I

Micromelanóforos – uniforme grayish background

Macromelanóforos – black pattern  enconded por alelos coodominantes do locus Mdl

Mdl responsável por:

1. Morfologia
2. Padrão
3. Início da formação do padrão
4. Compartimentos onde se encontram os pigmentos responsáveis pelo padrão

Os melanomas também são encontrados em não-híbridos mas em CASOS RAROS

Effect of modifier genes

Intensifiers by helleri

Supressors by maculatus eliminados pelo selective breeding através da substituição dos

cromossomas dos maculatos pelos correspondentes dos helleri

A formação do melanoma nos híbridos é explicada pela perda de genes inibitórios que
suprimem os genes específicos dos macromelanoforos

Sd  alelo do Mdl, dominante, sex-linked

Helleri não teem locus Mdl

CROSS 1

O melanoma desenvolve-se do Spot pattern dos macromelanóforos como resultado de um

desiquilíbrio entre 2 loci genéticos

Sd carrying maculatus albergam um locus activamente dominante de um oncogenene Tu

Locus Tu situa-se no cromossoma sexual e tem a sua função oncogénica regulada por um locus
autossómico : R

A presença do R e do Tu em pares de cromossomas diferentes permite a sua separação através

de selective breeding = selecção artificial

Os maculatus possuem locus Tu e Locus Mdl = relação entre o Mdl e o Tu! O Tu e o Mdl
encontram-se a uma distância pequena mas constituem duas entidades genéticas claramente
separadas.

A prova de que o Mdl e o Tu (Xmrk) não estão em linkage é a existência de vários padrões de
macromelanóforos que não são amplificados em nenhuma experiência de crossing não
originando, consequentemente, melanoma.
 helleri não possuem locus Tu nem R
nos híbridos da F1 o cromossoma que possuía o locus R é
substituído por um cromossoma dos helleri R-free
na F2 vamos obter ¼ da geração com o cromossoma sexual que
contem o Tu

Ambos os cromossomas autossómicos que possuem o locus R são substituídos

por um cromossoma que não contem esse locus do pai helleri (que é R-free e
Tu-free)  descontrolo do Tu  Activação do oncogene  melanoma

II
Descobriram que uma sequência relacionada com um EFGR co-segregava com o Tu o que

O Xmrk!
levou ao isolamente de um novo membro de RTK da família dos EFGR:

(Xiphophorus Melanoma Receptor tyrosine-Kinase)

______________________________________________
EFGR – Epidermal growth Factor Receptor, da família dos RTK – Receptor Tyrosine
Kinases, transmembranar e é activado por ligandos específicos como por exemplo o
EGF (Epidermal growth factor) Após a ligação do EGF é activado, dentro da célula, o
domínio kinase. Como resultado vai ocorrer fosforilação de vários resíduos de Tirosina
(Y). Esta fosforilação leva à activação e sinalização de várias outras proteínas que se
associam às tirosinas através dos seus domínios SH2. (phosphotyrosine-binding
domains). Estas proteínas vão dar início a Várias vias metabólicas de transdução de
sinal o que leva à síntese de DNA, à proliferação celular e interferência na apoptose.

EFG liga-se ao EFGR na superfície celular  ligação estimula a actividade intrínseca

tirosina-kinase do receptor  inicia-se uma cascata de transdução de sinal 
alterações bioquímicas no interior da célula  aumento da expressão do gene do
EGFR, síntese de DNA Proliferação celular.

Tirosina-kinase: enzima do tipo kinase que fosforila especificamente amino ácidos de

tirosina.

Quando activado o receptor, as kinases vão fosforilar as tirosinas do domínio Tirosina

do receptor = autofosforilação do receptor.
_______________________________________________
Portanto: o gene que codifica a informação deste receptor Xmrk encontra-se no locus Tu e
preenche todos os critérios para ser o oncogene responsável pelo melanoma  ONC- Xmrk
Oncogene: gene mutante cuja expressão alterada leva a uma estimulação anormal da divisão
e proliferação celular.

