Guia de Practicas de MG 1702

UNIVERSIDAD SIMON BOLIVAR
FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA

INGENIERÍA EN ALIMENTOS
PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA GENERAL
Índice
PRÁCTICA #1 Uso del microscopio compuesto y tinciones.
PRÁCTICA #2 Crecimiento en medio líquido y aislamiento de bacterias aerobias por la técnica de estría cruzada.
PRÁCTICA #3 Cuenta de colonias por las técnicas de vaciado en placa e inoculación en superficie.
PRÁCTICA #4 Aislamiento y cultivo de Hongos y Levaduras.
PRÁCTICA #5 Pruebas diagnósticas para poner de manifiesto el metabolismo de carbohidratos y proteínas con
propósitos de identificación microbiana.
PRÁCTICA #6 Respiración.
PRÁCTICA #7 Curvas de crecimiento microbiano.
PRÁCTICA #8 Efecto de la presión osmótica sobre la viabilidad y el crecimiento microbiano.
PRÁCTICA #9 Efecto de la temperatura de incubación sobre el crecimiento microbiano y determinación del punto
mortal y del tiempo térmico mortal
Práctica #10 Influencia del pH sobre el crecimiento microbiano.
Práctica #11 Efecto del pH, los metales y de los detergentes sobre la viabilidad de los microorganismos
Reglamento del laboratorio de Microbiología General
1. El alumno observará puntualidad para arribar al laboratorio, se le dará tolerancia de 10 minutos de la hora
fijada.
2. Llevar bata blanca y el material que se le indique en forma individual o por equipo.
3. No se permite comer, beber líquidos o fumar.
4. El cabello lo debe llevar corto o recogido.
5. No se permite platicar o moverse por el salón (asuntos no relacionados con la materia), ya que al trabajar con
gérmenes potencialmente patógenos, existen riesgos de contaminación.
6. Deberá asearse las manos con agua y jabón antes y después de trabajar en el laboratorio.
7. Al iniciar una práctica preparará el material y medios de cultivo que correspondan a su equipo.
8. Al finalizar la práctica el alumno esterilizará el material contaminado.
9. Los informes de prácticas se entregarán 8 días después de terminar la práctica.
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PRÁCTICA #1
Uso del microscopio compuesto y tinciones.
Objetivos
a) El alumno aprenderá a conocer las partes y funciones de los componentes del microscopio de luz visible.
b) El alumno aplicará técnicas de preparación y tinción simples y diferencial para la observación de
microorganismos.
c) El alumno efectuará varias técnicas de coloración selectiva, para observar algunas estructuras bacterianas.
Material Microscopio
Frasco con benzal Mechero Fisher
Frasco con cristal violeta Portaobjetos
Frasco con safranina Cubreobjetos
Frasco con alcohol acetona Papel higiénico
Frasco de lugol Marcador
Frasco con azul de algodón Masking tape
Frasco con azul de metileno Algodón
Frasco con azul de metileno de Loeffler Asa bacteriológica
Frasco con verde de malaquita 3 pipetas de 10 ml.
Tinta china Fuente de coloración
Mordente de Knaysi Tela suave y papel seda
Fucsina fenicada Aceite de inmersión
Verde de Malaquita Lápices de colores
Microorganismos:
MUESTRAS QUE OBTENGA EL ALUMNO
Metodología
a) Cuidado del microscopio
1. Transportar el microscopio tomándolo del brazo y de la base.
2. Colocar el microscopio en la mesa de trabajo, asegurándose que no haya vibraciones con ella.
3. Limpiar el microscopio en el orden siguiente:
a) Sistema mecánico, con un trapo suave que no deje pelusa.
b) Sistema óptico, el ocular, objetivos y condensador con papel especial para limpiar.
b) Iluminación del campo visual

1. Conectar y prender la lámpara.
2. Abrir y cerrar el diafragma.
3. Subir o bajar el condensador hasta observar a través del ocular un disco luminoso uniforme.
4. Colocar la preparación en la platina sujetándola por las pinzas.
c) Enfoque de la preparación
1. Enfocar su preparación con el objetivo de menor aumento, haciendo uso del tornillo macrométrico.
2. Repetir el enfoque con el objetivo de mayor aumento haciendo uso del tornillo macrométrico.
3. Poner una gota de aceite de inmersión sobre su preparación (sin tocarla con el gotero) y repetir el enfoque
utilizando el tornillo micrométrico.
4. Examinar las preparaciones proporcionadas.
5. Desconectar, limpiar y guardar el microscopio en su lugar.
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d) Frotis a partir en un cultivo sólido

1. Marcar en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados.
2. Colocar con el asa una pequeña gota de agua, extendiéndola para formar una película delgada de
aproximadamente un centímetro de diámetro en el centro del portaobjetos.
3. Tomar con el asa estéril un fragmento de colonia y hacer una suspensión homogénea en la gota,
extendiéndola para dejar una película delgada y uniforme.
4. Fijar el frotis al calor, calentando la parte posterior del portaobjetos.
e) Frotis a partir de un cultivo líquido

1. Tomar con el asa estéril una gota de cultivo y colocarla en el centro del portaobjetos, extendiéndola para
formar una película.
2. Dejar secar al aire
3. Fijar al calor
f) Tinción simple de los frotis

1. colocar los portaobjetos de los frotis sobre un puente de coloración.
2. Cubrir el frotis con unas gotas del colorante y dejarlo por un minuto.
3. Tomar el portaobjetos por un extremo y escurrir el colorante.
4. Lavar el exceso de colorante con un chorro de agua.
5. Dejara secar al aire.
6. Examinar las preparaciones con el objetivo de inmersión.
g) Tinción de Hongos
1. Colocar una gota de azul de algodón o azul de lactofenol en el centro de un portaobjetos limpio.
2. Colocar una pequeña porción de la colonia que se desea observar.
3. Poner un cubreobjetos y examinar la preparación al microscopio a seco débil y fuerte,
4. Observar el micelio vegetativo, revisando presencia o ausencia de septos, diámetro de las hifas y color de las
hifas.
5. Observar las características del micelio reproductor, estructuras de reproducción sexual y asexual.
h) Técnica de tinción de Gram

