [2], l’expression de l’incertitude-type 0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
composée de Z est à peu près égale à : – 10
– 20 Concentration (mg/L)
uc (Z ) ≈ u 2 (δ ) + sB2 + sr2 – 30
– 40
L’intérêt de cette formulation est de retrouver un certain nombre
de résultats déjà présentés précédemment. Par exemple, la – 50
variance de fidélité intermédiaire est égale à : – 60
Il en résulte que l’incertitude-type composée de Z est proche de 7.1 Choix d’un outil de calcul
sIT l’écart-type de l’intervalle de tolérance, introduit au
paragraphe 7.3. Une grande partie de l’incertitude peut donc être L’exploitation des données décrite ici fait appel à des techniques
estimée directement à partir des calculs effectués lors de la statistiques qui demandent pas mal de calculs : il est évident que
construction du profil d’exactitude pour les différents niveaux de l’application numérique devient un aspect fondamental de la vali-
concentration retenus dans le plan de validation. D’un point de vue dation. Or, tous les laboratoires d’analyse disposent aujourd’hui de
pratique, on utilise l’incertitude élargie à 95 %, notée U(Z) = 2sIT . tableurs qui permettent parfaitement de réaliser ces calculs. Pour
traiter les données, on peut choisir parmi :
Exemple : à partir des données rassemblées au tableau 9, on peut
– des logiciels commerciaux : Excel® de Microsoft ; iWorks de
facilement calculer l’incertitude élargie, exprimée, soit directement,
Apple ; Lotus 1-2-3 de IBM...
soit de façon relative en la ramenant à la valeur de référence. Le
tableau 10 rassemble ces résultats qui montrent que l’incertitude – des logiciels libres de droit (freewares) : OpenOffice.org Calc
varie entre 54 et 4 %. Les valeurs très élevées à proximité de la LQ initialement développé par Sun Microsystems
illustre bien l’idée que pour les concentrations les plus basses, l’ana- (http://fr.openoffice.org/) ; LibreOffice édité par The Document
lyste ne peut plus vraiment garantir l’acceptabilité de ses résultats. Foundation (http://fr.libreoffice.org/) ; R du Comprehensive R
Archive Network (http://www.r-project.org/)...
On peut aussi visualiser l’incertitude en construisant un profil
d’incertitude comme celui de la figure 15. La seule difficulté est que l’utilisateur possède une compétence
suffisante pour :
Rappelons que ce calcul basé sur l’écart-type sIT permet – créer, organiser et documenter des feuilles de calcul ;
d’estimer la majeure partie de l’incertitude de mesure, mais ne – saisir des fonctions internes et savoir comment elles
prend pas en compte l’incertitude sur la valeur de référence. Ne marchent ;
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– savoir ajouter des protections si ces feuilles sont destinées à Par contre, les conditions de reproductibilité consistent à réaliser
l’ensemble du personnel d’un laboratoire ; pour assurer une bonne les séries de répétitions dans différents laboratoires. Ce sont donc
protection, il est aussi possible de rédiger des macros ou des des conditions typiquement mises en œuvre lors d’une validation
scripts mais ils exigent un effort de programmation et un niveau externe ou inter-laboratoires.
de maîtrise plus élevés. Cependant, quelles que soient les conditions choisies, le modèle
Une évolution prévisible sera la généralisation de logiciels théorique utilisé dans cette norme prend la même forme :
dédiés pour conduire les calculs qui découlent des études de vali- Z ij = m + Bi + Eij
dation. Diverses solutions sont envisageables, qui vont de la
rédaction en interne de feuilles de calcul à l’achat de logiciels Chaque répétition, notée Zij avec i ∈ [1, I] et j ∈ [1, J], est la
spécialisés. Cependant, on peut observer avec surprise que les somme de trois paramètres :
responsables de laboratoire, s’ils sont prêts à investir des sommes – m la valeur moyenne ;
très conséquentes dans des instruments de dernière génération, – Bi qui traduit l’« effet séries » ; dans le cas d’une analyse
considèrent parfois comme peu supportable l’achat d’un logiciel inter-laboratoires, Bi représente l’effet global du laboratoire et on
dont le seul rôle est de valoriser les mesures qui sortent de ces parlera d’« effet laboratoire » ;
nouveaux appareils. – Eij une erreur résiduelle aléatoire.
