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DE MEXICO
TRABAJO PROFESIONAL
DEDICATORIA
LE DOY LAS GRACIAS A TODA LA GENTE QUE ME APOYO EN LA REALIZACIÓN
DE ESTE TRABAJO POFESIONAL
A MI FAMILIA
EDWIIN MI ESPOSO, POR TODO SU AMOR, SUSTENTO Y COMPRENSIÓN
SEBASTIAN MI ADORADO HIJO, POR DARME LAS FUERZAS PARA CONTINUAR
A MIS PADRES
MARÍA GRISELDA POR SU RECUERDO
OSCAR POR SU EJEMPLO
A MIS HERMANAS
NUBIA Y PAOLA POR SU CARIÑO
A BENIGNO, MINERVA, IRED, IRVING Y DELFINA POR SU PREOCUPACIÓN
PROFESORES
QFB MARTHA PATRICIA CAMPOS PEÓN MI ASESORA, POR TODA LA PACIENCIA Y ENSEÑANZA
DR. ANDRÉS ROMERO, DR. VÍCTOR ZENDEJAS, QFB. GUADALUPE REBOLLAR Y QFB. LADISLAO
PALOMAR POR BRINDARME SU VALIOSO TIEMPO Y EJEMPLO
AL INCMNSZ
POR PERMITIRME SER PARTE DE SU GENTE
“MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
PARA INMUNOHEMATOLOGÍA
BANCO DE SANGRE”
ÍNDICE
Página
Generalidades
I. Prólogo 1
I.I. Introducción 2
III. Objetivo, Meta y Alcance 7
IV. Mensaje del Usurio 8
V. Marco Jurídico 9
VI. Seguridad de las Muestras 10
VII. Definiciones 11
VIII. Instalaciones y Procedimientos 12
1. 1 Responsabilidades 18
1. 2 Aplicación clínica 18
1. 3 Suministros 18
1. 4 Reactivos 18
1. 5 Equipo necesario 19
1. 6 Procedimiento del ensayo 20
1. 7 Marcado y empaque 23
1. 8 Formatos, referencias y bibliografía 24
2. 1 Responsabilidades 25
2. 2 Principio 25
2. 3 Aplicación clínica 27
2. 4 Recolección de la muestra 28
2. 5 Factores de rechazo 29
2. 6 Condiciones de manejo y almacenamiento 30
2. 7 Reactivos 30
2. 8 Control de calidad 31
2. 9 Procedimiento del ensayo 33
2. 10 Resultados 34
2. 11 Interferencias y limitaciones del método 34
2. 12 Formatos, referencias y bibliografía 35
Página
3. 1 Responsabilidades 36
3. 2 Principio 36
3. 3 Recolección de la muestra 37
3. 4 Reactivos 39
3. 5 Control de calidad 39
3. 6 Equipo necesario 41
3. 7 Procedimiento del ensayo 41
3. 8 Resultados 42
3. 9 Formatos, referencias y bibliografía 43
4. 1 Responsabilidades 44
4. 2 Principio 44
4. 3 Recolección de la muestra 45
4. 4 Reactivos 47
4. 5 Equipo necesario 47
4. 6 Procedimiento del ensayo 48
4. 7 Formatos, referencias y bibliografía 50
5. 1 Panel de 10 células 57
5. 2 Formatos, referencias y bibliografía 58
TEMA 6. RASTREO DE ANTICUERPOS IRREGULARES
MÉTODO LION EN TUBO
Página
6. 1 Responsabilidades 59
6. 2 Principio 59
6. 3 Recolección de la muestra 60
6. 4 Reactivos 62
6. 5 Equipo necesario 65
6. 6 Procedimiento del ensayo 65
6. 7 Resultados 65
6. 8 Interferencias y limitaciones del método 68
6. 9 Formatos, referencias y bibliografia 69
7. 1 Responsabilidades 70
7. 2 Principio 70
7. 3 Recolección de la muestra 72
7. 4 Reactivos 74
7. 5 Equipo necesario 75
7. 6 Resultados 76
7. 7 Interferencias y limitaciones del método 76
7. 8 Formatos, referencias y bibliografia 78
TEMA 8. PRUEBA DE COOMBS
Página
8. 1 Responsabilidades 79
8. 2 Principio 79
8. 3 Recolección de la muestra 81
8. 4 Reactivos 83
8. 5 Control de calidad 84
8. 6 Equipo necesario 85
8. 7 Procedimiento del ensayo 85
8. 8 Resultados 89
8. 9 Formatos, referencias y bibliografia 90
9. 1 Propósito y alcance
9. 2 Introducción 91
9. 3 Instrucciones y procedimiento 92
9. 4 Material y equipo requerido para criopreservar CPH 100
9. 5 Espécimen a criopreservar 101
9. 6 Procedimientos previos a la criopreservación de CPH 103
9. 7 Procedimiento para criopreservar 105
9. 8 Procedimiento para determinar el No. De CMN de las CPH 113
9. 9 Procedimiento para determinar la viabilidad celular de las CPH 114
9.10 Limpieza y asepsia de la campana de flujo laminar 115
9.11 Verificación de la esterilidad del proceso 116
9.12 Procedimiento para descongelar CPH criopreservadas 116
9.13 Abreviaturas 120
9.14 Formatos, referencias y bibliografia 127
ÍNDICE DE TABLAS
Página
TABLA 1. Avidez 20
TABLA 2. Especificidad 21
TABLA 3. Titulo de reactivos 22
TABLA 4. Sistema de grupo sanguíneo ABO 25
TABLA 5. Tipo y volumen de muestra requerida 29
TABLA 6. Identificación del control 31
TABLA 7. Tipo y volumen de muestra requerida 37
TABLA 8. Identificación del control 39
TABLA 9. Tipo y volumen de muestra requerida 45
TABLA 10. Tipo y volumen de muestra requerida 60
TABLA 11. Identificación del control 63
TABLA 12. Tipo y volumen de muestra requerida 72
TABLA 13. Tipo y volumen de muestra requerida 82
TABLA 14. Identificación del control 84
TABLA 15. Volumen mínimo y máximo al criopreservar CPH 105
TABLA 16. Valores de DMSO – plasma para la medición exacta 108
Del DMSO al 20 %
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
En la actualidad hay que estar bien preparados para enfrentar la problemática que se
nos presenta a los que concluimos la trayectoria, pues las oportunidades son escasas, y
en gran medida de difícil acceso, es por ello que para formar parte, del área del Banco
de Sangre de una Institución de prestigio como es el Instituto Nacional de Ciencias
Medicas y Nutrición Salvador Zubirán, que es mi caso particular, no solo hay que
mostrar lo aprendido durante la formación académica, que considero la mejor carta de
presentación, además es necesario agotar todas las herramientas con las que se cuenta
en la actualidad, como el conocer un segundo idioma, como el ingles, el manejo de
computadora e Internet entre otros.
II. INTRODUCCIÓN
Uno de los factores que influye en la atención médica que se otorga, es la disponibilidad
de sangre y sus derivados en las cantidades necesarias y con las características de
calidad y seguridad que garanticen, el cumplimiento de las normas de salud vigentes.
Una certificación, en general, asegura la calidad de un producto, de un organismo o de
una persona. Pone de manifiesto que se poseen los niveles de competencia para ejercer
correctamente y dar adecuadamente las prestaciones que se le suponen. La certificación
es el conjunto de pruebas que permiten la obtención de un certificado que da fe de la
calificación de un profesional en un momento dado de su carrera.
La Certificación asegura a un profesional que posee determinados niveles de
conocimiento y de habilidades que le permiten ejercer su profesión en las mejores
condiciones.
Por lo anterior, todo el personal que trabaja en este lugar y en especial los responsables
de gestión y dirección, deben asegurarse que se cumpla con los requisitos de calidad,
normatividad que se ofrezcan productos válidos a los enfermos, así como mejorar la
seguridad de los productos, la productividad y los costos, tras obtener la Certificación
de la Calidad ISO 9001-2000.