1. Hacer un frotis con cristal violeta y dejarlo actuar por un minuto, escurrir el colorante y lavar agua.
2. Colocar una pequeña porción de lugol y dejarlo actuar por un minuto, escurrir el colorante y lavar con agua.
3. Adicionar alcohol acetona por 30 segundos, escurrir el colorante y lavar con agua.
4. Adicionar safranina por 15 segundos, escurrir el colorante y lavar con agua.
5. Observar las preparaciones con el objetivo de inmersión
i) Observación de la cápsula
1. Poner con el asa una gota pequeña de tinta china en el centro de un portaobjetos, poner una gota pequeña de
agua a un lado, posteriormente, mezclar.
2. Tomar con el asa un poco del crecimiento del microorganismo hacer una suspensión en la gota, sin extender la
mezcla.
3. Colocar un cubreobjetos sobre la suspensión evitando que se formen burbujas.
4. Observar inmediatamente la preparación al microscopio, con el objetivo seco débil e inmersión, la cápsula se
observa como una zona luminosa alrededor de la bacteria, en un campo oscuro.
5. Desechar la preparación en un recipiente de benzal.
j) Observación de la pared celular: Tinción de Knaysi

1. Hacer un frotis del microorganismo y fijarlo al calor.
2. Cubrir el frotis con el mordente de Knaysi y dejarlo actuar 10 min.
3. Lavar la preparación con agua.
4. Colocar con el asa una gota de Fascina sobre la preparación.
5. Deslizar un cubreobjetos sobre la preparación y observar inmediatamente con el objetivo de inmersión, la pared
se observa de color rosa o rojo tenue.
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k)Tinción de esporas por la técnica de Sheaffer y Fulton

1. Hacer un frotis del microorganismo de la forma usual.
2. Cubrir todo el portaobjetos con verde de malaquita, calentar suavemente la preparación a emisión de vapores por
5 min. (El colorante no debe hervir ni secarse).
3. Lavar la preparación con abundante cantidad de agua
4. Cubrir la preparación con safranina y dejarla actuar durante 1 minuto.
5. Lavar la preparación con agua y dejar secar al aire.
6. Observar con el objetivo de inmersión. Las esporas se observan de color verde y las bacterias de color rosa.
l) Tinción de Loeffler por gránulos metacromáticos

1. Hacer un frotis con el microorganismo de la forma usual.
2. Cubrir el frotis con azul de metileno Loeffler, dejarlo actuar durante 1 min.
3. Lavar con agua y dejar secar al aire
4. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión. Los gránulos se observan de color rojo, violeta o azul intenso
y el citoplasma color azul claro.
Reporte
La discusión y conclusiones se realizan con el equipo al finalizar la práctica.
Cuestionario
1 ¿Por qué la cápsula se observa siempre sin teñir?
2 Citar tres géneros de microorganismos que tengan cápsula
3. ¿Cuál es la naturaleza, localización y función de la cápsula?
4. ¿Cuál es la naturaleza y función de la pared celular?
5 Mencione que tinción se aplica para poner de manifiesto ácidos nucleicos.
6. ¿Cuál es la localización, naturaleza química y función de la endosporas?
7 ¿A qué se le conoce con el nombre de mordente?
8. ¿Qué tipo de colorantes se utiliza para teñir grasas?
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PRÁCTICA #2
Crecimiento en medio líquido y aislamiento de bacterias aerobias por la técnica de estría cruzada
Objetivos
El alumno aplicará técnicas para esterilización de material de vidrio y medios de cultivo.
El alumno aislará colonias por medio de la técnica de la estría cruzada y describirá las características de la morfología
colonial de los aislamientos realizados. Así como el crecimiento de las cepas en los medios líquidos proporcionados.
Material Cajas con agar nutritivo

Asa bacteriológica Cajas con agar KF estreptococíco
Mechero Fisher Cajas con agar de papa y dextrosa
Tubos de 16/150 con tapón de rosca, conteniendo Cajas con agar Baind Parker
5ml. de caldo nutritivo. Cajas con gelosa sangre.
Cajas con agar EMB
Metodología:
Limpiar todo el material de vidriería, evitando que queden residuos de jabón en el mismo.
Colocar en las pipetas boquillas de algodón de aproximadamente 1.5mm. De longitud, ni muy flojo ni muy compacto,
quemar al mechero el exceso que sobresalga; envolver con una tira de papel, empezando por la punta a todo lo largo,
enrollar sobre sí mismo un sobrante de unos 3cm. toda la pipeta deberá quedar totalmente cubierta, con el papel
ajustado y asegurándose que no hay perforación en la punta.
Tapar los tubos con tapón de algodón moldeado con pinzas a un diámetro que permita su ajuste a la boca del tubo.
Cubrir el tapón de algodón con un gorro de papel.
Preparar los medios de cultivo y la solución salina al 0.85 con base a las instrucciones dadas por el maestro.
Material y Reactivos
Material Agar nutritivo

Asa bacteriológica Agar KF estreptococíco
Mechero Fisher Agar de papa y dextrosa
Tubos de 16/150 con tapón de rosca, conteniendo Agar Baind Parker
a) 9ml. de agua peptonada Agar EMB
b) 10ml. de caldo BHI
Matraz Erlenmeyer
Cajas de Petri
Preparación del material

Esterilizar el material preparado a 121°C de 15 a 25 min. en las ollas de presión.
Concluida la esterilización, retirar el material de la olla, dejarlo enfriar vaciar en cajas de petri en caso necesario,
guardar los medios de cultivo en refrigeración y el material de vidrio y plástico al abrigo del polvo.
El material preparado se usará en las prácticas siguientes.
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Aislamiento por el método de la estría cruzada
1.Marcar la tapa de la caja con los datos correspondientes al N° del equipo, especie microbiana utilizada, fecha y
tipo de muestra.
2.Esterilizar el asa bacteriológica por incineración.
3.Dejar enfriar el asa.
4.Tomar con el asa una muestra del tubo con el crecimiento microbiano, y colocarlo en uno de los extremos del
agar contenido en la caja, haciendo estrías continuas hacia el centro de la caja (realizar de 3 a 4 estrías). (1)
5.esterilizar el asa nuevamente y enfriarla en el borde de la caja.
6.Hacer una segunda serie de estrías, tocando la porción final de la anterior. (2)
7.Esterilizar el asa nuevamente.
8.Hacer una tercera serie de estrías cono en el caso anterior. (3)
9.Esterilizar el asa nuevamente.
10. Con el asa hacer una serie de tres estrías tocando el extremo de las anteriores y sacar el trazo hacia la parte
central del agar haciendo aproximadamente dos a tres estrías muy abiertas. (4)
11. Incubar las cajas de petri a 37°C ó a 28°C (de acuerdo a las indicaciones del maestro) durante 24 a 48 horas.
Para trabajar revisa los esquemas.
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Morfología colonial
Describir la morfología colonial correspondiente a las especies microbianas proporcionadas en base a las
características marcadas en la introducción.
Crecimiento en medio líquido