La grande facilité d’utilisation des tableurs tient à la familiarité Selon ces notations, le numéro de série i varie entre 1 et I et le
des analystes avec leur interface graphique ; ce qui nous permet numéro de répétition j entre 1 et J si toutes les séries contiennent
de ne pas donner plus de détails sur leur utilisation. Leur le même nombre de répétitions. Dans un premier temps, on va
compréhension et leur adaptation requièrent cependant une bonne considérer que toutes les séries ont le même nombre de répéti-
connaissance de la saisie des formules Excel, ainsi que des modes tions, ce qui n’est pas toujours le cas.
de protection des feuilles de calcul pour éviter toute manœuvre
malencontreuse. Il est important de noter que si on utilise un échantillon dont la
valeur de référence X est connue, comme celle d’un matériau de
référence, m peut être différente de cette valeur vraie. On peut, en
effet, écrire :
7.2 Écarts-types de fidélité
m = X +δ
Les divers critères de validation présentés dans le paragraphe 5 où δ représente le biais de justesse de la méthode.
proviennent de méthodes statistiques qui sont décrites ici.
La série des six normes ISO 5725 [13] est consacrée à l’estima- Exemple
tion de l’exactitude (justesse et fidélité) et, principalement, aux Sur la figure 16, sont représentées 3 séries de 5 mesures réalisées
paramètres de fidélité qui sont estimés par différents écarts-types : dans le même laboratoire sur le même échantillon pendant 3 jours.
– de répétabilité, noté sr ; Ces 3 jours n’ont pas à être successifs. Dans le haut de la figure,
– de fidélité intermédiaire, noté sF ; chaque répétition est illustrée par un petit point et les moyennes des
séries par des croix. La valeur m est représentée par un gros point
– de reproductibilité, noté sR .
noir. Si on suppose que les répétitions Zij sont distribuées selon des
Rappelons que les conditions de fidélité intermédiaire consistent lois normales, on peut obtenir la représentation qui est dans le bas de
à réaliser des séries de répétitions sur le même échantillon en
la figure. Chaque moyenne quotidienne est notée Z i . On pourrait
appliquant la même procédure opératoire dans le même lieu mais
sur une période de temps qui peut être étendue ou en faisant alors calculer un écart-type pour chaque série, noté si . Mais, pour
varier d’autres conditions, comme les opérateurs, les réglages modéliser l’idée qu’il existe une répétabilité unique de la méthode,
instrumentaux, etc. Ce sont donc des conditions typiquement comme l’illustre la figure 16, on va associer à chaque jour 3 lois
mises en œuvre lors d’une validation interne. normales ayant le même écart-type de répétabilité sr .
+ + +
Z1 m m Z2 m Z3
B1 B2 B3
+ + +
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Par ailleurs, pour chaque série on peut calculer un écart à la Le calcul de la variance inter-séries est un peu plus compliqué :
moyenne générale Bi , qui par définition vaut Z i − m . Cet écart ne
SCE B
doit pas être confondu avec le biais de justesse, noté δ. − s r2
I − 1
s B2 =
J
7.2.1 Cas du plan équilibré
On parle de plan équilibré lorsque toutes les séries ont le même Par définition, l’écart-type de fidélité intermédiaire est alors
nombre de répétitions. Le traitement statistique de ce type de fourni par la formule suivante :
données consiste à utiliser une méthode appelée l’analyse de la
variance à un facteur. Elle s’appelle ainsi car elle permet de sF = sr2 + sB2
décomposer la variance totale de toutes les mesures – toutes
séries confondues – en une variance intra-série et une variance La plupart des logiciels statistiques permettent d’effectuer, ce
inter-séries. qu’on appelle une analyse de variance à un facteur. Par exemple,
La décomposition de la variance totale en ses deux l’utilitaire « Analyse de variance » de Microsoft Excel® contient
composantes se fait de façon très simple. D’abord on va dire que cette fonction. Cependant, on ne peut pas l’utiliser pour estimer les
la différence entre chaque mesure Zij et la moyenne générale, variances de fidélité. En effet, cet utilitaire utilise un modèle, dit « à
effet fixe » qui ne fournit que la valeur de sr mais pas celle de sB .
notée Z , est la somme de deux différences : Le modèle qu’il faut utiliser est dit « à effet aléatoire » et exige de
construire une feuille de calcul spécifique.