La certificación, es un logro importante y trascendental, el cual nos impulsará a
continuar con una mejora constante y ascendente del servicio que prestamos para
beneficio de los pacientes, y claro, sin olvidar a los donadores.
En la actualidad, el implementar un sistema de gestión de la calidad, resulta
indispensable, para contar con servicios de excelencia, aún cuando el proceso que se
lleva a cabo en una época especialmente difícil donde los recursos materiales son
escasos y donde no mucha gente piensa en trabajo en equipo y en superación.
SANGRE
Su función es transportar el oxígeno desde los pulmones a los diferentes tejidos del
cuerpo para que las células respiren, y también eliminan los residuos producidos por
la actividad celular (p.ej. anhídrido carbónico).
PLAQUETAS
Son las células sanguíneas más pequeñas. Se producen también en la médula ósea y
viven unos 6-7 días. Intervienen cuando se produce rotura, se adhieren rápidamente
en ese lugar para que cese la hemorragia, dando tiempo a la formación del coágulo
definitivo.
PLASMA
Entre las sustancias de importancia que transporta el plasma están las siguientes.
La Albúmina. Es una proteína que ayuda a mantener el agua del plasma en una
proporción equilibrada.
Este manual tiene como objetivo principal, contener las políticas y ensayos
inmunohematológicos, como una estandarizada de procedimientos con el fin de obtener
resultados óptimos en menor tiempo, recopilados a través de la experiencia laboral para
dar respuesta inmediata a las necesidades de los pacientes que requieren una
transfusión segura y de calidad.
METAS
ALCANCE
Finalmente se presenta un programa para el entrenamiento del personal que realiza estas
pruebas pretransfusionales.
Decretos por el que se aprueba el Programa de Reforma del Sector Salud 1995-2000.
D.O.F. 11-III-1996
En el contexto de esta publicación, los términos listados abajo se definen como sigue:
(3) Rastreo de anticuerpos irregulares: Prueba que se realiza de rutina a todos los tubos
primarios que llegan al Servicio.
Aquí se describen cuales son los sitios potenciales en donde se pueden realizar las
pruebas pre - transfusionales:
Aquí se realizan todas las pruebas pretransfusionales a los pacientes, cuenten o no con
registro del Instituto, a quienes sus médicos tratantes les hayan solicitado concentrados
eritrocitarios, plasma fresco congelado, plasma envejecido, crioprecipitados
concentrados plaquetarios y/o plaquetaféresis.
No hay programación de citas, en este mismo sitio se trabajan muestras urgentes y
ordinarias así como las cirugías electivas, inmediatamente después de terminar las
pruebas pretransfusionales del paciente utilizamos el sistema BBS para ingresarlos.
Eventualmente, también acuden al laboratorio de inmunohematología pacientes
ambulatorios que son referidos de otras Instituciones públicas y/o por médicos
particulares.
El acceso es por la puerta número 4 del INCMNSZ que da a la calle Martín de la Cruz
S/N ubicada entre Vasco de Quiroga y Viaducto Tlalpan. Tiene un horario de
funcionamiento de 7:00 hr. a 18:00 hr. por la puerta 2 después de esta hora.
Esta Unidad fue inaugurada en enero de 1995. Cuenta con rampas de acceso e
instalaciones para discapacitados, un mostrador de registro para los pacientes así como
sala de espera y sanitarios.
A continuación se describirán las instalaciones con que cuenta, así como algunos
procedimientos.
2) Los estos deben contener los siguientes datos: nombre completo y número de
predonante, fecha, nombre del estudio (ej. B-H., Historia clínica etc.)
Cada una de ellas para exámenes de laboratorio debe ser introducida en el sistema de
software para poder identificar y obtener la hoja de trabajo, etiquetas, y otros
suministros de cada paciente.
Muestras lipémicas
Muestras hemolizadas
Muestras coaguladas
Muestras insuficientes (menos de 4.5mL de volumen)
Reactivos que presentan turbidez o hemólisis
Las que presenten uno o más de los factores arriba mencionados solo se procesaran
previa autorización del jefe de servicio.
A los resultados de laboratorio inesperados y no buscados se les llama frecuentemente
“errores de laboratorio”. Aún cuando los procedimientos analíticos hayan sido
realizados en forma correcta y precisa, diversas variables pueden afectar los resultados.
El conocimiento de éstas y la estandarización de los procedimientos de las pruebas de
laboratorio son esenciales para la correcta interpretación y el uso óptimo de los datos.
Las principales causas pueden estar relacionadas a factores no analíticos tales como la
toma, manejo y transporte de las muestras.
Los factores no biológicos, como la inadecuada identificación del paciente, y factores
biológicos, como la postura del paciente y la hora de la toma de la muestra, contribuyen
juntos al “error del laboratorio” total.
PROGRAMA DE ENTRENAMIENTO
Se puede pensar, inicialmente, que cualquier individuo inteligente puede llevar a cabo
las pruebas del laboratorio de inmunohematología. Sin embargo, aquellos que están
familiarizados con esté saben que eso no es verdad. La Medicina Transfusional es un
procedimiento complejo que requiere conocimientos y experiencia para realizarlo
correctamente. Por esta razón, una institución debe establecer criterios para la selección
adecuada del personal.
El programa de entrenamiento debe contener instrucciones didácticas y entrenamiento
empírico.
Después del entrenamiento, el entrenado debe ser capaz de realizar las siguientes
tareas:
CONTROL DE CALIDAD
1.1 RESPONSABILIDADES
Es responsabilidad del Jefe de Medicina Transfusional y del Coordinador (a) el
proporcionar éste documento al personal de nuevo ingreso y a todo aquel que lo
requiera.
Es responsabilidad de todo el personal de inmunohematología conocer y seguir este
procedimiento.
1.3 SUMINISTROS
La siguiente lista describe los suministros que deben estar disponibles en el laboratorio
de para llevarlo a cabo manera habitual.
1.4 REACTIVOS
Antisueros hemoclasificadores tienen las siguientes características: Caducidad
mínima de un año, con certificación ISO 9001, FDA o mayor
Eritrocitos con fenotipo conocido al 3-5% caducidad de 3 a 4 semanas
Tarjetas con gel sephadex para pruebas cruzadas, grupos sanguíneos y fenotipos
Solución salina fisiológica al 0.9%
Solución I (diana sol I)
Solución II (diana sol II)
Solución de lavado A (diana fluid A)
Solución de lavado B (diana fluid B)
1.5 EQUIPO NECESARIO
MATERIAL DE VIDRIO
Pipetas Pasteur
Tubos de 12x75 mm
Frascos goteros estériles
EQUIPOS
Centrifugas de mesa
Incubador de calor seco
OTROS
Guantes: Son de látex, no estériles. Si algún trabajador es susceptible de
desarrollar dermatitis al usarlos por largos períodos de tiempo, debe intentar usar
de vinil u otro tipo de plástico.
Contenedores desechables para punzo-cortantes:
En este sitio debe haber disponibles contenedores desechables para material punzo-
cortante en el cual se coloca el material de vidrio usado que se haya roto. Están
fabricados de plástico rígido y tienen una pestaña para desatornillar la aguja.
Además están claramente marcados como residió bio – peligrosos, de acuerdo con la
NOM – 087 – SSA.
Bulbos de hule o látex
Gogles
1.6 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
AVIDEZ
TABLA 1. AVIDEZ
Anti - D 30 0
ESPECIFICIDAD
TABLA 2. ESPECIFICIDAD
CÉLULAS CONOCIDAS
SUERO A1 A2 B 0 R1r Rr
Anti - A 4+ 4+ 0 0
Anti - B 0 0 4+ 0
Anti - AB 4+ 4+ 4+ 0
Anti - D 4+ 0
POTENCIA
TITULO
NOM-008-SCFI-1993.
