161 180

4/5/2019 4.
1 - Adhesión de Escherichia coli y Staphylococcus aureus a Polietileno y sus Resistencias a la Radiación Ultravioleta
Página 1
4,1 - adhesión de Escherichia coli y Staphylococcus aureus y su Polietileno

Resistencia a la radiación ultravioleta
Utilizando el modelo descrito anteriormente (Figura 16), Silva (2000) evaluó la
adhesión de microorganismos al polietileno de baja densidad y la resistencia de estos
microorganismos a la radiación ultravioleta, conforme Tabla 29.
Tabla 2 - Síntesis del experimento realizado por Silva (2000), que evaluó la adhesión de micror-
ganismos al polietileno de baja densidad y la resistencia de estos microorganismos a la radiación
ultravioleta
Formación de Biofilmios Bacterianos
Pruebas en Uso Simulado para la Evaluación de Procesos de Adh
11
cap.03
Page 2
A) Adhesión a la superficie
Tras la activación de las culturas de Escherichia coli K12 y Staphylococcus aureus ATCC
25923 caldo BHI (Brain Heart Infusion) dilución del inóculo en tampón fosfato, 0,31 M
y pH de 7,0 ± 0,1, las suspensiones se obtuvieron en concentraciones de 10 UFC.mL 10 4 -1 5
UFC.mL y 10 UFC.mL.
-1 -1 6
Las superficies internas de 72 envases de polietileno de baja densidad

fueron previamente sanitizadas con alcohol 70 ° GL y expuestas a la radiación ultravioleta
con una longitud de onda de 254 nm, por 1 min. A estos envases,
https://translate.googleusercontent.com/translate_f 1/14
4/5/2019 4.1 - Adhesión de Escherichia coli y Staphylococcus aureus a Polietileno y sus Resistencias a la Radiación Ultravioleta
se ramificaron
Higiene en 1.000 mL de la suspensión bacteriana. Después de la adición de las suspensiones,
loslaenvases
industria de alimentos
se sellaron térmicamente en la selladora TecnoB, modelo S300, y
incubadas en invernaderos tipo BOD, modelo 50A14, a temperaturas de 8 ° C y 18 ° C
12 h, para permitir la adhesión bacteriana.
Después de 12 h de incubación a temperaturas de 8 ° C y 18 ° C, los envases

pasaron por los siguientes procedimientos: i) el tampón empleado en la inoculación de la
el envase se ha salido, y en el embalaje se añadieron 1.000 ml de tampón-
fosfato esterilizado, pH 7,0 ± 0,1, siendo el envase dejado en reposo por 1
Nélio José de Andrade
para la retirada de las células planctónicas; ii) se ha caído el tapón, el envase se ha
rinsada, empleando la agitación manual vigorosa durante 90 segundos, con 100 mL de
tampón-fosfato esterilizado, para la retirada de las células sésiles. Después del rinsaje, los
Los tampones que contienen las células sésiles se diluyen según sea necesario
las alícuotas de estas diluciones plaqueadas, en profundidad, en PCA; iii) las placas
de Petri, después de la solidificación, fueron invertidas e incubadas a una temperatura de 35 ° C
12 por 24 horas, para determinar el número de células adheridas al envase. la
Los resultados se expresaron como UFC.cm -2.
Se observa a partir de las Tablas 30 y 31, que S. aureus y E. coli mostraron capaci-
de adherirse al polietileno de baja densidad en diferentes temperaturas de adherencia,
son y desde diferentes números iniciales de células. Dependiendo del número inicial
de los microorganismos en suspensión, el porcentaje de adhesión a S. aureus varió de
0,009% a 0,106% a 8 ° C y de 0,036% a 0,107% a 18 ° C. En E. coli, el porcentaje
de adhesión varió de 0,001% a 0,006% a 8 ° C y de 0,002% a 0,028%, a 18 ° C.
El número de células por cm no adherido incluye un proceso de for-
2
mación de biopelículas, ya que los valores de este debe estar entre 10 UFC.cm
06:10 7 -2.
Los bajos valores que se encuentran en el experimento con S. aureus y E. coli, cuando se compara
parados con los resultados anteriormente mencionados en acero inoxidable, pueden
explicados por las diferentes características de las superficies de adhesión y las diferencias
entre las células vegetativas y las esporas bacterianas. La adhesión de esporas es facilitada por la
su alta hidrofobicidad, además de la interacción que ocurre entre los constituyentes químicos
de la capa de las esporas con las superficies.
Page 3
Tabla 30 - porcentaje UFC.cm y Staphylococcus aureus ATCC 23 2 ° C y se adhirieron a

-2
1 ° C, polietileno de baja densidad, debido a que el logaritmo del número inicial (UFC.mL -1)
en la suspensión