(Z − Z ) = (Z
ij ij − Zi + Zi − Z) ( ) Le point de départ est fourni par l’équation d’analyse de la
variance dans sa forme condensée :
En élevant au carré les deux membres de cette équation et en
SCE t = SCEr + SCEB
sommant pour toutes les mesures observées, on obtient l’équation
d’analyse de la variance :
Elle permet de voir qu’il suffit de calculer deux sommes de
carrés pour obtenir la troisième par différence. Classiquement,
(Z − Z ) = ∑ ∑(Z )2 + ∑ J ( Z i − Z )
I J 2 I J I 2
∑∑ ij ij − Zi c’est ainsi qu’on obtient la SCEB :
i =1 j =1 i =1 j =1 i =1
SCEB = SCE t − SCEr
Une notation condensée : SCEt = SCEr + SCEB permet d’intro-
duire trois sommes de carrés d’écarts à la moyenne (SCE) définies
comme suit : Exemple : pour illustrer la méthode, on va utiliser les données du
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– SCEt : somme des carrés des écarts totale ; niveau B de l’étude de validation du sucralose qui sont réunies dans
– SCEB : somme des carrés des écarts inter-séries ; le tableau 6. Il s’agit de 5 séries (I = 5) de 3 répétitions (J = 3) orga-
– SCEr : somme des carrés des écarts intra-série ou résiduelle. nisées selon une disposition tabulaire qui est la plus commode pour
les calculs car elle permet de recopier facilement certaines formules,
Finalement, la somme totale des carrés des écarts à la moyenne comme le montre la figure 17. Par convention, les formules de calcul
se décompose en une somme de carrés d’écarts dus à l’effet série sont situées à droite des cellules auxquelles elles s’appliquent.
et une somme de carrés résiduelle due à l’erreur résiduelle.
Jusqu’à présent, on n’a pas besoin de faire l’hypothèse que les La zone des données brutes se situe dans les cellules B5:D8. La pre-
distributions théoriques des variables Z soient normales pour mière étape est de vérifier si les données sont bien équilibrées,
arriver à ce résultat. c’est-à-dire que chaque série contient le même nombre de répétitions.
Pour faire cette vérification, diverses stratégies sont possibles. Dans la
Les moyennes par série introduites dans les formules précé- cellule F5 la formule = NB(B5:D5) fournit le nombre de répétitions du
dentes sont obtenues en appliquant la formule classique de calcul Jour 01. Elle est recopiée pour toutes les autres séries. Puis on va lire le
de la moyenne. Pour faire ces calculs avec un tableur, on peut nombre de séries, grâce à la formule de la cellule B10 = NB(B5:B8) et
donc tout simplement utiliser la fonction MOYENNE. enfin le nombre total de mesures dans la cellule B11 = NB(B5:D8). La
– Moyenne par série : vérification elle-même est effectuée dans la cellule par le test en
B12 = SI(F5*B10< >B11 ; « Calcul impossible » ; F5). Le principe du test
consiste à vérifier si le nombre total de mesures est égal au produit du
∑ j =1Z i j
J
nombre de séries et de répétitions. On peut vérifier s’il fonctionne en
Zi = supprimant une donnée au hasard. Il serait possible de faire un autre
J
test, en comptant le nombre de cellules vides, comme = SI (NB · VIDE
– Moyenne générale (c’est une estimation de m) : (B5:D8) < > 0 ; « Calcul impossible » ; B11/B10).