O ONC-Xmrk resulta de uma duplicação do INV-Xmrk que se encontra presente em TODOS os

peixes, tanto maculatus como helleri.

INV-Xmrk = Proto-oncogene: gene normal, cuja função é a mesma observada no oncogene, ou

seja, são promotores de crescimento, porém esta função é regulada pela célula. São também
responsáveis pela produção de diferentes tipos de proteínas e enzimas, transdutores de
membrana e receptores…

Assim, o ONC-Xmrk é uma recombinação não homóloga que resulta da duplicação do INV-
Xmrk.

Na duplicação do INV-Xmrk a nova cópia foi fundida numa região 5’ diferente o que vai alterar
o controlo da transcrição e contribuir para as propriedades melanogénicas do ONC-Xmrk.

Em tumores malignos há elevada expressão do ONC-Xmrk e baixa do INV-Xmrk

Abundância de ONC- Xmrk (células do melanoma como nas PSM cells) transcrito é
directamente proporcional ao grau de malignidade do tumor

GRÁFICO!

O receptor encontra-se na sua forma fosforilada nas células do melanoma.

A sobre-expressão do INV-Xmrk não levou à activação dos receptores e não induziu

tranformação celular.  conclusão: para além da sobre-expressão alguns mecanismos
adicionais contribuem para o potencial oncogénico do Xmrk

A activação oncogénica do receptor Xmrk resulta de 2 mecanismos:

- Sobre-expressão = autofosforilação
- Existência de mutações de activação = diferenças sequenciais: substituição de a.a. 
Resíduos altamente preservados na família dos EGFR estão presentes no INV mas substituídos
no ONC.

Estas mutações não estão distribuídas, encontram-se em Clusters em duas sub-regiões do

domínio EXTRACELULAR, os domínios transmembranar e intracelular não se alteram.

MUTAÇÕES

1. Mutação C578S: substitui uma cisteína altamente conservada por uma serina na zona
rica em cisteína do receptor
2. Mutação G359R: substitui uma glicina por uma arginina

1 cisteínas altamente conservadas contribuem para a estrutura terciária da região extracelular

do receptor. Quando uma se perde, trocada por uma serina, a outra fica livre para poder
formar ligações intermoleculares. Estas ligações aberrantes provocam uma alteração de
estrutura no receptor, o que fomenta a fosforilação cruzada dos receptores o que leva à sua
autofosforilação = auto-activação independente de ligandos.

2 a arginina é maior e positivamente carregada. O espaço extra ocupado altera a estrutura

local dessa região e devido à carga positiva, a arginina vai interagir com um resíduo
negativamente carregado do receptor e imitar um ligando, activando assim o receptor.

O ONC-Xmrk é muitas vezes encontrado na membrana nuclear em vez de na membrana celular

porque esta mutações prejudicam a glicolização do receptor depois de sintetizado e impedem
o seu transporte para a membrana celular.

Assim vamos ter células onde encontramos receptores ONC-Xmrk na membrana nuclear e
receptores INV-Xmrk correctamente posicionados na membrana celular.

A presença de duas mutações independentes capazes de activar o ONC-Xmrk é intrigante do

ponto de vista evolutivo.

Uma vez que o INV-Xmrk não tem função fisiológica conhecida, seria de esperar que uma
segunda cópia dispensável, o ONC-Xmrk, acumulasse mutações pontuais que enfraquecessem
a sua função biológica. Pelo contrário, tanto a mutação G359R como a C578S, tornam o ONC-
Xmrk um receptor mais activo!

III
A proteína expressa pelo ONC-Xmrk é detectada desde cedo em todo o embrião,
porém, o tumor vai restringir-se a certos tecidos e órgãos.

Este facto evidencia uma especificidade celular na tranformação induzida pelo Xmrk.

A expressão específica de componentes essenciais da transdução de sinal induzida

pelo Xmrk é um factor decisivo para a especificidade celular.