Tabla 31 - UFC.cm porcentaje y Escherichia coli K12 se adhirió a ° C y 1 ° C en Polietilenos
-2
de baja densidad, debido a que el logaritmo del número inicial (UFC.mL en suspensión
-1)
En las Figuras 17 y 18 se muestra el logaritmo de células adheridas, en razón del

log del número de partida de células de S. aureus y E. coli, respectivamente, a
temperaturas de 8 ° C y 18 ° C.
13
Figura 17 - Efecto de la temperatura de 8 ° C y 18 ° C en el número de células adheridas de Staphylococcus aureus

ATCC 25923, en función del logaritmo del número inicial de células. Media de tres repeticiones.
cap.03
Page 4
Higiene en la industria de alimentos
Figura 18 - Efecto de la temperatura de 8 ° C y 18 ° C en el número de células adheridas de Escherichia coli K12

en función del logaritmo del número inicial de células. Media de tres repeticiones.
Los resultados demuestran que el aumento en la temperatura de 8 ° C a 18 ° C fue
responsable de una mayor adhesión bacteriana al polietileno, ya que la temperatura
es fundamental para el desarrollo de los microorganismos. En las temperaturas ex-
las alturas, bajas o altas, ocurre inactivación de enzimas y otras estructuras funcionales
de la célula, como las membranas (MOAT, FOSTER, 1995). A 18 ° C, los microorganismos
se encuentran más cerca del rango de temperatura óptima para el crecimiento, ya
que ambos son mesofílicos, ocurriendo, así, aumento en el crecimiento microbiano
y una producción de exopolisacáridos probablemente mayor, elevando, por lo tanto, el
14 número de células adheridas.
Al comparar los valores de adhesión de los microorganismos empleados en este ex-
perimento, hubo una mayor tendencia de adhesión de las células de S. aureus. A 8 ° C,
la adhesión de S. aureus en concentraciones iniciales de 10 UFC.mL 10 y 10 UFC.mL
5 -1 6 -1 6
-1UFC.mL fue, respectivamente, 2,8; 9,0; y 106 veces mayor que la adhesión de las células
E. coli. A la temperatura de 18 ° C los valores encontrados fueron, respectivamente,
de 5,4; 18,0; y 3,8.
B) Acción de la radiación ultravioleta en las células adheridas
Después de la adhesión de los microorganismos en el envase de polietileno, el tampón

de inoculación fue retirado. A continuación, se añadieron 1.000 mL de tampón-fosfato
esterilizado, pH 7,0 ± 0,1, al embalaje, quedando en reposo durante 1 min,
para la retirada de las células planctónicas. Una vez transcurrido el tiempo, el tampón se ha salido, y
las superficies internas del envase se sometieron a la radiación UV por aproxi-
de dos segundos, empleando el modelo ya descrito. Antes del inicio
Page 5
del experimento, la lámpara permaneció ligada por 30 min, para estabilización de la

emisión de la luz. Después de ese intervalo de tiempo, la parte interna de los envases fue
sometida a la exposición a la radiación UV. Se añadieron 100 mL de tampón-fosfato
esterilizado, 0,31 M, a pH 7,0 ± 0,1, a los envases irradiados y agitado,
samente durante 90 segundos, para la recuperación de las células que resistieron al tiempo de
exposición a la radiación ultravioleta.
Después del rinsaje, los tampones se diluyeron según sea necesario,

las diluciones plaqueadas en profundidad, en PCA, e incubadas a 35 ° C por 24 h,
los resultados se expresan en UFC.cm -2. Formación de Biofilmios Bacterianos
La eficiencia de la radiación UV se determinó mediante reducciones decimales

(DR), utilizando la siguiente fórmula: DR = log n - log n, donde n = número
a0 1 0
CFU adhiere a polietileno por cm antes del uso de la radiación ultravioleta; en =

2 1
CFU adhiere a polietileno por cm después del uso de la radiación ultravioleta.

2
La intensidad de la radiación ultravioleta, expresada en μW.cm emitido por

-2
la lámpara, se determinó cada 50 h, hasta completar el total de 1.500 h de uso. la

la eficiencia bactericida de la lámpara se determinó en tres diferentes tiempos: inicial Pruebas en Uso Simulado para la Evaluación de Procesos de Adh
(T70); después de 800 h de uso (T800); y con 1.500 h de uso (T1500), empleándose los
procedimientos descritos anteriormente. También se determinó la contaminación
inicial de aerobios mesófilos en los envases, empleándose la técnica de Número
Más probable (NMP), con tres series de cinco tubos, con el uso de volúmenes
10 mL, 1 mL y 0,1 mL, según la metodología descrita por Greenberg et al. (1992).
Se analizaron al azar muestras de polietileno de baja densidad provenien- 1
de tres bobinas, antes y después de la exposición a la radiación UV. De cada bobina
3.780 cm se analizaron, en referencia al área de seis envases 630 cm y
2 2
capacidad para 1.000 mL. De estos envases, tres no se expusieron a la radiación