FASE ANALÍTICA
2.1 RESPONSABILIDADES
2.2 PRINCIPIO
A A Anti - B
B B Anti - A
AB AyB Ninguno
Para realizar el grupo sanguíneo de una persona se prueban directamente los eritrocitos
con reactivo Anti-A, y Anti-B ( prueba con eritrocitos o prueba directa). La
confirmación de los resultados se hace utilizando eritrocitos de grupo A y B ( prueba
sérica o prueba inversa ). Algunas pruebas adicionales facilitan la identificación de
subgrupos por ejemplo: La distinción serológica de las células A1 y A2 utilizan lectina
de las semillas de Dolichos biflorus.
En la dilución apropiada, esta lectina reacciona como Anti-A1 y aglutina los eritrocitos
A1, pero no los A2. El 80% de los individuos del grupo A o AB posee globulos rojos
que se aglutinan en presencia de anti-A1 y, por lo tanto, se clasifica como A1 o A1 B.
El 20% restante, con eritrocitos que se aglutinan en presencia de Anti-A, pero no de
anti-A1, se clasifican como A2 o A2 B.
Tarjetas de Gel
Cámara de Reacción
Sobrenadante
Gel de Sephadex o
Poliacrilamida
TIPO DE MUESTRA:
Suero
Eritrocitos
VOLUMEN REQUERIDO:
TIPO DE VOLUMEN
MUESTRA
Óptimo Mínimo
4.0 mL 1.0 mL
Suero
3.0 mL 0.5 mL
Eritrocitos (3-5%)
RECIPIENTE DE RECOLECCIÓN
La muestra debe ser recolectada en un tubo con tapón morado que contiene
anticoagulante (EDTA), o en un tubo sin anticoagulante con datos especiales para el
Servicio de Medicina Transfusional.
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:
Presencia de macro partículas
Muestras mal etiquetadas
Volumen insuficiente
Muestras coaguladas
Cuando una muestra es rechazada, el coordinador y/o responsable de área (o el
responsable del turno) deberá dar aviso al médico encargado del servicio (o al MIP),
solicitando una nueva muestra o cancelando el análisis y llenar un reporte de productos
no conformes (FR-AC-05) como se establece en el procedimiento general de control de
producto no conforme (PG-AC-04).
2.7 REACTIVOS
MATERIALES
INGREDIENTES ACTIVOS
PREPARACIÓN
Previa centrifugación de las tarjetas de reactivos dianagel donors/donantes
FORMA AUTOMATIZADA:
No requiere de preparación
ACEPTABILIDAD
La aceptabilidad de un reactivo está determinada por los resultados obtenidos en
el control de calidad
NOMBRE DEL
NIVEL TIPO DE MUESTRA
CONTROL
PRUEBA DIRECTA
reactivo:
Anti - A I Antisueros, tarjetas
Anti - B
Anti-AB
Anti - D
PRUEBA INDIRECTA
Células al 3-5 % :
Células A1 II Eritrocitos
Células A2
Células B
Células O
PREPARACIÓN DEL CONTROL
No requiere preparación
Deben analizarse los 2 niveles de controles todos los días que se procese el analito
En caso de que una corrida sea rechazada, debe repetirse el ensayo, si después de ello no
se corrigen los valores, deben indagarse las posibles causas de error, como pueden ser
entre otros factores: almacenamiento inadecuado del reactivo, muestras de sangres
viejas, suspensiones muy diluidas o muy concentradas, tiempo y temperatura de
incubación inapropiada.
Si al observar estos detalles persiste, debe buscarse alguna falla sencilla en el equipo, si
el continua lo conveniente es dar aviso al servicio técnico especializado del proveedor
del instrumento.
En caso de no contar con controles comerciales debe usarse una muestra de eritrocitos y
de sueros de los grupos A, B, AB, Rh, O.
EQUIPO NECESARIO
Centrífuga
Guantes desechables
Gradillas
Sistema Wadiana
Solución salina fisiológica al 0.9%
Bulbo de hule
Pipetas Pasteur
Una vez recibida la muestra debe ser centrifugada durante 5 minutos a 3500 rpm.
Las muestras de suero deben ser procesadas sin ningún tratamiento previo y conforme
lo especificado según el Manual del Sistema Wadiana.
PROCEDIMIENTO
REPORTE DE RESULTADOS:
Los resultados obtenidos del equipo pueden ser capturados manualmente o transmitidos
al Sistema del Paciente Ambulatorio (SIPAM) y/o en el programa Blood Bank y son
validados y liberados por el responsable de turno.
En la validación de los resultados se revisa que los resultados obtenidos sean
congruentes y que no queden espacios libres en la pantalla sin capturar.
CRITERIOS DE REPETICIÓN
VALORES CRÍTICOS
Entre las sustancias que causan interferencia se encuentran: muestras viejas, muestras
hemolizádas, que la dilución de eritrocitos que hacemos para nuestro análisis estén muy
concentradas o muy diluidas, reactivo mal almacenado, caducado, etc.
2.12 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍA
3.1 RESPONSABILIDADES
3.2 PRINCIPIO
TIPO DE MUESTRA
Suero
Eritrocitos
VOLUMEN
TIPO DE MUESTRA
Óptimo Mínimo
La muestra debe ser recolectada en un tubo sin anticoagulante con datos especiales para
el Servicio de Medicina Transfusional.
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
FACTORES DE RECHAZO
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:
Después del análisis se almacenan durante las primeras 72 hrs. entre 2ºC y 8ºC.
Si la muestra requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rígidos de
plástico perfectamente bien cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y
facilidad de transporte a la muestra.
3.4 REACTIVOS
FORMA AUTOMATIZADA
INGREDIENTES ACTIVOS
PREPARACIÓN
NOMBRE DEL
NIVEL TIPO DE MUESTRA
CONTROL
No requiere preparación
Deben analizarse los 2 niveles de controles todos los días que se procese el
analito.
ALMACENAMIENTO
Almacenar los frascos goteros sin abrir entre 2oC y 4oC. Una vez abiertos, los controles
que se utilizarán en un plazo de 30 días pueden almacenarse entre 2oC y 8oC de uso de
los controles.
En caso de que una corrida sea rechazada, debe repetirse el ensayo, si después de ello no
se corrigen los valores, deben indagarse las posibles causas de error, como pueden ser
entre otros factores: reactivo, sol.1, sol.2, mal almacenamiento del reactivo.
Si al observar estos detalles persiste, debe buscarse alguna falla sencilla en el equipo, si
continua lo conveniente es dar aviso al servicio técnico especializado del proveedor del
instrumento.
En caso de no contar con controles comerciales debe usarse una muestra de suero de un
paciente normal y otra de un paciente patológico alto.
3.6 EQUIPO NECESARIO
Centrífuga
Guantes desechables
Gradillas
Sistema Wadiana
Solución salina fisiológica al 0.9%
Bulbo de hule
Pipetas Pasteur
Una vez recibida la muestra deben ser centrifugadas durante 5 minutos a 3000 rpm.
Las muestras de suero deben ser procesadas sin ningún tratamiento previo y conforme
lo especificado según el Manual del Sistema Wadiana.
PROCEDIMIENTO:
3.8 RESULTADOS
REPORTE DE RESULTADOS
Los resultados obtenidos del equipo pueden ser capturados manualmente o transmitidos
al Sistema del Paciente Ambulatorio (SIPAM) y/o en el Programa Blood Bank y son
validados y liberados por el responsable de turno.
CRITERIOS DE REPETICIÓN
VALORES CRÍTICOS
4.1 RESPONSABILIDADES
4.2 PRINCIPIO
PRUEBA MAYOR (anticuerpos en el suero del receptor, contra los eritrocitos del
donador).
APLICACIÓN CLÍNICA
Suero 2 Gotas
Eritrocitos 1 Gota
RECIPIENTE DE RECOLECCIÓN
En un tubo con tapón morado con anticoagulante EDTA que proporciona el banco de
sangre.
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
FACTORES DE RECHAZO
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:
Muestra coagulada
Muestra hemolizada
Muestra mal etiquetada
Volumen insuficiente
La muestra debe ser manipulada sólo por personal autorizado. Debe ser transportada
bien cerrada y en posición vertical, en gradillas de tamaño adecuado al tubo, o en su
defecto a través de un sistema de transporte neumático.