On pourrait ajouter divers tests, comme empêcher les calculs si le
∑i =1∑ j =1Z ij
I J
nombre de répétitions par séries est inférieur à 2. L’intérêt de cette
Z = disposition tabulaire et de ces vérifications paramétrées et de faciliter
I ×J l’ajout de nouvelles séries ou de nouvelles répétitions.
Ensuite, il faut calculer les différentes sommes de carrés. Il existe
Ensuite, pour calculer les variances inter-séries sB2 et intra-série
sous Excel® (ou OpenOffice) une fonction statistique nommée
(ou de répétabilité) sr2 qui permettront d’obtenir la variance de SOMME · CARRES · ECARTS qui va servir à ça. La cellule B14 contient
fidélité intermédiaire, il convient de diviser les SCE par les la formule = SOMME · CARRES · ECARTS (B5:D8) et permet de calculer
nombres de degrés de liberté appropriés. C’est à ce stade qu’on va la somme des carrés des écarts totaux, SCEt . Par ailleurs, en colonne G,
supposer que Z est distribuée selon une loi normale. on va entrer la formule = SOMME · CARRES · ECARTS (B5:D5) pour
La variance intra-série (ou de répétabilité) est alors égale à : obtenir la somme des carrés des écarts de la série 01. Elle est recopiée
sur les 4 lignes situées en-dessous. On peut alors obtenir la somme des
carrés résiduelle SCEr , en sommant ces sommes de carrés par série.
SCEr SCEr
sr2 = = Cette somme apparaît dans la cellule B13 sous la forme = SOMME
IJ − I I(J − 1) (G5:G10). La SCEB est calculée par différence dans la cellule B15.
▲
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A B C D F G H I
1 Niveau B
2 Valeur de référence 0.125
3 Données
4 Séries Répétition 1 Répétition 2 Répétition 3 ni SCEi
5 Jour (Série) 01 0.144 0.128 0.135 3 0.000128667
6 Jour (Série) 02 0.116 0.134 0.128 3 0.000168
7 Jour (Série) 03 0.122 0.120 0.132 3 8.26667E–05
8 Jour (Série) 04 0.121 0.130 0.134 3 8.86667E–05
9 Calculs intermédiaires Formules Excel®
10 Nombre de séries (I) 4 =NB(B5:B8)
11 Nombre de mesures (IJ) 12 =NB(B5:D8)
12 Nombre de répétitions (J) 3 =SI(F5*B10<>B11;"Calcul impossible";F5)
13 SCE résiduelle (SCEr) 0.000468 =SOMME(G5:G10)
14 SCE totale (SCEt) 0.000684667 =SOMME.CARRES.ECARTS(B5:D8)
15 SCE inter-séries (SCEB) 0.000216667 =B14–B13
16 Variance inter-séries s2B 4.57407E–06 =((B15/(B10–1))–B17)/B12
17 Variance de répétabilité (s2r) 0.0000585 =B13/(B11–B10)
18 Variance inter-séries (s2B) 4.57407E–06 =SI(B16<0;0;B16)
19 Variance de fidélité intermédiaire (s2F) 6.30741E–05 =SOMME(B17:B18)
20 Fidélité
21 Moyenne retrouvée 0.128666667 =MOYENNE(B5:D8)
22 Écart-type de répétabilité (sr) 0.007648529 =RACINE(B17)
23 Écart-type inter-séries (sB) 0.002138709 =RACINE(B18)
24 Écart-type de fidélité intermédiaire (sF) 0.007941919 =RACINE(B19)
Figure 17 – Feuille pour le calcul de la fidélité intermédiaire dans le cas d’un plan équilibré
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7.2.2 Cas du plan déséquilibré (Upper ). Par exemple, si µ est la « valeur vraie » de la moyenne, il
et données aberrantes s’exprime sous la forme :
Prob (L µ U ) = 1− α
On parle de plan déséquilibré lorsque toutes les séries n’ont pas
le même nombre de répétitions. Rappelons que l’indice i désigne L’intervalle de tolérance (β-IT), également appelé intervalle de
la série et j le numéro de la répétition. Si on note ni le nombre de prédiction, est de son côté l’intervalle dans lequel on est capable
répétitions, le nombre total de mesures dans ce cas devient : de prédire que se trouve, en moyenne, une proportion connue de
mesures. Il diffère donc de l’intervalle de confiance en ce qu’il
N = ∑i =1ni
I s’intéresse à la population totale et non pas à un paramètre. En
d’autres termes, l'intervalle de confiance caractérise le
Il va permettre de calculer le nombre effectif de mesures, noté comportement d’un paramètre tandis que le β-IT caractérise le
NE : comportement de l’ensemble des mesures.