UV, y otras tres lo fueron, en condiciones de llenado de leche en un lácteo. para
la retirada de las células presentes en la superficie interna, se añadieron 100 mL de
tampón-fosfato esterilizado y pH igual a 7,0 0,1. El rinsaje fue efectuado por medio
de agitación manual vigorosa por 90 seg. Después del rinsaje, se procedió a la dilución
de esta solución ya la posterior distribución en tres series de cinco tubos (18 x 150 mm)
de ensayo, con capacidad para 15 mL, conteniendo 10 mL de caldo BHI; la primera
la serie de tubos presentaba concentración doble del medio de cultivo y las demás sé-
, una concentración simple. Se utilizaron volúmenes de 10 mL, 1,0 mL y 0,1 mL de la dosis
solución de rinsaje de los envases. Las series de tubos se llevaron a la incubación
en invernadero a 35 ° C, por 24 h.
En posesión de la combinación formada por el número de tubos positivos en cada uno

dilución y con la ayuda de tabla apropiada, se determinaron los valores de
cap.03
Page 6
NMP.100 ml que corresponde a 630 cm de la superficie interior del paquete,

-1, 2
con un 95% de probabilidad. En la Tabla 32 se muestran los números de reducciones

de decimales en la población de los microorganismos, así como los respectivos valores de
intensidades de radiación estimadas para S. aureus y E. coli expuestas a la radiación
UV durante 2 segundos. Durante el experimento, el tiempo de uso de la lámpara UV fue
alrededor de 20 h, cuando la intensidad disminuyó 216-175 μW.cm Así, para
-2.
estimar la variación de la intensidad de la radiación UV, mostrada en la Tabla 32, se utilizó

la ecuación de regresión polinomial, conforme Figura 19.
Tabla 32 - logaritmo de la cantidad de valores de Staphylococcus aureus y Escherichia coli

reducciones
Higiene en la industriadecimales (RD) después de 2 segundos de contacto e intensidad de radiación UV
de alimentos
1
Se observó que la radiación UV reduce el número de células adheridas a la super-

del polietileno de baja densidad. En E. coli, las reducciones medias decimales
de los cuales se observó un aumento de la concentración de 0,52 a 1,37. En el caso de S. aureus, los valores fueron de entre 0,85
y 1,73. Se constató que hay diferencia en la acción de la radiación UV en diferentes con-
centrales iniciales de células adheridas al polietileno de baja densidad y entre los
microorganismos estudiados.
Page 7
Figura 19 - Disminución de la intensidad de radiación UV en las primeras 70 horas de uso de la lámpara germicida.
Tomar nota de que, en el experimento con S. aureus, hubo una reducción de las intensidades
radiación UV de 216 a 179 μW.cm E. coli y la disminución fue 203
-2
175 μW.cm Sin embargo, no hubo grandes variaciones en la intensidad ni

-2.
en el número de RD, en las repeticiones, cuando se evaluó el efecto de los números iniciales.
Por ejemplo, la diferencia máxima intensidad (7 μW.cm se observó en S.
-2)
aureus cuando los logaritmos del número inicial fue de 4,5; 4,6; y 4,7. Ya en E. coli Pruebas en Uso Simulado para la Evaluación de Procesos de Adh
no hubo diferencia en la intensidad cuando los logaritmos del número inicial eran
de 7,2; 7,8; y 7,6.
Suponiendo que las variaciones 216-179 y μW.cm 203-175 μW.cm

-2 -2
no son expresivas, se observó una tendencia de aumento en el número de reducciones

de decimales cuando el número inicial de bacterias en la suspensión de adhesión al polieti-
1
leno se ha incrementado.
Con el aumento del logaritmo del número inicial de células, se observó tam-
el aumento en el número de células adheridas, lo que parece haber influenciado la acción
de la radiación UV. Por ejemplo, en números menores de adhesión los microorganismos
pueden presentar mejor distribución en la superficie, alojándose en grietas o lo-
en el caso de las aguas de difícil acceso a la radiación, en virtud de su topografía,
su eficiencia. Como la superficie, probablemente, presenta una capacidad limitada de
protección de las bacterias, la acción de la radiación UV será más eficiente proporcionalmente
cuando la superficie presenta mayor número de bacterias adheridas.
Para facilitar las comparaciones sobre la resistencia de los microorganismos, ya que

los logaritmos de los números iniciales eran diferentes en el experimento,
gónadas la ecuación de regresión lineal de S. aureus y E. coli (Figuras 20 y 21),
obteniéndose, de esa forma, los valores presentados en la Tabla 33.
cap.03
Page 8