Marcar correctamente un tubo con caldo nutritivo y sembrar con el asa el cultivo correspondiente.
Incubar los tubos a 28 0 37°C durante 24 a 48 Hrs., y describir el tipo de crecimiento desarrollado.
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Informe
1. Describir la morfología de las colonias aisladas a partir de las muestras proporcionadas en el cuadro siguiente:
CEPAS AISLADAS
Características
Tamaño en mm
Color
Forma
Elevación
Superficie
Aspecto
Bordes
Luz reflejada
Luz transmitida
Consistencia
Medio de Cultivo
Especie Microbiana
2. Describir el tipo de crecimiento que se presenta en los tubos del caldo nutritivo.
3. La discusión y conclusiones se realizan con el grupo al finalizar la práctica.
Toma en cuenta que:

Una colonia microbiana, está constituida por individuos de la misma especie, provenientes generalmente de una sola
célula o en algunos casos de un grupo de ellas, a esta agrupación se le conoce como unidad formadora de colonias
UFC.
Las características consideradas para la descripción de la morfología colonial de las bacterias son:
Tamaño: se da en milímetros y puede variar desde colonias puntiformes muy pequeñas, hasta aquellas que llegan a
medir 10mm, o más. (Algunas especies pueden extenderse en toda la superficie del agar.)
Color: Pueden formarse de variados colores, en las especies que producen pigmentos naturales o desarrollan color
por reacciones químicas con el medio de cultivo.
Forma: Puntiforme, circular o irregulares.
Bordes: pueden ser enteros o mostrar irregularidades como lóbulos, filamentos, proyecciones como dientes de sierra
o enrollados.
Elevación: Planas, convexas, pulvinadas, embonadas y umbilicadas.
Superficie: Puede ser lisa, rugosa o granulada.
Aspecto: Húmedo o seco.
Luz reflejada: brillante o Maté
Luz transmitida: Transparente, traslúcida u opaca
Consistencia: Suave: butirosa, mucoide o blanda, seca y dura; (debe de ser la última característica en describirse ya
que se tiene que tocar la colonia con el asa.)
Producción de pigmento: Algunas bacterias producen pigmento que difunde en el medio de cultivo.
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Estas características constituyen una guía muy útil en el reconocimiento de los principales grupos
microbianos.
Forma:
Puntiforme Circular Filamentos Amiboide Rizoide Fusiforme
Elevación:
Plana Elevada Convexa Pulvinada Umbonada Crateriforme o umbilicada
Borde:
Entero Ondulado Lobulado Dentado Filamentoso Enrollado Rizoide
Crecimiento en un medio líquido
Homogéneo Floculento Anillo Membrana Película
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Cuestionario
1.¿Con qué finalidad se le pone a las pipetas un filtro de algodón?
2.Explique las condiciones de esterilización por calor húmedo.
3.Explique el mecanismo de acción del calor húmedo.
4.Explique el mecanismo de esterilización por calor seco.
5.¿Con qué método se esterilizaría el siguiente material?:
a) cajas de petri de plástico
b) Cajas de petri de vidrio
c) Solución de vitaminas
d) Solución de lactosa
e) Leche descremada
f) Talco
g) Aceite mineral
h) Instrumental de cirugía
i) Solución de histidina
6.¿Cómo esterilizaría un cubículo para siembra?
7.¿Qué es una UFC?
8.Existe relación entre la forma de crecimiento de las bacterias en medio líquido y la tensión superficial del medio
y los requerimientos de oxígeno del medio.
9.¿Qué es el fenómeno de swarming?, diga el nombre de un microorganismo que lo presente
10. El color verde metálico observado en el medio de EMB, ¿a que se debe?
11. Clasifique a que tipos de medios de cultivo pertenecen los utilizados en la práctica.
12. Investigue la formulación de los medios de cultivo empleados en la práctica.
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PRÁCTICA #3
Cuenta de colonias por las técnicas de vaciado en placa e inoculación en superficie.
Objetivo
El aluminio aislará bacterias aerobias por las técnicas de vaciado en placa e inoculación en superficie.
Material
Botella con tapón de rosca conteniendo 90ml. de agua peptonada
Tubos de 16/150 con tapón de rosca conteniendo 9ml. de agua peptonada
Caja de petri estériles
Cajas de petri conteniendo en forma individual 15ml. de agar nutritivo
Pipetas de 1 y 2 ml. estériles
Pipetas de 10ml. estériles conteniendo 130ml. de agar cerebro corazón, con tapón de algodón y papel (el agar fundido
y enfriado a 45°C)
Varilla de vidrio para siembra
Tapa de caja petri
Frasco con alcohol
Mechero Fisher
Baño maría a 45°C
Método
Técnica de vaciado en placa
1.Homogenizar el cultivo agitando vigorosamente la muestra.