∑i =1ni2
I Dans le contexte qui nous intéresse, pratiquement, il s’écrit sous
NE = N − la forme :
N Z ∓ k IT × S I T
Et corriger les équations de calcul de la variance de répétabilité : où Z désigne la moyenne des concentrations retrouvées, kIT un
facteur d’élargissement qui dépend de la valeur choisie de β et qui
SCEr rend compte de la proportion de futures mesures qui sera prédite
sr2 =
N −1 par le β-IT, sIT l’écart-type de l’intervalle de tolérance et sF
l’écart-type de fidélité intermédiaire déjà vu.
Et de la variance inter-séries :
Pour calculer l’écart-type de l’intervalle de tolérance, on utilise la
SECL formule suivante :
(I − 1) − sr2
I −1 1
sB2 = sIT = sF 1 +
NE IJB 2
Finalement, l’écart-type de fidélité intermédiaire n’est pas avec, les deux coefficients :
modifié :
A +1 s2
sF = sr2 + sB2 B= ; A= B
JA + 1 sr2
Une nouvelle feuille de calcul doit alors être préparée, pour tenir
Le facteur d’élargissement vaut :
compte de ces nouvelles formules.
Ces remarques soulèvent la question des données aberrantes. k IT = tddl ,1+ β
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• Calcul du t de Student avec un tableur • Le critère global d’acceptabilité étant basé sur l’exactitude, on
On voit aussi dans le tableau 11 qu’on obtient une valeur de ddl peut enfin régler les conflits entre la justesse et la fidélité. Les
qui n’est pas un nombre entier. Sous Excel ou Open Office, cela méthodologies classiques de validation traitent généralement
pose un problème car la fonction LOI · STUDENT · INVERSE séparément la justesse et la fidélité. Comme conséquence, on
arrondit automatiquement le nombre de degrés de liberté à l’entier peut déboucher sur des conclusions ambiguës si seulement
le plus proche. Ce qui n’est pas le cas si on utilise un logiciel l’un de ces deux critères est satisfaisant. Par contre, le profil
spécialisé, comme R. Cet arrondissage introduit un biais qui se d’exactitude permet de représenter simultanément, sur un
révèle important pour des valeurs de ddl inférieures à 20. On peut même graphique, ces deux critères (ou des combinaisons de
efficacement corriger ce biais par une simple interpolation linéaire ces critères).
entre les deux valeurs du t de Student, calculées avec les arrondis La validation des méthodes d’analyse s’inscrit dans la logique de
inférieure et supérieure de ddl. la mise en place des systèmes d’assurance qualité au laboratoire.
C’est pourquoi, dès les années 1990, des guides – normatifs ou
Exemple : c’est cette méthode qui est utilisée dans les cellules B34 réglementaires – ont été publiés pour aider les analystes à orga-
à B36 de la feuille de calcul illustrée par la figure 19 en utilisant les deux niser leurs études de validation. Après quelques années d’expé-
fonctions ARRONDI. · INF et ARRONDI. · SUP. Finalement, le détail de rience, il est possible d’identifier une série d’écueils et une série
ces calculs pour le niveau B, est fourni par la feuille de la figure 19. Une d’avancées liées à la validation des méthodes d’analyse.
feuille identique est préparée pour chaque niveau et les limites basse Écueils
et haute du β-IT sont ainsi obtenues pour l’ensemble des données.