Figura 20 - Regresión lineal de reducciones decimales en función del logaritmo de número inicial de
Staphylococcus aureus ATCC 25933 después de 2 segundos de exposición UV.
1 Figura 21 - regresión lineal de reducciones logarítmicas en función del número inicial de Escherichia logaritmo
coli K12, después de 2 segundos de exposición UV.
número decimal reducciones estimado de células de Staphylococcus aureus ATCC - Tabla 33

2 23 Escherichia coli K12 y después de la exposición a la radiación ultravioleta 21-1 μW.cm,
-2
durante 2 segundos, debido al número inicial de células adheridas al polietileno de baja

densidad, obtenidas a partir de las respectivas regresiones lineales
Page 9
Se puede observar que, en E. coli, donde estaba el logaritmo de la concentración inicial

igual a 5, el valor de RD fue de 0,46; para un logaritmo de la concentración igual a 6,8, de
1.09. Para las células de S. aureus, los valores de RD obtuvieron en las mismas concentraciones
las iniciales fueron, respectivamente, de 1,02 y 1,70. Estos resultados muestran que las cere-
células de E. coli se adhirieron al polietileno, tienen una mayor capacidad de sobrevivir
exposición a la radiación UV, en comparación con S. aureus.
Aunque la radiación ultravioleta presenta actividad bactericida en los microorganismos,
se adhieren a la superficie del polietileno, las reducciones obtenidas se encuentran a continuación
de los valores de tres ciclos logarítmicos recomendados en literatura para sanitizantes Formación de Biofilmios Bacterianos
químicos y físicos en la inactivación de células adheridas (MOSTELLER, BISHOP, 1993).
Sin embargo, no hay duda de que la radiación UV es un tratamiento auxiliar útil en
control de la contaminación microbiológica de envases de polietileno.
La comparación de los resultados obtenidos con la literatura se ve dificultada porque
varios factores pueden interferir en la acción bactericida de la radiación UV. Dentre ellos,
se incluyen el tiempo de exposición, la intensidad de radiación empleada, la dis-
de la fuente irradiadora a la superficie, la morfología microbiana, la capacidad de
adhesión del microorganismo, el estado físico de las células y el tipo de superficie donde
se encuentra el microorganismo.
En este experimento, la resistencia de las células vegetativas está asociada a la adherencia,

son a la superficie. Por ejemplo, una encuesta mostró la reducción de 6,3 ciclos loga-
para las células typhimurium rítmicos en suspensión, utilizando el
620 intensidad μW.cm en un intervalo de tiempo de 15 seg (Kuo et al., 1997).
-2
En esa misma intensidad, cuando el experimento fue conducido con las células en el mismo 1
el estado sésil, previamente adheridas en cáscara de huevo, se obtuvo una reducción de tres ci-
clos logarítmicos para 1 min de exposición de las células a la radiación UV. En otro expe-
se obtuvieron cinco ciclos logarítmicos de reducción del número de células
E. coli suspensión, utilizando 300.000 μW.cm para 2,5 seg (Bachmann,
-2
1975). Esto ocurre debido a la mayor susceptibilidad de las células en suspensión a

acción de la radiación UV. En el caso de las células adheridas a la superficie, los valores de reducción
son menores, pues las células se presentan fijadas a la superficie por medio de
los exopolisacáridos, dificultando así la acción de la radiación UV debido a su bajo
poder de penetración.
Se debe considerar, además, la topografía de la superficie donde las células se encuentran
se adhieren, pues la radiación UV tiene pequeño poder de penetración, siendo su
acción restringida a la superficie. De este modo, cáscara de huevo, superficie de carnes y carcajada,
de polietileno y acero inoxidable presentan diferentes tipos de superficies,
con las más variadas irregularidades, que pueden proteger las células del contacto
directamente con la radiación UV, disminuyendo así su acción bactericida.
cap.03
Page 10
C) Reducción de la intensidad de radiación UV en comparación con la eficiencia bactericida
Figura 22 ilustra la reducción en la intensidad de la radiación UV con el tiempo de uso de la radiación UV

lámpara fluorescente germicida comercial de 15 W. Se observa, en esta figura, descrédito,
el acentuado en la intensidad de la radiación UV en las primeras 100 y la pérdida del 39,5%
intensidad emitida por la lámpara en el rango de longitud de onda entre 240 y 260 nm.
Esta caída brusca en las 100 primeras horas de uso también fue relatada por Flückiger
(1995), al analizar una lámpara germicida BBC disponible en el mercado.