2.Transferir 10ml. del cultivo a la botella conteniendo 90ml. de agua peptonada, agitar y transferir 1ml. a un tubo
conteniendo 9ml. de agua peptonada, agitar y transferir 1ml. a otro tubo conteniendo 9ml. de agua peptonada.
3.Agitar el contenido del tubo y transferir 1ml. a otro tubo como en el caso anterior (Dilución 10 -3), y transferir otro
mililitro en caso de realizar la dilución 10-4 y así sucesivamente para otras diluciones.
4.Proceder de igual manera para realizar la dilución 10 -3.
5.Al concluir cada dilución inocular 1ml. en una caja de petri, previamente marcada, indicando la dilución
correspondiente, antes de preparar la siguiente dilución.,
6.Agregar a cada caja 15ml. (en forma aproximada) de agar nutritivo, fundido y enfriado a 45°C.
7.Incorporar el inóculo al medio por rotación de la caja sobre la mesa, procurando levantar ligeramente la tapa.
8.Dejar solidificar las cajas.
9.Incubar las cajas a 35°C por 48 horas.
10. Contar todas las colonias en aquellas cajas que contengan menos de 300 y el resultado multiplicarlo por la
inversa de la dilución.
Cuenta de bacterias por inoculación en superficie
Se usa para obtener la cantidad de colonias por ml., esta técnica es ampliamente aceptada en los países europeos y
de 150 organismos internacionales dedicados a la estandarización de métodos de análisis.
Se debe poner especial cuidado en la preparación de las placas, la superficie de la placa debe encontrarse libre de
humedad excesiva para evitar o limitar la confluencia y extensión de las colonias.
Para ambas técnicas es importante recalcar que se debe cambiar de pipeta al efectuar cada dilución o introducir la
pipeta usada en la envoltura, original.
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Técnica de inoculación en superficie
1.A partir de las 5 diluciones que se hicieron anteriormente se siembran 5 cajas de petri conteniendo agar
nutritivo, adicionando 0.1ml. de cada dilución en el contorno de la placa correspondiente.
2.Introducir en alcohol la varilla de vidrio y flamearla, dejarla enfriar en un extremo de la caja.
3.Extender con la varilla el inóculo en toda la superficie de la placa pasando la varilla repetidas veces. Utilizar la
varilla flameada para cada dilución.
4.Dejar secar la superficie de las cajas, aproximadamente 15 min.
5.Invertir e introducir a 37°C por 48 Hrs., en el caso de levaduras, incubar a 28°C 24 Hrs. entre 30 a 300.
6.Seleccionar las cajas que tengan colonias para el conteo.
7.Multiplicar la cuenta por 10 y por la inversa de la dilución, informar la cantidad de UFC por ml.
Informe
1.Informar la cantidad de unidades formadoras de colonias por ml. obtenidas por ambas técnicas; en base a los
resultados obtenidos. Indicar que técnica es más precisa.
Cuestionario
1. Explicar las ventajas y desventajas de la técnica de vaciado en placa.
2. Explicar las ventajas y desventajas de la técnica por inoculación en superficie.
3. Discuta en base al número de colonias que encontraron en cada una de las cajas, si estuvo bien desarrollada la
técnica.
4. Ud. Desea conocer el número de bacterias por gramo de una muestra de pimienta molida, por lo que realiza la
siguiente serie de diluciones decimales de 10 -1 a 10-8, siembra 0.1ml. en cajas por la técnica de inoculación en
superficie y obtiene los siguientes resultados
Dilución Cuenta microbiana

10-1 Incontable
10-2 Incontable
10-3 Incontable
10-4 Incontable
10-5 325
10-6 30
10-7 4
10-8 Sin crecimiento
5. ¿Qué dilución utilizará para conocer el número de células por gramo de pimienta y por que?
6. ¿Cuál es el número de bacterias por gramo de pimienta?
7. Indique los cálculos a realizar y sus resultados.
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PRÁCTICA #4
Aislamiento y cultivo de Hongos y Levaduras
Objetivo
El alumno aislará e identificará a los hongos de acuerdo a su morfología colonial.
Muestra
Muestra de suelo
Muestra de verdura contaminada o pulque
Muestra de pimiento en polvo u orégano en polvo
Muestra de harina de maíz
Muestra de fruta (Uvas)
Muestra de tortilla en crecimiento de hongos
Muestra de chile en polvo
Material
Frasco con tapón de rosca, conteniendo 90ml. de agua Alcohol

peptonada. Asa de microbiología
Tubos con 9ml. de agua peptonada Bisturí y pinzas
Matraz de 250ml. conteniendo 130ml. de agar papa Puentes de coloración
dextrosa adicionando con 1ml. de una solución de ácido Barniz de uñas transparentes
tartárico al 10%. Azul de algodón lactofenol
9 cajas de petri estériles Glicerol al 10%
Pipetas de 2ml. estériles Pipeta Pasteur con bulbo de hule
1 mechero Fisher Formaldehído al 10%
3 cajas de petri conteniendo 15ml. del medio agar papa y Algodón
dextrosa Jerga
Portaobjetos Guantes de hule desechables
Cubreobjetos 1 balanza granataria
Varilla de vidrio acodada Charolas para pesar
Método
Aislamiento por la técnica de vaciado en placa
1. Tomar 10 gramos de la muestra e inocularla en la botella conteniendo 90ml. de agua peptonada, agitar y realizar
una serie de 5 diluciones decimales de
10-1 a 10-5.
2. Transferir de cada una de las diluciones 1ml. a cada una de las 5 cajas para el recuento de hongos. (Diluciones de
10-1 a 10-5).
3. A la vez transferir 1ml. de las primeras dos diluciones (excepto el pulque que incluirá una dilución más) 10 -1 y 10-2, a
cada una de las cajas de petri.
4. Incubar la serie de las 5 primeras cajas a 28°C para el desarrollo de hongos. Marcándolas adecuadamente.
5. Revisar estas cajas a los tres días y el no tienen micelio reproductor o colonias grandes dejarlas dos días más.
6. Incubar la serie de dos o tres cajas a 35°C durante 24 a 48 Hrs. para el crecimiento de levaduras.
7. Descripción de la morfología colonial de los hongos tomando en cuenta las características siguientes:
a. Tamaño en cm.
b. Aspecto algodonoso, pulverulento, aterciopelado o granuloso-
c. Color del micelio vegetativo.
d. Producción de pigmento difusible.
e. Color del reverso de la colonia.
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8. Descripción de la morfología microscópica:

a. Colocar una gota de azul de lactofenol en el centro de un portaobjeto limpio.
b. Tomar una pequeña porción de la colonia y colocarla en la gota sin extenderla.
c. Poner un cubreobjetos y examinar al microscopio con los objetivos de seco débil y fuerte.
d. Observar las características del micelio vegetativo, diámetro de las hifas y que sea septado o
cenocítico.
e. Colocar las hifas: hialino o pigmentado
f. Tapar la caja e incubarla a 28°C 48 a 72 horas, con la tapa hacia arriba.
g. Observar las características del micelio reproductor tipo de esporas.
Comparar esquemas.
9. Microcultivo:
a. Con un bisturí cortar cuadritos de 1.5 cm2 de medio agar papa dextrosa.
b. Con ayuda de las pinzas estériles colocar el cuadrito del medio sobre el portaobjetos colocando sobre
la varilla en v en la caja.
c. Con el asa doblada en ángulo recto inocular el hongo en los cuatro costados del cuadrito.
d. Colocar el cubreobjetos estéril sobre el agar.
e. Agregar glicerol al 10% a la caja sin mojar la preparación.
f. Tapar la caja e incubarla a 28°C 48 a 72 Hrs. con la tapa hacia arriba.
g. Extraer el glicerol con pipeta Pasteur y desecharlo en un tubo de ensaye y esterilizarlo.
h. Agregar formaldehído al 10% y dejarlo en la caja 2 Hrs.
i. Eliminar el formaldehído usando una pipeta Pasteur.
j. Desprender con cuidado el portaobjetos, adicionarle una gota de azul de lactofenol y colocar un
cubreobjetos limpio. Sellar la preparación con barniz de uñas.
k. Observar la preparación seco débil y fuerte.
l. El cubreobjeto sucio colocarlo sobre un portaobjetos limpio con una gota de azul de lactofenol y
observar al microscopio.
TIPOS DE MICELIOS:
Hifa cenocítica Hifa septada mononucleada Hifa septada polinucleada
TIPOS DE ESPORAS ASEXUALES:
Artrosporas Bacidiosporas Clamidosporas
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Informe
1. Indicar el número de colonias de hongos y levaduras obtenidas por la técnica de vaciado en placa, ( indicando los
resultados por gramo o milímetro según sea el caso).
2.Anotar la morfología colonial de las levaduras, tomando como base para la descripción de las características
aplicadas para el caso de las bacterias. Forma, tamaño etc.
3.Anotar la morfología colonial correspondiente a los hongos en un cuadrado tomando las siguientes características:
Tamaño, aspecto, color del reverso de la colonia, y del frente, pigmento difusible, color del micelio vegetativo, color del
micelio aéreo, descripción de las esporas asexuales, si se pueden identificar a que tipo de hongo pertenece.
4.Describir la morfología microscópica a partir de microcultivo: Tomar en cuenta las mismas características que en el
caso anterior.
5.Informar la morfología microscópica en tablas.

6.Hacer esquemas a colores de las observaciones microscópicas realizadas.
7.La discusión y conclusiones se realizan con el grupo al finalizar la práctica.
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PRÁCTICA #5
Pruebas diagnósticas para poner de manifiesto el metabolismo de carbohidratos y proteínas con propósitos de
identificación microbiana
Material
1. Cajas conteniendo gelosa almidón
2. Tubos de ensayo de 10/100 con caldo base rojo de fenol y campana de Dirham, conteniendo glucosa,
sacarosa y manitol.
3. Tubos de ensayo de 10/100 mm con medio de TSI.
4. Tubos de ensayo de 10/100 mm con medio de citrato de Simmons.
5. Tubos de ensayo de 10/100 mm con caldo urea.
6. Tubos de ensayo de 10/100 mm con RMVP.
7. Tubos de ensayo de 10/100 mm con caldo malonato.
8. Tubos de ensayo de 10/100 mm con gelatina nutritiva.
9. Tubos de ensayo de 10/100 mm con medio LIA.
10. Tubos de ensayo de 10/100 mm con medio SIM.
11. Tubos de ensayo de 10/100 mm con medio MIO.
12. Reactivo de Kovacs o Erlich.
13. Solución de lugol.
14. Solución de rojo de metilo.
15. Alfa naftol.
16. KOH al 40%.
Métodos
Digestión de polisacáridos Bacillus subtilis

1. En una caja con gelosa almidón sembrar por estría la cepa de Bacillus Pubtilius proporcionada.
2. Incubar a 37°C por 24-48 h.
3. Añadir unas gotas de solución de lugol alrededor del crecimiento y en la zona donde no lo haya; comparar.
Interpretación:
Digestión de almidón positiva = aparición de un halo claro alrededor de la colonia.
Digestión de azúcares por fermentación en tubos de Durham

1. Inocular los tubos que contienen glucosa, sacarosa y manitol con la cepa proporcionada.
2. Incubar a 37°C por 24 h.
Interpretación:
Producción de ácido y gas = vire del indicador a color amarillo y presencia de burbujas en los tubos.
Fermentación de azúcares y producción de sulfhídrico en el medio TSI.

1. Inocular el medio TSI por picadura y en la superficie del tubo con el medio TSI.
Interpretación:
Fermentación de la glucosa = vire del indicador a color amarillo en el fondo del tubo.
Producción de H2S = ennegrecimiento del tubo.
Producción de gas = formación de burbujas en el medio de cultivo.
Fermentación de azúcares. Prueba de Voges-Proskauer.

1. Inocular el tubo de caldo VP.
3. Adicionar a los cultivos 6 gotas del reactivo de alfa naftol con unos cristales de creatina y dos gotas de KOH.
4. Agitar cada tubo y dejar en reposo durante 30 min a 4 h.
Interpretación:
Prueba positiva = color rojo con la presencia de acetil metil carbonil.
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Utilización de ácidos orgánicos citrato y malonato

1. Sembrar los tubos con las cepas proporcionadas.
Interpretación:
Alcalinización del medio = vire del indicador azul de bromotimol de verde a azul.
Digestión de la gelatina
1. Inocular un tubo con gelatina por picadura y utilizando un asa recta.
3. Introducir los tubos al congelador por 10 min.
Interpretación:
Digestión de la gelatina = licuefacción positiva
Metabolismo de aminoácidos en medio de SIM. Producción de indol y H 2S

1. Sembrar por picadura los tubos que contienen SIM.
3. Adicionar una gota del reactivo de Kovacs.
Interpretación:
Producción de indol = color rojo en la superficie.
Producción de sulfhídrico = coloración negra en el tubo.
Acción sobre la lisina