Si la muestra requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rígidos de
plástico perfectamente bien cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y
facilidad de transporte a la muestra.
4.4 REACTIVOS
3. Suero del paciente (obtenido en los tres días previos a la transfusión, sí el paciente se
encuentra dentro de la ventana de inestabilidad serológica).
Centrífuga
Guantes desechables
Gradillas
Solución salina
Albúmina, LISS, PEG ( polietilenglicol )
Antiglobulina humana (poli inespecífico IgG – C3).
4.6 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Una vez recibida la muestra de sangre debe ser centrifugada durante 5 minutos a 3500
rpm.
Irregulares naturales: anti A1, anti-M, anti-N, anti-P1. anti-E, entre otros.
Por anticuerpos regulares debemos identificar a los que existen en todos los individuos
y que éstos tendrán durante toda su vida. Los anticuerpos irregulares son los que no
están de esa manera, aunque en el caso de los naturales no se conoce a ciencia cierta qué
o cómo se induce su producción.
Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) más comunes en nuestra población son los
que involucran a los sistemas MNSs, P1, Kidd (Jka, Jkb), Duffy (Fya, Fyb), Kell, Lewis y
Diego.
Los anticuerpos fríos van dirigidos contra los sistemas MN, Lewis y P1, con óptima
reacción a temperaturas entre 4°C y 22°C; estos son generalmente inmunoglobulinas
tipo IgM y ocasionalmente tipo IgG, y debido a esa temperatura de reacción carecen de
importancia clínica salvo que su reacción ocurra también a 37°C, es decir, que actúen
como anticuerpos calientes.
Entre estos sólo los dirigidos contra los antígenos M y N han sido asociados con EHRN,
cuya severidad va desde leve a moderada. Los llamados anticuerpos calientes tienen una
temperatura óptima de reacción a 37°C, a veces visible pero en otras ocasiones sólo
evidente hasta agregar anti gamma globulina humana (suero de Coombs). Estos tienen
una relevante importancia clínica ya que se les asocia con reacciones transfusionales de
intensidad moderada a severa, que pueden ocasionar la muerte; además, son causantes
de hemólisis en los recién nacidos, quienes en ocasiones requieren
exsanguinotransfusión.
Para un óptimo funcionamiento de esta área del laboratorio es importante conocer las
características ya descritas del comportamiento de los anticuerpos, así como otras más:
La afectación que sufren por el efecto de medios de baja fuerza iónica (LISS,
polietilenglicol y otros), por el de productos químicos o enzimas (ficina, tripsina,
quimiotripsina, ditiotreitol, papaína, stalidasa, bromelasa, y otras) o de otras
sustancias. De esta manera conocemos que algunos anticuerpos de este tipo se
ven afectados o son destruidos.
Técnica enzimática con bromelina (bromelasa): Por el fuerte efecto que tiene
esta enzima sobre los eritrocitos, los tiempos de incubación se reducen. El
procedimiento es de la siguiente forma: a los eritrocitos lavados se les agrega el
suero problema en la proporción ya descrita más una gota de la enzima
(bromelina); se incuban, centrifugan y se leen.
Se elaboran células de donantes con fenotipo conocido en el que se han incluido los
más comunes de nuestra población. Éste consta generalmente de grupos sanguíneo O,
factor RhOD positivo y de factor RhOD negativo; de cuatro donadores para
determinación de grupo en el sistema ABO (A1, A2,B, O); de dos donadores grupo O
para diferenciación de factor RhO D (una factor positivo y otra factor negativo); células
de un donador grupo O, las cuales serán sensibilizadas, es decir, se les pegará un
anticuerpo de naturaleza IgG, generalmente un anti-D, y otras del mismo grupo O sin
sensibilizar que funcionan como control negativo; éstas dos últimas servirán para
controlar el suero de Coombs.
Debe trabajarse con sumo cuidado teniendo siempre en cuenta que de nuestro trabajo
depende la vida de muchos pacientes, y que nosotros podríamos ser la causa de una
pronta recuperación o de una complicación mayor. Nos corresponde poner nuestro
mayor empeño para obtener resultados óptimos; Por eso, cada técnica debe ser trabajada
de acuerdo con los parámetros establecidos, por ejemplo: el sistema Duffy es sensible a
los medios de baja fuerza iónica y susceptible de ser destruido por algunas enzimas, lo
que pudiera conducir a resultados erróneos. La importancia de la albúmina, radica en
que puede magnificar reacciones del sistema Rh-Hr, sin embargo, la técnica más
empleada es la salina, ya que nos permite observar adecuadamente las reacciones y nos
apoya en las otras técnicas, sobre todo cuando se observa más de una población de
anticuerpos antieritrocitos, además de ser altamente confiable.
6.1 RESPONSABILIDADES
6.2 PRINCIPIO
El uso de gamma LO-ION, en lugar de las soluciones de albúmina bovina para los
procedimientos de anticuerpos, crea un ambiente de baja fuerza iónica que incrementa
la proporción del anticuerpo captado durante la incubación y así es mayor la reactividad,
ya sea como hemoaglutinación directa o en pruebas de antiglobulina indirecta. Al
mismo tiempo, la incorporación de compuestos de alto peso molecular incrementa la
habilidad de muchos anticuerpos para dar reacciones de aglutinación directas con las
células que posean el antígeno apropiado.
Aplicación clínica
Este estudio consiste en el rastreo que permite identificar a los pacientes que presentan
en su suero anticuerpos antieritrocitarios dirigidos contra antígenos que no son del
sistema ABO.
Esta prueba está indicada como parte de las pruebas de compatibilidad sanguínea
pretransfusional, en mujeres Rh negativo, como parte del estudio de la EHRN, en
estudios de la anemia hemolítica autoinmune, entre otras más.
6.3 RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA
Tipo de muestra:
Sangre total
VOLUMEN
TIPO DE MUESTRA
Óptimo Mínimo
7.0 mL 5.0 mL
Sangre total
RECIPIENTE DE RECOLECCIÓN
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:
Muestras lipémicas o hemolizadas
Presencia de macro partículas
Muestras sobre etiquetadas
Muestras con etiquetas tachadas o corregidas
Volumen insuficiente
Recipiente distinto al proporcionado
La sangre se extrae por una técnica aséptica, mediante una punción limpia y sin
problemas de toma. Se coloca en el tubo proporcionado por el Servicio de Medicina
Transfusional, correctamente etiquetado. Debe de centrifugarse inmediatamente y ser
procesada en ese mismo día. Después de terminar los estudios la muestra se debe de
conservar y almacenar en su tubo original debidamente tapado y en refrigeración entre
2ºC y 8ºC por un tiempo no mayor de 72 horas.
La muestra debe ser manipulada sólo por personal autorizado. Debe ser transportada
bien cerrada y en posición vertical, en gradillas de tamaño adecuado al tubo, o en su
defecto a través de un sistema de transporte neumático.
Si ésta requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rígidos de
plástico perfectamente cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y
facilidad de transporte.
6.4 REACTIVOS
MATERIALES
Pipetas Pasteur
Tubos de ensaye de 12 x 75 ó 10 x 75 mm
Bulbos
Gradillas
Marcador con tinta indeleble
Pluma (tinta azul o negra)
Papel parafilm
Cronómetro
Contenedor de plástico con hipoclorito de sodio al 5 % en cantidad suficiente
Contenedor desechable de punzo cortantes
Libreta de pruebas de Banco de Sangre
Reactivo de células rojas para la detección de anticuerpos
Solución salina fisiológica al 0.9 %
Reactivo de anti-IgG, C3d (suero de Coombs)
Reactivo de células rojas sensibilizadas
Reactivo de células rojas no sensibilizadas
Reactivo de Gamma LO-ION
PREPARACIÓN
Los eritrocitos del panel se preparan cada vez que se utilicen realizando tres lavados con
solución salina fisiológica al 0.9 % y resuspender es ésta a una concentración
aproximada de 3% a 5%. De igual manera se preparan los eritrocitos sensibilizados y no
sensibilizados, proporcionados en el mismo.