Figura 22 - Reducción de la intensidad de la radiación UV con el tiempo de uso.
En la Tabla 34, se observan las reducciones decimales obtenidas después de la exposición por 2
Segundos a células de radiación UV de S. aureus y E. coli en tres momentos diferentes
de uso de la lámpara.
Tabla 34 - Influencia de la disminución de la intensidad de la radiación UV en la eficiencia bactericida

10 Las células de Staphylococcus aureus ATCC 2 y 23 Escherichia coli K12 adherido intencionados
nicamente la polietileno de baja densidad
Después de 1.500 horas de uso, el número de reducciones decimales en células de E. coli

adheridas a la superficie del polietileno fue de 0,94 a 0,36. En S. aureus, el número
redujo de 1,04 a 0,58. Esto representa una efectividad 2,6 veces menor en la ina-
células de E. coli tivação E. y células de S. aureus 1.8x S. después de transcurrido
1.500 h de uso. Así, como se esperaba, la vida útil de la lámpara germicida es dependiente
diente de la reducción en la intensidad con el tiempo de uso. Además, se constató que
células de E. coli son más resistentes a la radiación UV de S. aureus. Flückiger
(1995) sugiere una vida útil de 1.200 ha 1.500 h para lámparas UV comerciales.
Page 11
Las Figuras 23 y 24 muestran la relación entre el logaritmo de los valores de RD y la

intensidad UV S. aureus y E. coli, respectivamente.
Figura 23 - Relación entre el logaritmo del tiempo para 1 RD y la intensidad de radiación UV en células de
Staphylococcus ATCC 25.923.
11
Figura 24 - Relación entre el logaritmo del tiempo para 1 RD y la intensidad de radiación UV en células de
Escherichia coli K12.
D) Evaluación de la radiación ultravioleta en condiciones de uso
En la Tabla 35 se presentan los valores de logaritmo del NMP / embalaje

(630 cm de microorganismos mesófilos en bolsas de polietileno antes y de-
2)
de la irradiación con ultravioleta.
cap.03
Page 12
Tabla 3 - Logaritmos de los números de microorganismos mesófilos en los envases de polie-

tileno, antes y después de la exposición a la radiación UV, en condiciones de uso, determinados por la
técnica de número más probable (NMP)
Higiene en la Los resultados

industria muestran la existencia de una determinada contaminación microbio-
de alimentos
lógica inicial en los envases. En este experimento, el valor medio de contaminación
encontrado en el embalaje antes de la exposición UV fue 0,16 NMP.cm -2,
está
la por encima
irradiación dedel
las valor recomendado,
superficies interioresque
de es
los0,10 NMP.cm
envases Sin embargo, después
por aproximadamente
-2.
2 segundos,
La supervivencia se observó 0.014 NMP.cm lo que significa reducción decimal
-2,
1,06, es decir, cerca del 90% de las células contaminantes no sobrevivieron a la acción
Nélio José
radiación
de Andrade
UV.
En el llenado de la leche, el riesgo de contaminación es igual a la suma de los riesgos de cada uno
etapa del proceso, siendo, así, indispensable el control riguroso de esas etapas
(FLÜCKIGER, 1995). La efectividad en la reducción del número inicial de bacterias anteriores
al embalaje del alimento es un punto importante en la prolongación de su vida de
(HUANG, TOLEDO, 1982), así como en la preservación de las características
12 sensorial e higiénico-sanitario del producto.
E) Topografía de la Superficie de Polietileno de Baja Densidad
Fue empleado microscopio de fuerza atómica (AFM) con la técnica de modo de grabación.
En esta técnica, una punta, con radio de curvatura entre 5 y 10 nm, está conectada a un
el oscilador piezoeléctrico, siendo forzada a vibrar cerca de su frecuencia de resonancia,
cia, tocando la superficie de la muestra cerca de 500 veces por punto de medida. la
las medidas de cambios en la frecuencia de vibración, cuando la altura de la muestra varía,
son traducidas por software, produciendo la imagen de la muestra. Esta técnica per-
mite obtener alta resolución espacial, y, una vez que la punta no queda todo el tiempo en
contacto con la muestra, el riesgo de deformación de la muestra por la punta es minimizado
(STRAUSSER, HEATON, 1994).
Al visualizar la superficie del polietileno por microscopía de fuerza atómica (MFA),

se observaron dos diferentes tipos de superficie, uno relativamente liso y otro con
puntos de referencia. En las Figuras 26 y 27 se muestra la topografía de la superficie de
polietileno de baja densidad, observada por la microscopía de fuerza atómica (MFA).
Page 13
El tipo de superficie presentada en la Figura 27 representa alrededor del 50% del área total
analizada.
Figura 26 - Fotomicrografía de la superficie de polietileno representativa de las regiones relativamente lisas,