• L’accent n’est pas assez mis sur le fait que la validation doit
On peut alors réunir tous ces résultats dans un tableau récapitu- intervenir lorsque la méthode est complètement mise au point.
latif, comme le tableau 9 du paragraphe 5.8 qui a servi à construire Trop d’analystes sont tentés, espérant ainsi gagner du temps,
le profil d’exactitude de la figure 12 et celui de la figure 13. de démarrer une validation alors qu’ils n’ont ni rédigé un
mode opératoire complet, ni étudié certaines matrices qu’ils
veulent inclure dans le domaine d’application de la méthode.
La conséquence est que la méthode peut être invalidée.
8. Conclusion • Une façon classique de démontrer qu’une méthode est valide
consiste à réaliser des tests d’hypothèse : tester qu’une
La méthodologie du profil d’exactitude a déjà connu un grand moyenne de répétitions n’est pas statistiquement différente de
nombre d’applications (voir la liste non exhaustive dans la partie la valeur de référence, tester qu’un écart-type de fidélité ne dif-
Pour en savoir plus). fère pas d’une valeur de référence, etc. Cette méthodologie
On peut tirer de ces exemples un certain nombre de conclusions. très classique soulève deux problèmes de fond :
• La grande généralité de cette approche. La liste est déjà longue – d’abord, ces tests d’hypothèse sont menés de façon
des méthodes qui ont été étudiées : chromatographie, spec- incomplète. Une conséquence immédiate est que plus une
troscopie, titrimétrie, gravimétrie, ELISA, PCR, microbiologie, méthode disperse les mesurages plus elle est facile à valider ;
physique, etc. – d’autre part, ces tests portent sur des statistiques comme des
moyennes ou des écarts-types. Or ce qu’attend un client, ce
• D’une façon très globale, si on prend la définition de la valida- n’est pas de savoir si une moyenne est « bonne », c’est qu’un
tion, la démarche proposée suit très exactement cette résultat soit « acceptable », ce qui n’est pas la même chose.
définition : 1) partir des objectifs à atteindre en termes de limites Les tests statistiques sont un peu comme un arbre qui cache
d’acceptabilité ; 2) collecter les preuves effectives grâce à des une forêt.
plans d’expériences ; 3) puis les examiner statistiquement et
graphiquement pour confirmer ou infirmer la validité. Avancées et tendances
• Le mode de calcul du profil niveau par niveau permet de • Les analystes ont fait de grands progrès pour améliorer la jus-
couvrir une très large gamme dynamique de concentrations. tesse des méthodes. Le développement rapide des matériaux
L’approche est donc applicable à des méthodes dont le de référence est la réponse à ce problème majeur. Divers gui-
domaine d’application peut comprendre plusieurs décades. Ce des ou normes ont aussi proposé des moyens pratiques et
point est important car, avec beaucoup d’autres procédures, on reconnus pour définir les valeurs de référence.
doit faire l’hypothèse – irréaliste – que la fidélité est constante • Pendant longtemps la normalisation d’une méthode revenait à
dans tout le domaine étudié. rédiger une procédure plus ou moins détaillée, assortie d’un
• On peut utiliser des modèles d’étalonnage variés et même non catalogue d’obligations de moyens. La tendance qui se fait
linéaires. En effet, l’hypothèse de linéarité de la fonction d’éta- jour consiste à ne plus fixer que des obligations de résultats. À
lonnage peut être totalement abandonnée. terme, l’idée sous-jacente est que n’importe quels moyens
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A B C D F G H
1 Niveau B
2 Valeur de référence 0.125
3 Données
4 Séries Répétition 1 Répétition 2 Répétition 3 ni SCEi
5 Jour (Série) 01 0.144 0.128 0.135 3 0.000128667
6 Jour (Série) 02 0.116 0.134 0.128 3 0.000168
7 Jour (Série) 03 0.122 0.120 0.132 3 8.26667E–05
8 Jour (Série) 04 0.121 0.130 0.134 3 8.86667E–05
9 Calculs intermédiaires Formules Excel®
10 Nombre de séries (I) 4 =NB(B5:B8)
11 Nombre de mesures (IJ) 12 =NB(B5:D8)