1. Inocular en la superficie y por picadura el medio LIA y el de MIO.
Interpretación:
Descarboxilación positiva = color púrpura en el fondo del tubo.
Descarboxilación negativa = color amarillo en el fondo del tubo.
Desaminación positiva = color naranja en la superficie del tubo.
Producción de sulfhídrico = ennegrecimiento del medio.
Informe
1.Consultar los resultados en las tablas de de identificación bioquímica para la identificación de la bacterias
en estudio.
2.Concluir en base a los resultados indicando la importancia de las cepas.
3.La discusión y conclusiones se realizan con el grupo al finalizar la práctica.
16
PRÁCTICA #6
Respiración
Objetivo
El alumno utilizará algunas pruebas para poner de manifiesto los mecanismos de respiración en las bacterias.
Material
1. Tubos de ensayo de 10/100 mm con tapón de rosca conteniendo 9 ml de leche tornasolada estéril.
2. Tubos de ensayo de 10/100 mm con caldo nitrato.
3. Cajas de gelosa almidón.
4. Cajas de agar BHI.
5. Pipetas de 1 ml estériles.
6. Reactivo de azul de metileno para la prueba de reductasas.
7. Reactivo de resarzurina para la prueba de reductasas.
8. Reactivo de ácido sulfanílico.
9. Reactivo de alfa naftilamina.
10. Agua oxigenada al 3%.
11. Reactivo de oxidasa (N dimetil parafenilendiamina).
12. Tubos con 10 ml de leche pasteurizada y de leche sin pasteurizar (bronca).
13. Baño María a 37ºC.
Métodos
a. En un tubo de 16/150 con tapón de rosca estéril, poner 10 ml de leche cruda y 0.25 ml de azul de metileno.
Homogenizar el contenido por inversión del tubo.
b. En un tubo de 16/150 con tapón de rosca, poner 10 ml de leche cruda o leche pasteurizada con 0.01 ml de
resarzurina. Homogenizar el contenido por inversión del tubo.
1. Incubar los tubos en un baño maría a 37ºC.

2. Revisar los tubos cada 15 min hasta que ocurra la decoloración en las ¾ partes del tubo.
3. Ambos colorantes actúan como aceptores artificiales de electrones, los cuales al reducirse pasan a su forma
leuco. El tiempo para la reducción es directamente proporcional a la actividad metabólica de los
microorganismos.
Reducción de nitratos a nitritos

1. Sembrar la cepa de Escherichia Coli en caldo nitrato.
3. Determinar la presencia de nitritos, añadiendo a cada tubo 3 gotas de alfa naftilamina y 3 gotas de ácido
sulfanílico.
Algunas bacterias pueden respirar anaeróbicamente si los nitratos están presentes y la reducción puede detectarse
por la aparición de un color rojo ladrillo debido a la formación de un compuesto diazóico.
Prueba de citocromo oxidasa

1. Sembrar la cepa de pseudomonas aeruginosa en una caja de gelosa simple con una estría.
3. Determinar la presencia de citocromo oxidasa cubriendo el crecimiento con 2 gotas del reactivo de oxidasa
recién preparado.
El sistema citocromo oxidasa por lo general sólo se encuentra en organismos aerobios y los hace producir y utilizar
el O2 como aceptor final de electrones y producir agua oxigenada.
Producción de catalasa
1. Sembrar en una caja de agar BHI las cepas de Staphylococcus Aureus haciendo una estría abierta.
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3. Determinar la presencia de catalasa agregando unas gotas de agua oxigenada sobre el crecimiento.
La mayoría de los organismos aerobios y anaerobios facultativos poseen la enzima catalasa que descompone el
agua oxigenada en oxígeno y agua, evitando así su acumulación que provoca la muerte.
Interpretación:
Prueba positiva = formación de burbujas de hidrógeno.
Informe
1. Anote en un cuadro los resultados obtenidos.
2. Explique el fundamento de las pruebas utilizadas en la práctica.
3. Mencione tres ejemplos de microorganismos (género y especie) incapaces de producir catalasa.
4. Cite dos ejemplos de microorganismos diferentes a los usados en la práctica que produzcan citocromo
oxidasa.
18
PRÁCTICA #7
Curvas de crecimiento microbiano
Objetivo
El alumno utilizará dos métodos para evaluar el crecimiento de los microorganismos.
Material
1. Cajas de petri con agar BHI.
2. Asa bacteriológica.
3. Baño María con agitación.
4. Tubos de 16/150 mm conteniendo 9 ml de agua peptonada.
5. Matraz Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 100 ml de agar BHI.
6. Botellas con tapón de rosca conteniendo 90 ml de agua peptonada.
7. Cajas de petri estériles.
8. Pipetas de 2 y 10 ml estériles.
9. Matraces Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 150 ml de agar papa y dextrosa.
10. Mechero de Fisher.
11. Algodón.
12. Frasco con benzal.
13. Cepas: E. Coli y Aspergillus sp.
Métodos
Inocular un matraz Erlenmeyer de 500 ml conteniendo 250 ml de caldo BHI con una suspensión de E. Coli con una
absorbancia de 0.1. Incubar en Baño María con agitación a 37º C durante 9 h. y cada hora efectuar cuantas viables
siguiendo el procedimiento a continuación:
1. Marcar las cajas con los tiempos y diluciones y posteriormente sembrar las diluciones por la técnica de
vaciado en placa.
2. Dejar solidificar el agar e incubar a 37º C de 24-48 h.
3. Realizar las cuentas visibles y viables calculando para cada tiempo las UFC/ ml.
4. Trazar una gráfica del logaritmo de número de bacterias contra tiempo.
Crecimiento radial de hongos