obtenida por la microscopía de fuerza atómica.
13
Figura 27 - Fotomicrografía de la superficie de polietileno mostrando ranuras y elevaciones, obtenida por la

microscopía de fuerza atómica.
cap.03
Page 14
La presencia de rugosidades y contornos en el material del embalaje origina

sombras que reducen la efectividad de la radiación UV, ya que el efecto bactericida
se produce sólo en la dirección del haz de luz (HUANG, TOLEDO, 1982).
Se observa, en la Figura 26, que la rugosidad media encontrada es de 50 nm,
que se considera una superficie relativamente plana. En la superficie,
en la Figura 27 se observan imperfecciones de 5 μm de diámetro y 0,2 μm de profundidad,
dad. Mientras que las células de S. aureus y E. coli tienen dimensiones
0,5-1,5 μm de diámetro y 1,1-1,5 x 2,0-6,0 μm, respectivamente, las imperfecciones de la
superficie pueden proteger estos microorganismos del contacto directo con la radiación
UV, reduciendo su eficiencia.
Por medio de la topografía del polietileno por MFA, se puede mostrar irregularida-
en la superficie que permiten el alojamiento de bacterias, facilitando el proceso
de adhesión, además de dificultar el proceso de inactivación microbiana de células adherentes,
de las, por medio del uso de la radiación UV. Estas irregularidades pueden impedir la acción
de la radiación UV por medio de la protección de estos microorganismos en grietas y
presencia de elevaciones, que pueden impedir el contacto directo del microorganismo con
Nélio José
la de Andrade
radiación UV.
4,2 - sporothermodurans Adhesión Bacillus al polietileno y su resistencia

a la radiación ultravioleta
Con el mismo modelo que se muestra en la Figura 17, Cabral y colaboradores,

liaram la acción de la radiación ultravioleta sobre sporothermodurans esporas de Bacillus
14 (Tabla 36). Las esporas de estos microorganismos se adhirieron a la superficie de polietileno
de baja densidad en valores que varían entre 2,10 y 6,10%, cuando las empa-
envases se llenaron con las suspensiones que contienen 10 esporos.mL Este hecho es
5 -1.
es importante, considerando que esta espora es resistente al tratamiento térmico

de UHT y que en el embalaje usado para ese producto hay una capa interna de
polietileno de baja densidad.
Adhesión de las Esporas a la superficie

Después de que las suspensiones concentradas de esporas de Bacillus se obtienen
sporothermodurans de células vegetativas se prepararon 1000 ml
suspensiones que contienen 10 esporos.mL en agua destilada estéril, en consecuencia
5 -1
de modo que la suspensión de la inoculación. A continuación, los microorganismos-

se adhirieron a la superficie de polietileno, utilizando bolsas de polietileno con
volumen de 1.000 mL. En los envases se añadieron 1.000 mL de la suspensión,
y estas fueron selladas e incubadas.
Page 15
Tabla 3 - Síntesis de experimento realizado por Cabral y colaboradores (2001) que evaluaron
la eficiencia de la radiación UV sobre las esporas bacterianas
Después del tiempo de incubación, los envases pasaron por los siguientes procedimientos
: i) el tapón empleado en la inoculación del envase se ha desprendido; ii) la empa-
se añadieron 1.000 ml de agua destilada esterilizada, siendo el envase
dejada en reposo por 1 min para la remoción de las esporas que no se adhirieron
superficie del polietileno; iii) después del flujo del tampón, el envase se ha rinsado
y agitada vigorosamente, durante 90 segundos, para la retirada de las esporas adheridas
la superficie del polietileno con 100 mL de tampón fosfato (0,31 M, pH 7,0 +/- 0,1,
rilizado a 121 ° C durante 30 min) iv) después del rinsaje, las soluciones tampón se diluyeron
según sea necesario y plaqueados empleando el medio Agar BHI, incubados a 37 ° C
por 48 horas para la determinación del número de esporas adheridas al envase.
cap.03
Page 16
Acción Esporicida de la Radiación Ultravioleta