ACEPTABILIDAD
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
CONTROL DE CALIDAD
NOMBRE DEL
NIVEL TIPO DE MUESTRA
CONTROL
No requiere preparación
FRECUENCIA DE USO DE CONTROLES
Los sueros control se analizan al inicio de cada lote de eritrocitos del panel 10 Siglo
XXI.
Para los reactivos de Inmunohematología es diario al inicio del día.
ALMACENAMIENTO
Todos los datos obtenidos del control de calidad se registran en los formatos
correspondientes.
Centrifuga clínica
Centrifuga serológica Clay Adams
Baño María
Guantes desechables
Gradillas
Lentes de seguridad
a) Preparar una serie de 10 tubos identificados con el número de cada célula del
Panel 10 . Incluir un autotestigo
b) Con pipeta Pasteur agregar 2 gotas de suero de la muestra en cada tubo
c) Agregar una gota de la suspensión de eritrocitos de cada célula del panel a cada
tubo correspondiente
d) Agregar una gota de la suspensión de eritrocitos del paciente en el tubo
autotestigo
e) Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3500 rpm
f) Resuspender suavemente el botón de células, tubo por tubo. Leer y anotar si
existe o no aglutinación
g) Agregar a cada tubo dos gotas de LO-ION mezclar y centrifugar 30 segundos a
3500 rpm
h) Observar tubo por tubo si existe hemólisis. Leer y registrar la presencia de
hemólisis
i) Resuspender completamente el botón de células mediante agitación suave e
incubar a 37°C durante 10 minutos (máximo 30 minutos)
j) Luego de la incubación, lavar en tres ocasiones con solución salina fisiológica al
0.9 %, centrifugando durante 1 minutos en cada lavado
k) Eliminar el exceso de solución salina fisiológica al 0.9 % en el último lavado y
agregar dos gotas de suero de Coombs a cada tubo, se mezcla suavemente y se
centrifuga durante 30 segundos a 3500 rpm
l) Se resuspende suavemente el botón de células a contraluz tubo por tubo y leer la
aglutinación. Registrar los resultados
m) En los tubos en donde no se observó aglutinación con el suero de Coombs,
agregar una gota de células rojas sensibilizadas, mezclar suavemente y
centrifugar durante 30 segundos a 3500 rpm
n) Después de la centrifugación resuspender el botón de células por agitación suave
y leer a contraluz la aglutinación, tubo por tubo. Registrar los resultados
o) El registro de todos los datos y observaciones realizados durante la prueba se
harán en la libreta de registro de estudios del Banco de Sangre con el formato y
organización establecidos.
6.7 RESULTADOS
CÁLCULOS Y CONVERSIONES
Con los datos obtenidos al final de la prueba se realiza la lectura mediante comparación
con la carta de identificación de anticuerpos correspondiente proporcionada en el Panel
10 para la identificación de él o los anticuerpos encontrados.
REPORTE DE RESULTADOS
Una vez que los resultados son liberados en el SIPAM, son impresos durante la noche
en el departamento de archivo clínico y son archivados en el expediente del paciente.
INTERVALOS DE REFERENCIA
Burtis Carl A., 1996. Fundamentals of clinical chemistry, 4ª ed. Ed. W.B.
Saunders Company, U.S.A: p. 351-359.
7.1 RESPONSABILIDADES
7.2 PRINCIPIO
Cuando el suero de pacientes contiene anticuerpos para caprilato o algunos otros con
una cadena corta de ácidos grasos, la formación de los complejos albúmina -
inmunoglobulina causa aglutinación de algunas células rojas sanguíneas.
Esta aglutinación es algunas veces vistas solo en la fase de antiglobulina pero es
observada ocasionalmente en la prueba después de la incubación a 37oC.
Esta causa puede ser sospechosa si un suero da positivo con todas las células
(incluyendo el control).
Mantenga a 1oC - 8oC cuando no se use. No se congele, mantenga su esterilidad, no se
use si esta marcadamente turbio.
APLICACIÓN CLÍNICA
TIPO DE MUESTRA
TIPO DE VOLUMEN
MUESTRA
Óptimo Mínimo
La sangre se extrae por una técnica aséptica y el suero es separado para ser probado tan
pronto como sea posible.
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:
Muestras lipémicas
Presencia de macro partículas
Muestras mal etiquetadas
Volumen insuficiente
El suero es separado para ser usado tan pronto como sea posible, si la prueba se dilata,
las muestras para la identificación de anticuerpos, deben conservarse de 2oC a 8oC por
un tiempo no mayor de 48 horas. El suero puede mantenerse por un tiempo mayor de 48
horas. El plasma de muestras anticuaguladas puede usarse si se desea, pero el operador
debe estar enterado que esto puede dar resultados falsos o detectar anticuerpos
dependientes de complementos. Si son requeridas células rojas para la prueba se pueden
obtener las muestras utilizando EDTA, heparina u oxalato y éstas deben ser probadas
antes de 48 horas. Las células rojas sanguíneas de muestras coaguladas pueden ser
probadas dentro de 21 días después de su recolección. Las células rojas de donadores
unitarios deben ser probadas hasta antes de la fecha de caducidad.
7.4 REACTIVOS
MATERIALES
PREPARACIÓN
ACEPTABILIDAD
Los cartuchos de reactivo deben almacenarse cerrados entre 1°C y 8°C, no se congelan,
mantenga su esterilidad, no se use si esta marcadamente turbio.
Centrífuga
Guantes desechables
Gradillas
Colocar dos gotas del suero del receptor en tres tubos marcados I, II y AC
(autocontrol)
Agregar una gota de las células I, II y AC a sus respectivos tubos
Añadir tres gotas de albúmina al 22% a cada uno de los tubos
Incubar 30 minutos a 37°C
Centrifugar 30 segundos a 3500 rpm
Examinar la hemólisis y reconocer si se presenta
Resuspender las células agitando suavemente con la mano
Lavar los tubos tres veces con solución salina fisiológica 0.9% llenando completamente
el tubo y decantando con cuidado la solución salina entre lavado y lavado; y
resuspender las células perfectamente cuando se adicione la solución salina fisiológica
para el siguiente lavado.
Decantar la salina fisiológica 0.9 % completamente en el último lavado
Añadir una o dos gotas de anti – globulina humana en el botón seco de células
Mezclar bien centrifugar
CRITERIOS DE REPETICIÓN
8.1 RESPONSABILIDADES
8.2 PRINCIPIO
La reacción de Antiglobulina, fue descrita por Moreshi. En 1908, y fue aplicado por
Coombs y sus colaboradores en 1945 en la serología de grupos sanguíneos. Cuando se
utiliza el suero de animales inmunizados con proteína humana en la detección de los
llamados anticuerpos incompletos, la capacidad del suero antiglobulina para reaccionar
con componentes del complemento humana unidos a los glóbulos rojos fue reportado
en 1957 por Dacie y sus colaboradores.
La prueba de antiglobulina Coombs es un procedimiento importante para la detección
de inmunoglobulina y/o complemento unido a los glóbulos rojos. La prueba de
antiglobulina directa se utiliza para demostrar los anticuerpos y/o complemento unido a
los glóbulos rojos in vivo, y la prueba de antiglobulina indirecta después de la
incubación del suero y los glóbulos rojos, demuestran los anticuerpos y/o complemento
unido in vitro.
Cuando los anticuerpos incompletos (usualmente IgG) entran en contacto con los
glóbulos rojos que poseen los antígenos apropiados, éstos se unirán a la superficie de las
células y permanecerán unidos durante la serie de lavados con solución salina
fisiológica 0.9% para eliminar la proteína humana unida. Se puede detectar entonces la
presencia de la proteína resultante a través de una prueba de lavado de células con un
reactivo hecho de suero de conejo inmunizado con la proteína humana adecuada, o de
anticuerpos monoclonales secretados por hibridomas derivadas de ratón inmunizado y
de un cultivo medio fluido.