1. Sembrar con una cruz las esporas de hongos en agar BHI.
2. Incubar a 28º C por 5 días.
3. Medir el diámetro de la colonia cada 24 h.
Evitar mover las cajas de los hongos para no dispersar las esporas.
Informe
1. Informar la curva de crecimiento efectuada, colocando en el eje de las abscisas el tiempo de incubación y en
el de las ordenadas el log 10 del número de bacterias.
2. Hacer una gráfica con los resultados del crecimiento radial de los hongos, colocando el tiempo de incubación
en el eje de las abscias y el crecimiento en centímetros en las ordenadas.
3. Calcular el tiempo de generación y número de generación por hora.
4. Graficar el tiempo de incubación en las abscisas y la absorbancia en las ordenadas.
Cuestionario
1. Explique otros métodos que conozca para determinar el crecimiento de las bacterias.
2. ¿Qué aplicaciones prácticas tiene el determinar la curva de crecimiento microbiana?
3. ¿Qué técnicas se utilizan para determinar el crecimiento de las levaduras?
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PRÁCTICA #8
Efecto de la presión osmótica sobre la viabilidad y el crecimiento microbiano
Objetivo
El alumno observará el efecto de la presión osmótica que ejerce el cloruro de sodio y la sacarosa sobre el crecimiento
microbiano.
Material
1. 6 tubos de 16/150 conteniendo caldo nutritivo y extracto de levadura al 1% adicionando en cada uno 0%, 3%,
5%, 7%, 9% y 12% de cloruro de sodio (5 ml).
2. 7 tubos de 16/150 conteniendo caldo nutritivo y extracto de levadura adicionados de sacarosa al 0%, 5%,
10%, 15%, 20%, 30% y 50% (5 ml).
3. 3 pipetas de 1 ml.
4. 6 tubos conteniendo miel a concentración normal al 90%, 60%, 40%, 20% y 10%
Métodos
Efecto del cloruro de sodio

1. Colocar en una gradilla los seis tubos con caldo y sacarosa a diferentes concentraciones.
2. Inocular cada uno de ellos con 1 ml de la suspensión proporcionada.
3. Incubar los tubos a 37º C o a 28º C de acuerdo a las indicciones del maestro.
4. Homogenizar los cultivos y comparar la turbidez anotando los resultados.
Crecimiento en miel o sacarosa de microorganismos osmofílicos

1. Colocar en una gradilla la serie de seis tubos con miel o sacarosa a distintas concentraciones.
2. Inocular a cada uno de ellos con 1 ml de la suspensión proporcionada.
3. Incluir los tubos a 37º C o a temperatura ambiente de acuerdo a las iniciaciones del profesor.
4. Revisar el crecimiento a las 48, 72 y 96 h a 37º C y de 5 a 10 días a temperatura ambiente.
5. Homogenizar el cultivo y comparar la turbidez.
6. Anotar los resultados.
Informe
1. Anotar los resultados del efecto del cloruro de sodio en una tabla.
2. Anotar los resultados del efecto de la sacarosa y de la miel en una tabla.
Cuestionario
1. Explique los siguientes términos: actividad de agua, agua osmótica y agua matricial.
2. Mencione el nombre de tres bacterias azúcar-tolerantes y los límites de aw a los que crecen.
3. Mencione el nombre de dos bacterias halofílicas facultativas y dos halofílicas obligadas, indicando a que aw
pueden crecer.
4. ¿Cuál es la utilidad práctica de conocer la actividad de agua a la que crecen los microorganismos?
5. Explique por qué los microorganismos halofílicos obligados pueden crecer a altas concentraciones de cloruro
de sodio.
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PRÁCTICA #9
Efecto de la temperatura de incubación sobre el crecimiento microbiano
y determinación del punto mortal y del tiempo térmico mortal (PTM y TTM)
Objetivo
El alumno aplicará la técnica que permite determinar el efecto de la temperatura de incubación sobre el crecimiento
microbiano.
El alumno aplicará dos técnicas para determinar la resistencia al calor por bacterias y levaduras.
Material
Tubos de 16/150 con 5 ml de caldo cerebro corazón
12 tubos de 13/100 estériles
12 tubos de 16/150 conteniendo 5 ml de caldo nutritivo
Asa bacteriológica
Estufas bacteriológicas
Gradilla
Refrigerador
2 pipetas de 2 ml estériles
Baño María a temperatura controlada
6 botes metálicos
6 tubos con jugo de naranja, leche descremada o agua y, sembrado con la suspensión microbiana (se usará uno por
equipo).
Método
Efecto de la temperatura
1. Colocar en una gradilla una muestra de una serie de cinco tubos con el medio de cultivo.
2. Marcar los tubos con el nombre de la cepa que se va a inocular y con las temperaturas de 5º C, 28º C, 37º C,
45º C y 55º C.
3. Incubar cada uno de los tubos con tres asadas de la suspensión microbiana.
4. Incubar cada tubo de acuerdo a la temperatura establecida durante 24-48 h. (los tubos de 5º C durante 10
días)
Tiempo térmico mortal

1. Colocar en una gradilla una serie de seis tubos de 13/100.
2. Marcar en cada tubo el nombre de la cepa a estudiar.
3. Anotar en cada tubo los tiempos de 5,10, 15, 20 y 30 min.
4. Colocar en cada tubo 0.5 ml de la suspensión microbiana.
5. Calentar las suspensiones a 85ºC en un Baño María (el testigo no).
6. Sembrar una asada de cada tubo en tubos con caldo simple.
7. Incubar los tubos a 37ºC por 24 h.
Punto térmico mortal

1. Colocar en una gradilla seis tubos de 13/100.
2. Marcar en cada tubo la cepa a estudiar.
3. Marcar en cada tubo las temperaturas de 60, 70, 75, 80, 85 y 90ºC.
4. Colocar en cada tubo 0.5 ml de la suspensión microbiana
5. Calentar por espacios de 10 min.
Informe
2. Indique la importancia de conocer la temperatura óptima de los microorganismos, así como la máxima y la
mínima.
3. Explique por qué los microorganismos psicrofílicos pueden crecer a bajas temperaturas y porqué los
termófilos lo hacen a temperaturas elevadas.
5. Anotar los resultados de PTM y TTM en un cuadro.
6. Discutir los resultados con el maestro.
21
Práctica #10
Efecto del pH, los metales y de los detergentes sobre la viabilidad de los microorganismos
Objetivo
El alumno usará técnicas microbiológicas para determinar el efecto de algunos metales y detergentes sobre la
viabilidad de los microorganismos.
Material
6 tubos de 16/150 con tapón de rosca conteniendo 5 ml de caldo BHI, con el pH ajustado a 1, 3, 5, 7, 9 y 11.
Matraces de 100 ml conteniendo 0.10, 0.15, 0.25, 0.5 y 1% de solución acuosa con detergente de uso comercial.
1 tubo de ensaye con tapón de rosca conteniendo 10 ml de una solución de nitrato de plata al 1%.
1 tubo de ensaye de 16/150 con tapón de rosca conteniendo cloruro mercúrico al 1%.
1 tubo de ensaye de 16/150 con tapón de rosca conteniendo merthiolate al 1%.
Discos de papel filtro estériles.
Hisopos estériles
Pinzas de disección rectas
Regla graduada en cm.
Mechero Fisher
Asa bacteriológica
1 botella de alcohol
6 pipetas Pasteur
Gradilla metálica
Método
Influencia del pH
1. Inocular cada tubo con el pH ajustado a 1, 3, 5, 7, 9 y 11. con una asada del cultivo.
2. Incubar a 37º C durante 24 – 48 h.
3. Observar los resultados comparando el crecimiento.
4. Hacer una gráfica del efecto del pH sobre el crecimiento de las cepas.
5. Discutir los resultados de la práctica.
Preparación de discos de papel filtro con agentes químicos