SUBSTRATOS

PI3- kinase: phosphatydylinositiol-3-kinase

Src kinase Fyn
STAT5: Signall transducer and activator of transcription
GRB2: adaptor protein
Shc: Adaptor protein

A activação essencial do receptor Xmrk nas cél. Do melanoma vai resultar na

fosforilação dos substratos do receptor. Substratos esses que representam a
maquinaria da transdução de sinal.

PAPEL DA SINALIZAÇÃO DA MAPKINASE NA TRANDUÇÃO DE SINAL DO XMRK

Na linha PSM do melanoma, o receptor Xmrk liga ambos GRB2 e Shc, proteínas
adaptadoras, num complexo trimérico. Estas proteínas adaptadoras são auxiliares de
proteínas principais numa via de transdução de sinal, medeiam interacções proteína-
proteína e levam à formação de complexo proteicos.

Via de transdução de sinal é um mecanismo que converte um estímulo mecânico ou

químico numa resposta celular específica. Começa com uma mudança num receptor e
termina com uma alteração na função celular.

GRB2 – liga-se directa ou indirectamente

O GRB2 inicia a activação da via da MAPKINASE.

Uma forte activação das MAPKinases ERK1 e
ERK2 foi detectada nas PSM cells e nas células
do melanoma.

O facto de esta activação ter também sido

encontrada em lesões benignas sugere um forte
envolvimento da MAP Kinase nos primeiros
passos da transformação das células dos
pigmentos.

A intensidade e a duração da activação da MAPkinase tem influencia no estado da

diferenciação celular.

A coestimulação por factores de crescimento que trabalhem no mesmo sentido leva a

um prolongamento da actividade da MAP kinase. Esta actividade pode levar à
supressão total da diferenciação dos melanócitos, proliferação elevada e indução de
um fenótipo alterado.

Em células não diferenciadas a activação da MAP kinase induzida pelo receptor foi
forte e continuada, comparavelmente à situação nos peixes
Em células diferenciadas a activação foi fraca e efémera.

Este conceito de actividade efémero vs continuado de MAP kinase parece

desempenhar um papel na proliferação das células dos pigmentos e sua diferenciação.

PAPEL DAS SRC KINASES (Fyn) NA TRANSDUÇÃO DE SINAL DO XMRK

As Src Kinases citoplasmáticas são uma classe do dóminio das proteínas SH2, estas Src
kinases estão altamente activas nos melanomas malignos

Logo, a sua actividade está relacionada com a malignidade dos tumores. A

determinação da Fyn kinase nos melanomas revelou valores extremamente elevados.

GRAFICO!
Xmrk tem afinidade muito elevada para uma destas kinases desta classe em especial:
Fyn
E a sua actividade em lesões malignas é 6x maior que em lesões benignas

Assim, assumimos a Fyn como um substrato chave do Xmrk na transformação

específica de células pigmentares.

PAPEL DA PI3 KINASE Na TRNADUÇÃO DE SINAL DO XMRK

A Fyn graças ao seu domínio SH2 quando ligada ao receptor actua também como um
adaptador que vai estabilizar a interacção entre o receptor e a subunidade p85 da
kinase PI3 elevando assim a activação desta kinase.

Este complexo trimérico (receptor-Fyn- PI3) foi identificado em melanomas de

xiphophorus

Também a actividade da PI3 kinase é 3x mais elevada nos tumores malignos que nos
benignos.

GRÀFICO!

A inibição da actividade da PI3 nas células PSM bloqueia a entrada das células na fase S
(fase de duplicação) da mitose  este substrato desempenha um papel significativo
no desencadeador mitogénico das células indutoras de melanoma maligno.

PAPEL DA STAT5 NA TRANSDUÇÃO DE SINAL NO XMRK

A STAT5 liga-se directamente ao domínio kinase do Xmrk. Depois de se ligar, fica

fosforilado e transloca-se para o núcleo onde vai induzir a expressão de genes alvo
específicos.

Nas células dos melanomas, o STAT5 demonstra fosforilação significativa, localização

no núcleo.

Assim, tem um papel importante na transformação das células com pigmentos.

CONCLUSÕES  NO BLOCO. Pág. 13-14