La aglutinación de glóbulos rojos por Anti-IgG en la prueba de antiglobulina directa e
indirecta, indica que las células están cubiertas con anticuerpos.
Algunos reportes sugieren que el IgG puede fallar ocasionalmente en la detección de
anticuerpos que se demuestren por el uso de un reactivo de antiglobulina humana poli
específica y los anticuerpos no detectados por Anti-IgG pueden ser clínicamente
significativos en algunos casos. El usuario debe ser consiente que la información
científica actual no es completamente un soporte para el uso excesivo de Anti-IgG para
pruebas de rastreo de anticuerpos y para pruebas de compatibilidad.
No se requiere una preparación previa del paciente para obtener la muestra. La sangre
debe obtenerse por medio de una técnica aséptica, y preferentemente debe probarse
mientras esté fresca. Si ocurre un retraso en la prueba, la muestra debe conservarse de
1°C a 8°C.
Para la prueba de antiglobulina directa se debe extraer la sangre con o sin anticoagulante
cuando se va a realizar la prueba con Anti-IgG.
TIPO DE MUESTRA
Suero, eritrocitos
TABLA 13. TIPO Y VOLUMEN REQUERIDO
VOLUMEN
TIPO DE MUESTRA
Óptimo Mínimo
4.0 mL 2.0 mL
Suero
RECIPIENTE DE RECOLECCIÓN
La muestra debe ser tomada en un tubo vacutainer con EDTA.
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
FACTORES DE RECHAZO
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:
Muestras lipémicas
Presencia de macro partículas
Muestras mal etiquetadas
Volumen insuficiente
Cuando una muestra es rechazada, el Coordinador y/o responsable de área (o el
responsable del turno) debe comunicar al médico encargado del servicio (o al MIP),
solicitando nueva muestra o cancelando el análisis y llenar un reporte de producto no
conforme (FR-AC-05) como se establece en el procedimiento general de control de
producto no conforme (PG-AC-04).
8.4 REACTIVOS
INGREDIENTES ACTIVOS
PREPARACIÓN
No requiere de preparación
ACEPTABILIDAD
Los frascos goteros de reactivo deben almacenarse cerrados entre 2oC y 8°C.
NOMBRE DEL
NIVEL TIPO DE MUESTRA
CONTROL
No requiere preparación
ALMACENAMIENTO
Centrífuga
Guantes desechables
Gradillas
Tubos de ensaye de 12X 75 mm
Una vez recibida la muestra de suero debe ser centrifugada durante 5 minutos a 3500
rpm.
Para la detección de glóbulos rojos sensibilizados in vitro
Este procedimiento puede ser utilizado para la detección e identificación de anticuerpos
inesperados y para pruebas de compatibilidad.
Cuando se prueban los glóbulos rojos con reactivos específicos para el uso de pruebas
de antiglobulina indirecta (incluyendo Anti-D en la prueba para D débil), realice la
prueba de acuerdo con el procedimiento explicado en el inserto para el uso del reactivo
en particular.
En el caso de las pruebas para la detección de anticuerpos inesperados, siga las
instrucciones dadas para los reactivos de glóbulos rojos o para cualquier aditivo que se
utilice.
En cualquiera de los casos revise estas instrucciones dadas para la fase de
antiglobulina.
Note que las células conocidas que tengan una prueba de antiglobulina directa positiva,
no pueden usarse en la prueba de antiglobulina indirecta.
3.- Añada una gota de la suspensión de células a cada tubo. Las células deben ser
lavadas por lo menos una vez y resuspenderse en salina fisiológica a una concentración
de 3-5%. El reactivo de glóbulos rojos se puede utilizar directamente del frasco.
Alternativamente pueden prepararse en la forma recomendada por el fabricante, o por
medio de un procedimiento que sea efectivo para el usuario. Si utiliza un procedimiento
de baja fuerza iónica en el que las células están resuspendidas en una solución de baja
fuerza iónica revise las instrucciones del fabricante, las cuales toman preferencia sobre
este paso.
4.- Si se utiliza un aditivo como Albúmina Bovina al 22% ó 30% un aditivo de baja
fuerza iónica, como Gamma LO-ION, Gamma PeG, añádalo de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Note que este paso no es aplicable si las células fueron
resuspendidas en la solución de Baja Fuerza Iónica (LISS) en el paso 3.
5.- Mezcle y centrifugue el tiempo apropiado a la calibración de la centrífuga
Nota: La fuerza centrífuga aplicada a las mezclas de suero y células es la mínima
requerida para producir un botón compacto de células y un sobrenadante claro. Una
centrifugación excesiva dificulta la resuspensión del botón de células, asimismo una
centrifugación inadecuada puede producir una aglutinación que se dispersa fácilmente.
Cada laboratorio debe calibrar sus propias centrífugas para determinar el tiempo óptimo
y velocidades de centrifugación para los diferentes sistemas de prueba.
Como una guía, un minuto a 1000 rpm, es usualmente adecuado tanto para pruebas con
salina rapida como con albúmina. A 3500 rpm las pruebas de solución salina fisiologica
0.9% usualmente requieren 15 segundos, mientras las pruebas de albúmina requieren 30
segundos por la mayor viscosidad de la mezcla de prueba.
7.- Resuspenda las células por medio de una agitación suave y registre el resultado.
8.- Incube las muestras con solución salina fisiólogica al 0.9% (si se realizaron) por 15
minutos a temperatura ambiente (23°C ± 3°C) y los otros tubos por 15 minutos (o de
acuerdo a las instrucciones del fabricante) a 37°C ± 1°C.
10.- Repita los pasos 6 y 7, registrando los resultados apropiadamente (ej “37°C salina”,
“37°C albúmina”, “37°C LO-ION”.
11.- Descarte los tubos etiquetados para las pruebas con solución salina fisiológica 0.9
% a temperatura ambiente si se realizaron.
12.- Lave las células de todos los tubos incubados a 37°C por lo menos 3 veces con los
tubos llenos de salina, teniendo cuidado de decantar la solucion salina fisiologica entre
los lavados y resuspender las células por completo cuando se le añada la solucion salina
fisiológica para la siguiente lavada.
16. Resuspenda las células mediante agitación suave, observar la aglutinación y registre
los resultados de la prueba.
Reporte de resultados
Los resultados obtenidos del equipo pueden ser capturados manualmente o transmitidos
al Sistema del paciente Ambulatorio (SIPAM) vía electrónica (interface) y son
validados y liberados por el Coordinador de Químico o el responsable de turno.
8.9 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍA
PROPÓSITO
ALCANCE
ANTECEDENTES
Los transplantes de Células Progenitoras Hematopoyéticas (CPH) se consideran, hoy
día, el tratamiento de elección para una gran variedad de enfermedades tanto malignas
como no malignas. El uso de estas en su forma autóloga tiene como objetivo restablecer
las funciones hematopoyéticas en pacientes sometidos a altas dosis de quimioterapia,
radioterapia, o ambas, y por tal motivo, la conservación de los precursores
hematopoyéticos a temperaturas bajas y en condiciones óptimas garantizan su
almacenamiento durante el tiempo que sea necesario, con la mínima pérdida de sus
capacidades de autorregulación y diferenciación.
Por lo anterior, los bancos de sangre o el Servicio de Medicina Transfusional son los
responsables de recolectarlas y procesarlas, y deberán de contar con manuales de
procedimientos actualizados para mantener un sistema de calidad, y asegurar que los
procedimientos, el almacenamiento y la distribución de los productos se ajusten a los
requerimientos y lineamientos internacionales para satisfacer las necesidades de
atención a los pacientes.
CHOQUE TÉRMICO
El choque térmico puede ocurrir cuando ciertas células son enfriadas repentinamente,
incluso en la ausencia de cristalización. El rango crítico oscila entre +15ºC y 0ºC,
aunque también puede ocurrir entre 0ºC y -80ºC. El choque térmico comienza en la
membrana como un resultado de:
Agentes crioprotectores
La presencia de ciertos fosfolípidos (fosfatidil serina)
Enfriamiento lento
Acondicionamiento previo en medios con alta concentración de sales.