1. Distribuir discos de papel filtro en una caja con el compuesto que se va a probar.
2. Realizar varias marcas en la caja de acuerdo al compuesto que se va a probar.
3. Impregnar los discos con el agente químico correspondiente, usando pipeta Pasteur.
Efectos de metales y detergentes por prueba en placa
1. Sembrar con hisopo una placa de gelosa simple con cada una de las cepas proporcionadas.
2. Marcar cada caja con el nombre de la cepa y las claves correspondientes a cada compuesto que se va a
probar en el sitio adecuado.
3. Esterilizar las pinzas con alcohol, flameándolas y colocar los discos en el sitio correspondiente presionando
ligeramente.
4. Incubar a 37º C por 24 h.
5. Observar los resultados midiendo los halos de inhibición.
6. Se considera que un compuesto es activo cuando su halo es de 7 mm en adelante.
Efecto de distintas concentraciones en tubo
1. Colocar en una gradilla un tubo con caldo nutritivo y cinco con el caldo adicionado del detergente a distintas
concentraciones.
2. Inocular todos los tubos con una asada de cultivo.
3. Incubar a 37º C por 24 h.
22
4. Observar el resultado anotado con cruces el crecimiento.

5. Anotar las características de cada uno.
Informe
1. Anotar los resultados de los agentes probados sobre el crecimiento, así como sus características.
2. Resuma los resultados del efecto del detergente sobre las cepas en una tabla con en el caso anterior y
expréselos en una gráfica.
3. Discutir los resultados de ambos experimentos.
Cuestionario
1)Escriba el nombre de tres microorganismos acidófilos, neutrófilos y basófilos.
2) Explicar la importancia que presenta el conocimiento de la influencia del pH en el crecimiento microbiano
desde el punto de vista de la microbiología aplicada.
3)¿Cómo mantendría un determinado pH de un medio de cultivo en forma constante durante el crecimiento del
microorganismo?
4)¿Qué sustancias se utilizan para regular el pH en medios ácidos, neutros o alcalinos?
5) ¿Cómo afecta el crecimiento microbiano la adición de detergentes o metales pesados?
6) Explicar el efecto bactericida que presentan los metales pesados.
7) Explicar las diferencias entre los términos bactericida y bacteriostático.
23

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UNIVERSIDAD SIMON BOLIVAR

FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA

PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA GENERAL

PRÁCTICA #1 Uso del microscopio compuesto y tinciones.

PRÁCTICA #4 Aislamiento y cultivo de Hongos y Levaduras.

PRÁCTICA #7 Curvas de crecimiento microbiano.

PRÁCTICA #8 Efecto de la presión osmótica sobre la viabilidad y el crecimiento microbiano.

Práctica #10 Influencia del pH sobre el crecimiento microbiano.

Reglamento del laboratorio de Microbiología General

b) Iluminación del campo visual

d) Frotis a partir en un cultivo sólido

e) Frotis a partir de un cultivo líquido

f) Tinción simple de los frotis

h) Técnica de tinción de Gram

j) Observación de la pared celular: Tinción de Knaysi

k)Tinción de esporas por la técnica de Sheaffer y Fulton

l) Tinción de Loeffler por gránulos metacromáticos

Material Cajas con agar nutritivo

Material Agar nutritivo

Preparación del material

Aislamiento por el método de la estría cruzada

Para trabajar revisa los esquemas.

Crecimiento en medio líquido

Toma en cuenta que:

Puntiforme Circular Filamentos Amiboide Rizoide Fusiforme

Plana Elevada Convexa Pulvinada Umbonada Crateriforme o umbilicada

Entero Ondulado Lobulado Dentado Filamentoso Enrollado Rizoide

Crecimiento en un medio líquido

Homogéneo Floculento Anillo Membrana Película

Técnica de vaciado en placa

1.Homogenizar el cultivo agitando vigorosamente la muestra.

Cuenta de bacterias por inoculación en superficie

Técnica de inoculación en superficie

Dilución Cuenta microbiana

Frasco con tapón de rosca, conteniendo 90ml. de agua Alcohol

8. Descripción de la morfología microscópica:

Hifa cenocítica Hifa septada mononucleada Hifa septada polinucleada

TIPOS DE ESPORAS ASEXUALES:

Artrosporas Bacidiosporas Clamidosporas

5.Informar la morfología microscópica en tablas.

Digestión de polisacáridos Bacillus subtilis

Digestión de azúcares por fermentación en tubos de Durham

Fermentación de azúcares y producción de sulfhídrico en el medio TSI.

Fermentación de azúcares. Prueba de Voges-Proskauer.

Utilización de ácidos orgánicos citrato y malonato

Metabolismo de aminoácidos en medio de SIM. Producción de indol y H 2S

Acción sobre la lisina

1. Incubar los tubos en un baño maría a 37ºC.

Reducción de nitratos a nitritos

Prueba de citocromo oxidasa

2. Incubar a 37°C por 24 h.

Crecimiento radial de hongos

Efecto del cloruro de sodio

Crecimiento en miel o sacarosa de microorganismos osmofílicos

Tiempo térmico mortal

Punto térmico mortal

Preparación de discos de papel filtro con agentes químicos

Efectos de metales y detergentes por prueba en placa

Efecto de distintas concentraciones en tubo

4. Observar el resultado anotado con cruces el crecimiento.

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