Después del procedimiento de adhesión, la superficie externa de una parte de las
los balastos fueron sometidos a la radiación ultravioleta. Para ello fueron necesarios algunos
procedimientos: i) se retiró el tapón de inoculación, añadiéndose 1.000 mL
de solución tampón fosfato esterilizada, quedando en reposo por 1 min para la retirada,
de las esporas no adheridas; ii) se desprendió el tapón y las superficies internas
del envase sometidos a la radiación UV durante 2 segundos; iii) los envases ir-
se han añadido 100 ml de tampón-fosfato esterilizado, pasando por
agitación vigorosa durante 90 segundos, para la remoción de las esporas adheridas; iv)
después del riñón, los tampones-fosfato se diluyeron según sea necesario,
Higiene en la industria
estas dilucionesdeplaqueadas
alimentos en BHI, incubadas a 37 ° C por 48 h, para la determinación
del número de esporas que resistieron al tratamiento con radiación ultravioleta; y
v) se determinó la eficiencia de la radiación UV por medio del número de Reducciones
Decimales (RD) en la población de esporas en la superficie de polietileno, antes y después
del uso de la UV, en la que: RD = registro del número de esporas adheridas al polietileno por
cm antes de su uso UV - log número de esporas adheridas a polietileno por cm
2 2
después del uso de la UV.

Los sporothermodurans esporas de Bacillus adheridas a la superficie de polietileno
de baja densidad (PEBD) en valores que oscilaron del 2,10% al 6,10%, cuando
Se añadieron suspensiones que contienen 10 esporos.mL en el embalaje. Se ha encontrado,
5 -1
por los resultados observados en la Tabla 38, la acción de la radiación ultravioleta a 102 W.
cm de esporas de B. sporothermodurans polietileno adherido a baja den-
-2
sidad, normalmente utilizados en envases de leche. Como se esperaba, se verificó

1 una tendencia al aumento de la eficiencia, en cuanto al número de reducciones decimales,
de la radiación ultravioleta sobre esporas cuando se aumenta el tiempo de exposición de la
embalaje al sanitizante físico.
Cuando se comparan las células vegetales adheridas a polietileno de baja densidad,
dad, las esporas de B. sporothermodurans tiene considerablemente la fuerza
es mayor a la radiación ultravioleta.
Las esporas de B. sporothermodurans unidos a polietileno de baja densidad
presentan una mayor resistencia a la radiación cuando se comparan con las esporas de
sporothermodurans B suspendieron en medio de cultivo. Esta mayor resistencia,
se debe velar por el hecho de que la superficie del plástico es bastante irregular, como
se puede observar en la Figura 28, y las esporas adheridas a esa superficie pueden quedar
protegidos de la radiación ultravioleta por estas irregularidades.
A diferencia de lo esperado, los valores de D, que corresponden al tiempo de
exposición del envase a la radiación ultravioleta necesaria para que ocurra 1RD en el
número inicial de esporas adheridas al polietileno de baja densidad, en los tiempos
de 2, 10, 20 y 25 segundos de exposición a la radiación ultravioleta, fueron diferentes (Tabla
Page 17
37 y Figura 28). Una explicación posible es que a medida que aumenta el tiempo de
la exposición, las esporas que sobreviven son las más resistentes. Se sabe que en una
la población de esporas la resistencia no es homogénea, conteniendo algunos más y otros
menos resistentes. Así, si el tiempo de exposición del envase a la radiación ultra-
se incrementará la eficacia sanitizante proporcionalmente menor.
Tabla 3 - Acción esporicida de 102 m W.cm 2 a 4 nm radiación ultravioleta después de la hora

-2,
de contacto diferente en sporothermodurans esporas de Bacillus adherido en polietileno

baja densidad, después de contacto de 12 ha 1 ° C, con inóculo inicial de 10 esporos.mL -1
Tabla 3 - Acción esporicida de 102 m W.cm 2 a 4 nm, la radiación ultravioleta para 2

-2,
segundos más de las esporas de polietileno unido Bacillus sporothermodurans a baja densi-
dad, después de 12 h de contacto 1 ° C con un inóculo inicial de 10 esporos.mL
4 -1
Figura 28 - reducciones decimales (RD) en la población de Bacillus sporothemodurans a causa del tiempo
exposición a la radiación ultravioleta.
cap.03
Page 18
En la Figura 29 se muestra la ecuación de regresión lineal de los valores de D obtenidos,

de acuerdo con el tiempo de exposición a la radiación ultravioleta. Por ejemplo, si
el tiempo de exposición de esta radiación en las condiciones del experimento es de 8 segundos,
se estima que el valor D será de 7,9 segundos.

Figura 29 - valor D para la población de Bacillus sporothemodurans debido a la exposición a la radiación
Ultravioleta.
. conclusión
El desarrollo de sistemas, que simule en el laboratorio las condiciones reales

1 del procesamiento de alimentos, cuando están bien elaborados, puede ofrecer subsidios
para una evaluación de los factores que afectan la adhesión bacteriana, como las etapas del
procedimiento de higienización; tipos de detergentes y sanitizantes; concentración
pH, temperatura y flujo de las soluciones de higienización; especies microbianas y su-
de las fracturas, entre otros.
Page 19
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4/5/2019 4.