UMBRAL DE DESHIDRATACIÓN
Congelamiento ideal
Incremento en la
velocidad de enfriamiento
AGENTES CRIOPROTECTORES
Una vez terminada la mezcla, se transfiere a una bolsa de congelamiento que debe estar
constituida por un material plástico no lipofílico (poliolefina o teflón-kapton) para evitar
el daño a las membranas celulares, y además debe de ser lo suficientemente resistente a
bajas temperaturas (-196ºC). La bolsa se introduce en un soporte de aluminio que
mantenga comprimidas ambas superficies, proporcionando así un espesor y forma
homogénea de la muestra que facilite un correcto intercambio de calor.
El programa de congelación puede variar, pero en términos generales debe incluir
primero una fase de estabilización a una temperatura de 4ºC, seguida de un descenso
constante de la misma a un ritmo de 1-2ºC/min. En el momento previo al punto
eutéctico, se debe inducir un descenso prolongado de la temperatura de la cámara para
compensar la liberación del calor latente de fusión.
Una vez superada la fase de transición, el ritmo de enfriamiento debe permanecer
constante entre 1-2 ºC/min.
Las células congeladas pueden almacenarse en un contenedor de N2 (l), en su fase
líquida, donde la temperatura se mantiene constante a –196ºC. Si la muestra se mantiene
en la fase gaseosa, la temperatura puede oscilar entre –100ºC y –140ºC.
OBSERVACIONES
1. Bata quirúrgica
2. Cubre bocas
3. Gorro quirúrgico
4. Guantes estériles
5. Campos estériles
6. Tijeras inoxidables estériles
7. Pinzas inoxidables estériles (Rocher)
8. Gasas estériles
9. Torundas de algodón (jabón, alcohol, isodine)
10. Alcohol isopropílico al 70%
11. Desinfectante (glutaraldehído, fenol al 5%, o formaldehído)
12. Isodine
13. Frascos estériles (100 mL) o matraz Elermeyer de 250 mL
14. Probeta graduada estéril (100 mL)
15. Acopladores para toma de muestras (Sampling Site Couplers, Fenwal 4C-2405)
16. DMSO estéril (Sigma, Cat D-2650) o USP (Sigma, Cat. D-1435)
17. Jeringas desechables estériles de 5, 10, y 20 mL
18. Agujas estériles del No. 18G
19. Bolsa criogénica de 250 mL (OriGen, Cryostore, Cat. CS 250n)
20. Casete de aluminio (Canister) para bolsa criogénica a 4ºC
21. Equipo para congelamiento controlado CrioMed Freezer
22. N2 (l) a baja presión
23. Guantes criogénicos
24. Frascos para hemocultivo y de hongos/micoplasma (pediátricos, 1-3 mL)
25. Tubos para Biometría Hemática (BH)
26. Hielo fräppe
27 Refrigerantes envueltos en papel
28. Azul Tripano al 0.4%
29. Cubre y porta objetos
30. Microscopio óptico
32. Sellador dieléctrico
33. Bolsas para desechos
34. Etiquetas de identificación
35. Crioviales estériles
36. Campana de Flujo Laminar
37. Depósito para almacenamiento con N2 (l)
38. Formato del material necesario para criopreservar CPH (Formato I)
39. Formato de registro del procedimiento para criopreservar CPH (Formato II)
40. Marcos metálicos (Racks) numerados N2 (l)
41. Diagrama del sitio de almacenamiento en el depósito de N2 (l)
42. Pipetas automáticas de 200 y 1000 μL
43. Puntas para pipetas automáticas de 200 y 1000 μL
44 Solución Salina Fisiológica 0.9%
9.5 ESPÉCIMEN A CRIOPRESERVAR
Pesar la bolsa que contienen las CPHSP al terminar su recolección. Restar el peso de la
bolsa vacía (bolsa transfer de 600 mL de equipo CobeSpectra = 32g; bolsa de
recolección de equipo CS-3000 = 25g) y dividir el resultado entre la densidad específica
de las CPH (d= 1.066) para obtener el volumen aproximado. Con este valor se puede
calcular la cantidad de bolsas criogénicas que serán necesarias para la criopreservación
de las células.
Ejemplo:
5 1 4
10 2 8
15 3 12
20 4 16
25 5 20
30 6 24
35 7 28
40 8 32
45 9 36
50 10 40
55 11 44
60 12 48
65 13 52
70 14 56
75 15 60
80 16 64
85 17 68
90 18 72
95 19 76
100 20 80
105 21 84
110 22 88
115 23 92
120 24 96
125 25 100
130 26 104
135 27 108
140 28 112
145 29 116
150 30 120
160 32 128
170 34 136
180 36 144
190 38 152
200 40 160
250 50 200
300 60 240
Anotar el volumen de la solución crioprotectora de cada bolsa criogénica en el
Formato del registro del procedimiento de criopreservación.
Anotar el volumen total de cada bolsa en el Formato del registro.
Colocar un reloj con alarma a los 30 minutos y otro a los 20 minutos.
A la alarma de los 20 minutos preparar la solución. Con la probeta estéril medir
la cantidad del plasma autólogo frío (a 4ºC) y depositarlo en un frasco estéril en
hielo. Con una jeringa de 20 mL tomar la cantidad necesaria de DMSO y
adicionar al plasma mezclando perfectamente para evitar desnaturalizar las
proteínas del plasma debido a la reacción exotérmica.
Iniciar el programa correspondiente del congelador programable y permitir que
se enfríe a 4ºC.
A la alarma de los 30 minutos tomar con una jeringa de 20 mL la cantidad
necesaria de la solución crioprotectora. Retirar la jeringa vacía de la suspensión
de CPH, con prontitud adicionarla en cada bolsa criogénica, empezando con la
bolsa control y posteriormente a las bolsas con las células, mezclar
perfectamente. Usar el émbolo de la jeringa para retirar la mayor cantidad
posible de aire y tomar aproximadamente 2.5 mL de la mezcla.
Colocar 0.5 mL en un criovial rotulado, 1 mL en el tubo de BH, rotulado
previamente como post-DMSO, para corroborar su viabilidad. Mantener el tubo
a 4ºC. Inocular 1 mL de la mezcla en el frasco de hemocultivo, rotular como
post-DMSO.
Sellar la línea de la bolsa criogénica que contiene la jeringa tres veces con un
sellador dieléctrico. Cortar con tijeras en medio de la línea sellada y desechar la
línea unida y la jeringa.
Secar rápidamente cada bolsa criogénica y colocarla dentro del canister
previamente enfriado a -20ºC; por ejemplo, colocar la bolsa #1 canister #1.
Cuando corte la línea sea cuidadoso en no dejar cualquier gota de CPH en el
área de sellado. La presencia de células en un extremo abierto de la línea
después del sellado debe de ser evitada ya que puede contaminar el N2 (l) en el
tanque de depósito. Ver observaciones para otras opciones para congelar las
bolsas criogénicas usando una prensa para congelamiento del equipo CryoMed
Freezer.
Colocar los canister y el criovial en la cámara de enfriamiento. Distribuir
individualmente los canister en una gradilla metálica para que se lleve a cabo el
proceso en las mismas condiciones del congelamiento.
Coloque la bolsa control dentro de un canister e inserte el sensor de la
temperatura en uno de los puertos de muestreo. Tener cuidado de no dejar aire
para evitar un registro inadecuado del proceso de congelamiento. Cerrar con
cuidado el canister para evitar maltratar el sensor de la temperatura, y colocarlo
en la gradilla metálica. Ver observaciones para otras opciones para congelar las
bolsas criogénicas usando una prensa para congelamiento del equipo CryoMed
Freezer.
Cerrar la puerta de la cámara de enfriamiento y oprimir el botón de RUN del
equipo. Registrar el programa utilizado para el congelamiento controlado y el
tiempo de inicio en el Formato del registro de procedimiento (formato II).