12 Nombre de répétitions (J) 3 =SI(F5*B10<>B11;"Calcul impossible";F5)
13 SCE résiduelle (SCEr) 0.000468 =SOMME(G5:G10)
14 SCE totale (SCEt) 0.000684667 =SOMME.CARRES.ECARTS(B5:D8)
15 SCE inter-séries (SCEB) 0.000216667 =B14–B13
16 Variance inter-séries s2B 4.57407E–06 =((B15/(B10–1))–B17)/B12
17 Variance de répétabilité (s2r) 0.0000585 =B13/(B11–B10)
18 Variance inter-séries (s2B) 4.57407E–06 =SI(B16<0;0;B16)
19 Variance de fidélité intermédiaire (s2F) 6.30741E–05 =SOMME(B17:B18)
20 Fidélité
21 Moyenne retrouvée 0.128666667 =MOYENNE(B5:D8)
22 Écart-type de répétabilité (sr) 0.007648529 =RACINE(B17)
23 Écart-type inter-séries (sB) 0.002138709 =RACINE(B18)
24 Écart-type de fidélité intermédiaire (sF) 0.007941919 =RACINE(B19)
25 Justesse
26 Biais (%) 0.029333333 =(B21/B2)–1
27 Intervalle de tolérance
28 Rapport des variances (R) 0.0781893 =B18/B17
29 Coefficient B2 0.873333333 =(B28+1)/(B12*B28+1)
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Figure 19 – Feuille de calcul modèle pour un des niveaux du plan de validation. La probabilité est saisie directement
instrumentaux ou analytiques pourront être mis en œuvre, culs, il faut absolument énoncer une conclusion claire sur la vali-
aussi longtemps que l’analyste sera capable de faire la preuve dité (ou non) de la méthode. On ne doit pas se contenter d’un
qu’il a atteint des prescriptions de performance fixées. Bien simple tableau de chiffres dont on laissera l’interprétation au seul
évidemment, c’est pour ce type d’approche que la méthode du auditeur. Bien sûr, en cas de non-validité, les causes doivent être
profil d’exactitude est bien adaptée. recherchées et les actions prises : soit abandonner la méthode,
On ne peut pas conclure sans évoquer les problèmes pratiques soit changer les objectifs, soit recommencer la mise au point. Tou-
d’organisation d’une étude de validation dans un laboratoire. On tes ces actions doivent être consignées et justifiées.
peut identifier une séquence de trois étapes. Dans un laboratoire possédant un système qualité, pour ne pas
avoir à réinventer à chaque fois ce qu’il faut faire, il est intéressant
• Préparation de l’étude : la décision de valider une méthode
d’incorporer la procédure de validation dans le système d’assurance
doit correspondre à une décision formelle : un document décri-
qualité. En complément, on peut élaborer des documents types et
vant les objectifs, le mode opératoire à valider et la procédure
définir un modèle de dossier de validation qui contiendra les comptes
de validation doit être préparé à l’avance. On nommera alors
rendus, les résultats des études expérimentales, les calculs et les
un(e) responsable qui coordonnera les travaux et réglera les
conclusions. Si le laboratoire possède un LIMS, il est judicieux de ras-
problèmes logistiques inhérents : calendrier des travaux, distri-
sembler les mesures de validation sous un code de projet unique.
bution des tâches entre opérateurs, choix et mise en réserve
des matériaux de travail, etc. Finalement, le développement de procédures et d’outils adaptés à
la validation des méthodes est en pleine évolution. Nous sommes
• Réalisation des essais : durant cette étape, le rôle du coordina- fermement convaincus du rôle central que joue le laboratoire au
teur est fondamental. Il doit effectuer un suivi et noter les sein de l’entreprise : en l’absence d’un système de mesure et de
déviations par rapport à ce qui avait été prévu. contrôle, toute activité de production est bloquée. La qualité des
• Interprétation des résultats : une fois tous les résultats d’essais résultats d’analyse est un point important, souvent sous-estimé, de
rassemblés, les divers calculs sont réalisés. À l’issue de ces cal- la qualité globale des entreprises.
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P
O
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Partie 5 : Méthodes alternatives pour la dé- Part IV : Examples. Journal of Pharmaceutical
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