4,1 - adhesión de Escherichia coli y Staphylococcus aureus y su Polietileno

Formación de Biofilmios Bacterianos

Pruebas en Uso Simulado para la Evaluación de Procesos de Adh

Las superficies internas de 72 envases de polietileno de baja densidad

Después de 12 h de incubación a temperaturas de 8 ° C y 18 ° C, los envases

Tabla 30 - porcentaje UFC.cm y Staphylococcus aureus ATCC 23 2 ° C y se adhirieron a

Formación de Biofilmios Bacterianos

Pruebas en Uso Simulado para la Evaluación de Procesos de Adh

En las Figuras 17 y 18 se muestra el logaritmo de células adheridas, en razón del

Figura 17 - Efecto de la temperatura de 8 ° C y 18 ° C en el número de células adheridas de Staphylococcus aureus

Higiene en la industria de alimentos

Figura 18 - Efecto de la temperatura de 8 ° C y 18 ° C en el número de células adheridas de Escherichia coli K12

B) Acción de la radiación ultravioleta en las células adheridas

Después de la adhesión de los microorganismos en el envase de polietileno, el tampón

del experimento, la lámpara permaneció ligada por 30 min, para estabilización de la

Después del rinsaje, los tampones se diluyeron según sea necesario,

La eficiencia de la radiación UV se determinó mediante reducciones decimales

CFU adhiere a polietileno por cm antes del uso de la radiación ultravioleta; en =

CFU adhiere a polietileno por cm después del uso de la radiación ultravioleta.

La intensidad de la radiación ultravioleta, expresada en μW.cm emitido por

la lámpara, se determinó cada 50 h, hasta completar el total de 1.500 h de uso. la

capacidad para 1.000 mL. De estos envases, tres no se expusieron a la radiación

En posesión de la combinación formada por el número de tubos positivos en cada uno

NMP.100 ml que corresponde a 630 cm de la superficie interior del paquete,

con un 95% de probabilidad. En la Tabla 32 se muestran los números de reducciones

estimar la variación de la intensidad de la radiación UV, mostrada en la Tabla 32, se utilizó

Tabla 32 - logaritmo de la cantidad de valores de Staphylococcus aureus y Escherichia coli

Nélio José de Andrade

Se observó que la radiación UV reduce el número de células adheridas a la super-

Formación de Biofilmios Bacterianos

175 μW.cm Sin embargo, no hubo grandes variaciones en la intensidad ni

Suponiendo que las variaciones 216-179 y μW.cm 203-175 μW.cm

no son expresivas, se observó una tendencia de aumento en el número de reducciones

Para facilitar las comparaciones sobre la resistencia de los microorganismos, ya que

Higiene en la industria de alimentos

Nélio José de Andrade

número decimal reducciones estimado de células de Staphylococcus aureus ATCC - Tabla 33

durante 2 segundos, debido al número inicial de células adheridas al polietileno de baja

Se puede observar que, en E. coli, donde estaba el logaritmo de la concentración inicial

En este experimento, la resistencia de las células vegetativas está asociada a la adherencia,

1975). Esto ocurre debido a la mayor susceptibilidad de las células en suspensión a

C) Reducción de la intensidad de radiación UV en comparación con la eficiencia bactericida

Figura 22 ilustra la reducción en la intensidad de la radiación UV con el tiempo de uso de la radiación UV

Higiene en la industria de alimentos

Nélio José de Andrade

Tabla 34 - Influencia de la disminución de la intensidad de la radiación UV en la eficiencia bactericida

Después de 1.500 horas de uso, el número de reducciones decimales en células de E. coli

Las Figuras 23 y 24 muestran la relación entre el logaritmo de los valores de RD y la

Formación de Biofilmios Bacterianos

D) Evaluación de la radiación ultravioleta en condiciones de uso

En la Tabla 35 se presentan los valores de logaritmo del NMP / embalaje

de la irradiación con ultravioleta.

Tabla 3 - Logaritmos de los números de microorganismos mesófilos en los envases de polie-

Higiene en la Los resultados

E) Topografía de la Superficie de Polietileno de Baja Densidad

Al visualizar la superficie del polietileno por microscopía de fuerza atómica (MFA),

Formación de Biofilmios Bacterianos

Pruebas en Uso Simulado para la Evaluación de Procesos de Adh

Figura 26 - Fotomicrografía de la superficie de polietileno representativa de las regiones relativamente lisas,

Figura 27 - Fotomicrografía de la superficie de polietileno mostrando ranuras y elevaciones, obtenida por la

La presencia de rugosidades y contornos en el material del embalaje origina

4,2 - sporothermodurans Adhesión Bacillus al polietileno y su resistencia