Al final del proceso de congelamiento presionar el botón stop para silenciar la
alarma del equipo. Registrar el tiempo final. (formato I).
Abrir la puerta de la cámara de enfriamiento, remover los canister y el criovial
de las CPH y colocarlos en el depósito de almacenamiento con N2 (l) en la fase
de líquida o de vapor. Anotar el No. del marco metálico (rack), la fase de
almacenamiento de N2 (l) y el sitio dentro del depósito de N2 (l) en el Formato
del registro del procedimiento de criopreservación , según el siguiente diagrama:
FIGURA 10. ESQUEMA DE LA LOCALIZACIÓN DENTRO DEL
CONTENEDOR DE N2 (l).
La curva apropiada del calor latente de fusión deberá de estar por debajo de 0ºC.
Cerrar la puerta de la cámara de enfriamiento y accionar el botón de calentamiento
(warm) para descongelar la cámara. Al terminar, retirar la bolsa control y almacenarla a
-20ºC y apagar el equipo de congelamiento.
Limpiar la campana de flujo laminar y tirar todo el material desechable en las bolsas
correspondientes.
9.8 PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR EL NO. DE CMN DE LAS CPH
MATERIAL REQUERIDO:
Portaobjetos
Microscopio óptico
Pipeta automática de 50 μL
Puntas para pipeta automática
Tubos de ensayo de 12 x 75 mm
Cámara de Neubauer
Cubreobjetos para cámara de Neubauer
REACTIVOS:
Azul de Tripano al 0.4 %
PROCEDIMIENTO:
Debido a que las CPH son recolectadas en un ambiente “abierto” y porque muchos de
los pasos de su procesamiento no pueden ser realizados en un sistema completamente
cerrado, hay numerosas oportunidades para la contaminación con microorganismos. Por
esto, se debe asumir un método estricto de asepsia que deberá de ser realizado en el área
de trabajo dentro de la campana de flujo laminar. Cultivos bacterianos y de hongos
deberán ser realizados en las diferentes etapas del procesamiento para determinar si
cualquiera de las técnicas y/o materiales en uso están comprometiendo la pureza de
estas.
PROCEDIMINETO:
Las células criopreservadas son descongeladas en un baño maría entre 37ºC y – 40ºC
inmediatamente antes de infundirlas y administrarlas a través de un catéter central.
Aunque la infusión de DMSO ha sido asociada con cierta toxicidad incluyendo nauseas,
vómitos, rubor, incremento en la frecuencia cardiaca y presión sanguínea, y elevación
de las transaminasas en suero, muchos investigadores creen que la manipulación de las
células descongeladas pueden provocar pérdida celular inaceptable.
MATERIAL NECESARIO:
Baño María
Cronómetro
Agua estéril
Solución desinfectante PRESEPT (Code Nr. SPW50, Johnson & Johnson)
Disolver una tableta de 5 g en 3 litros de agua
Alcohol al 70%
Fenol al 5 %
Refrigerantes
Tubos de vidrio de 12 x 75 mm
Frascos para Hemocultivo y Hongos
Microscopio Óptico
Porta y cubre objetos
Azul de tripano al 0.4%
Campos quirúrgicos
Contenedor de N2 (l) portátil
Ropa quirúrgica
Gasas estériles
Tijeras estériles
Acoplador para toma de muestra
Jeringas desechables estériles de 10 mL y 20 mL
Agujas estériles del calibre 18G
Torundas de alcohol e isodine
Guantes estériles
Cubre bocas
PROCEDIMIENTOS PREVIOS PARA DESCONGELAR LAS CPH
PROCEDIMIENTO:
FORMATO I
PREPARADO
1. Bata quirúrgica
2. Cubre bocas
3. Gorro quirúrgico
4. Guantes estériles
5. Campos estériles
6. Tijeras inoxidables estériles
7. Pinzas inoxidables estériles (Rocher)
8. Gasas chicas estériles
9. Torundas de algodón (jabón, alcohol, isodine)
10. Alcohol isopropílico al 70%
11. Desinfectante (glutaraldehído, fenol al 5%, o formaldehído)
12. Isodine
13. Frascos estériles (100 mL) o matraz Elermeyer de 250 mL
14. Probeta graduada estéril (100 mL)
15. Acopladores para toma de muestras (Sampling Site Couplers, Fenwal 4C-2405)
16. DMSO (Dimetilsulfóxido) USP (Sigma, Cat. D-1435) o estéril (Sigma, Cat
17. Jeringas desechables estériles de 5, 10, y 20 mL
18. Agujas estériles del No, 18G
19. Criobolsa de poliolefina o teflón de 250 mL o 500 mL
20. Canister para criobolsas de poliolefina a 4ºC
21. Equipo para congelamiento controlado Criomet
22. Nitrógeno líquido N2 (l) a baja presión (22 PSI dewars) criogénicos
24. Frascos para hemocultivo (pediátricos, 1-3 mL)
25. Tubos para Biometría Hemática
26. Hielo fräppe
27 Refrigerantes envueltos en papel
28. Azul Tripano al 0.4%
29. Cubre y porta objetos
30. Microscopio óptico
32. Grapas metálicas y rodillo
33. Sellador dieléctrico
34. Bolsas para desechos
35. Etiquetas de identificación
36. Crioviales estériles
37. Campana de Bioseguridad
38. Depósito para almacenamiento con Nitrógeno líquido
39. Formato del material necesario para criopreservar CPH (Formato I)
40. Formato de registro del procedimiento para criopreservar CPH (Formato II)
41. Racks numerados
42. Diagrama del sitio de almacenamiento en el depósito de N2 (l)
43. Pipetas automáticas de 200 μL y 1000 μL
44. Puntas desechables para pipetas automáticas de 200 y 1000 μL
45, Solución Salina Fisiológica
46. Conocer la ubicación del material y reactivos
47. Leer el manual de procedimientos
48. Leer las instrucciones sobre el uso de la bolsa criogénica
49. Contenedor para desechos punzo cortantes potencialmente infecciosos
50. Recipiente y bolsas para los desechos
51. Masking tape.
FECHA: _____________________________________________________________________
REGISTRO DEL PROCEDIMIENTO DE CRIOPRESERVACION DE CPH
FORMATO II
IDENTIDAD DE LA MUESTRA
CLASE DE RECOLECCIÓN
CRIOPRESERVACIÓN
Observaciones:
_____________________________________________________________________________
Médico Solicitante:
_____________________________________________________________________________
Realizó procedimiento:
_____________________________________________________________________________
Vo.Bo. Dr.
_____________________________________________________________________________
Fecha
_____________________________________________________________________________
REGISTRO DE LA TEMPERATURA Y NIVEL DE N2 (l) DEL CONTENDOR
FORMATO III
Nivel mínimo para cubrir los diferentes espacios de marco de aluminio (Rack) para bolsas de
500 mL:
Nivel A = 9 pulgadas; Nivel B = 16 pulgadas; Nivel C = 22 pulgadas; Nivel D = 28
pulgadas.
REGISTRO DEL NIVEL DE N2 (l) DE LOS CILINDROS INFRA
FORMATO IV
Fecha Hora Nivel Cambio Observaciones Fecha Hora Nivel Cambio Observaciones
9.14 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍAS
Boletín ISO 9001; 2000. I: Núm. 1, 2002. Hospital Universitario Dr. José
Eleuterio González, mayo.
Clark DA, et al. Medical schools and hospitals. Interdependence for service. J
Med Educ 1985; 60:22-38.
Freedman A., Gribben J., Neuberg D., et al 1996. High dose therapy and
autologous bone marrow transplantation in patients with follicular lymphoma
during firt remission. Blood 88: 278.
He Y, Wheatley K, Clark O, et al. 2003 Early versus deferred treatment for early
stage multiple myeloma. Cochrane Database Sits Rev (1): CD004023.
Rajkumar SV, Hayman S, Gertz MA, et al. 2002. Combination therapy with
thalidomide plus dexamethasone for newly diagnosed myeloma. J Clin Oncol 20
(21): 4319-23.