Fisiología del Estrés Vegetal

Álvaro Castillo Marín

Santiago Pineda

Universidad de Nariño
Centro de Investigaciones y estudios de posgrado en Ciencias Agrarias
Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias
Pasto, Nariño
2019
 Fisiología del Estrés Vegetal

Álvaro Castillo Marín

Santiago Pineda

Parcial final asignatura Fisiología del Estrés Vegetal

Docente
Ph.D., Hernando Criollo Escobar

Universidad de Nariño
Centro de Investigaciones y estudios de posgrado en Ciencias Agrarias
Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias
Pasto, Nariño
2019
1- Realice una discusión sustentada de las siguientes afirmaciones:

Furtado (2012), plantea que dependiendo de las variaciones climáticas y de la

plasticidad de las especies, se generan respuestas morfológicas, anatómicas y
fisiológicas cuando los ambientes cambian y afirma que “These changes can affect
plant growth, productivity in agriculture, metabolic profile, and plant nutritional
potential, for example. Therefore, plant abiotic stress has been a matter of concern
for the maintenance of human life on earth and especially for the world economy. To
meet these challenges, genes, transcripts, proteins, and metabolites that control the
architecture and/or stress resistance of crop plants in a wide range of environments
will need to be identified, in order to facilitate the biotechnological improvement of
crop productivity”.

RESPUESTA:

Actualmente y teniendo en cuenta los efectos ocasionados por el cambio climático

entre los que Rodríguez y Mance (2009), mencionan, al efecto invernadero,
intensidad en eventos extremos como oleadas de calor, reducción en la
disponibilidad de agua, inestabilidad en la producción agrícola mundial, o la
modificación en los patrones de ocurrencia de la variabilidad climática y sumado con
diversos factores ambientales adicionales, las especies diariamente tienen el reto
de responder para asegurar su supervivencia, donde en especial el reino vegetal,
tiene la importante misión de asegurar el destino de la vida en el planeta como base
esencial de toda cadena trófica, y básicamente como el pilar central de la
alimentación y la economía humana.
En consonancia con lo que Furtado (2012), plantea y atendiendo a los retos
agronómicos que implica la adaptación de las especies a diferentes cambios en el
ambiente, mediados por distintas circunstancias, como las ocasionadas por el
cambio climático, las plantas y puntualmente los sistemas agrícolas de cultivo deben
ser resilientes frente a las situaciones planteadas, y ante ello una de las alternativas
y respuestas que cada ser vivo y en este caso las especies vegetales tienen, es la
plasticidad fenotípica, definida por Ghalambor et al. (2007), como la capacidad de
un genotipo de producir fenotipos distintos en respuesta a diferentes condiciones
ambientales siendo un aspecto ubicuo de los organismos, por ende la capacidad de
una especie de cultivo en aclimatarse y posteriormente adaptarse a un medio
especifico de condiciones ambientales cambiantes será directamente proporcional
a su plasticidad fenotípica, ello implica cambios en su morfología, fisiología y
bioquímica, como los datos reportados por Wang et al. (2019), sobre el efecto del
estrés por salinidad en dos variedades de cebada sin casco (Hordeum vulgare L),
los cuales evidencian que el estrés por salinidad afectó el metabolismo de las
variedades induciendo una reprogramación metabólica siendo los compuestos de
los ácidos orgánicos, nucleótidos y sus derivados y aminoácidos del metabolismo
primario los afectados principalmente, donde varios metabolitos se alteraron de
forma común y diferencial en ambas variedades de cebada, representando el
metaboloma central a un total de 13 compuestos relacionados con el estrés en
plantas, identificados como: piperidina, L-triptófano, ácido L-glutámico, L-
sacaropina, L-fenilalanina, 6-metilcumarina, ácido cinámico, inosina 5'-monofosfato,
ácido aminomalónico, el ácido 6-aminocaproico, la putrescina, la tiramina y el ácido
abscísico (ABA) en las respuestas al estrés, destacando principalmente el papel del
ABA en la señalización de respuestas al estrés salino en cebada sin casco, además
en las respuestas metabólicas desencadenadas por los dos cultivares, se evidencio
claramente que el manejo eficiente de la glucolisis y el consumo de energía
especialmente durante el intervalo de tiempo de mayor estrés es la estrategia clave
para tolerar el estrés salino, estos datos pueden contrastarse con la investigación
llevada a cabo por Villamizar et al. (2012), quienes estudiaron las plasticidad
fenotípica en plantas de Lippia dulcis M., sometidas a déficit hídrico, obteniendo
resultados que demuestran que L. dulcis, bajo estrés por déficit hídrico modifica su
arquitectura radicular y foliar puntualmente en variables como área foliar específica,
longitud de la raíz, longitud de ramas, numero de hojas y razón del área foliar, así
como en la asignación de biomasa en variables como fracción de masa foliar,
fracción de masa de la raíz y razón masa de la raíz / masa foliar, cambios que le
permitieron a las plantas evadir o tolerar dicho estrés como reducir el diámetro de
las raíces, incrementando la longitud y el área de superficie radicular por gramo de
tejido invertido para la adquisición de los recursos o la redistribución de la
asignación de la biomasa hacia el órgano encargado de la captura del recurso
limitado en este caso el agua.
Uno de los primeros en mencionar el término plasticidad fue Darwin (1859) en su
libro El origen de las especies. Señala que en variedades y sub variedades de papa
y dalia se presentan diferencias mínimas en estructura y desarrollo, lo cual hace
que toda su organización presente cambios en su forma (Matamoros y Moreno,
2001). Con base a lo mencionado es importante aclarar que no todas las especies
de plantas poseen esta capacidad ya que la plasticidad fenotípica puede dividirse
en adaptativa definida como la tendencia de un genotipo a expresar un fenotipo que
aumente su habilidad de sobrevivir y reproducirse en un ambiente dado, y no
adaptativa que se refiere a las respuestas a una condición ambiental que no
aumenta la adecuación a la condición del ambiente dado (Ghalambor et al. 2007),
mencionado lo anterior la capacidad de los sistemas agrícolas a adaptarse a las
situaciones cambiantes del ambiente está dada en primera medida por la plasticidad
fenotípica adaptativa de las especies presentes, cabe resaltar que este término no
debe confundirse con el de canalización definido por Fusco y Minelli (2010) como el
proceso de cambio en la dirección de una reducción de la sensibilidad del fenotipo
de un organismo, ya sea alélico (canalización genética) o ambiental (canalización
ambiental).
Otro factor importante de analizar entorno a la plasticidad fenotípica de las plantas
dentro de un sistema agrícola, sometidas a un estrés especifico y que puede
conllevar a un impacto económico en la productividad de los cultivos es la capacidad
del sistema para afrontar tales condiciones desfavorables cuando las especies han
sido previamente sometidas a una circunstancia similar, mencionando lo que se
conoce como memoria del estrés definida por Soriano (2017), como la capacidad
de los organismos de responder mejor frente a un estrés concreto cuando la planta
ya ha estado previamente expuesta a dicho estrés en comparación con las plantas
que se enfrentan a él por primera vez, lo cual puede permitir a la planta su
adaptación al medio en el que se encuentre retomando los ajustes bioquímicos,
fisiológicos y morfológicos previamente desarrollados como respuesta por parte de
la plasticidad fenotípica adaptativa, prueba de este proceso es la investigación
llevada a cabo por Soriano (2017), quien estudió la evidencia de memoria al estrés
por sequía en la planta CAM facultativa, Aptenia cordifolia y el posible papel de
fitohormonas en tal proceso, obteniendo que las plantas expuestas al déficit hídrico
responden de manera diferente si se han enfrentado previamente a un primer
estrés.
Comprobó tras la primera exposición al estrés que los niveles de giberelinas
descienden y se mantienen más bajos en las plantas doblemente estresadas que
en las expuestas al estrés por primera vez. Por el contrario, los niveles de ácido
abscisico fueron mayores en las doblemente estresadas que las expuestas a un
solo estrés. Paralelamente se dan alteraciones en los niveles de hidroperóxidos
pero no en los de malondialdehido, lo que sugiere un incremento en el estado de
oxidación que no acaba en daño oxidativo en las plantas doblemente estresadas.
Por tanto se concluyó que:
1.) En las plantas de A. cordifolia se da memoria al estrés.
2.) Tanto giberelinas como ácido abscisico pueden jugar un papel en la respuesta a
déficits hídricos reiterados.
3.) Los cambios en los niveles de ácido abscisico en las plantas doblemente
estresadas pueden tener un efecto positivo ajustando el estado redox celular con
un papel en la señalización, más que causando daño oxidativo a la célula.

Se puede inferir por tanto que debido a los crecientes inconvenientes generados a
partir del cambio climático o del desarrollo agrícola en ambientes extremos, el estrés
vegetal es una herramienta clara en los procesos de plasticidad fenotípica
adaptativa de las plantas en pro de la adaptación a dichos ambientes, donde
factores como la productividad se ven disminuidos, pero se eleva el porcentaje
adaptativo de los sistemas de cultivo en pro de enfrentar los inconvenientes
ambientales.
Como ya se ha mencionado las plantas tienen diversos mecanismos para su
adaptación a ambientes variables, estos procesos han sido de importancia en su
evolución a través de la historia, tal es el ejemplo del papel de la plasticidad
fenotípica adaptativa en la fijación de genes o asimilación genética definida por
Castillo y Espinoza (2018), como el conjunto de genes que retoman el papel que
originalmente tenía un factor ambiental en la producción de una característica, es
decir es un proceso mediante el cual una respuesta fenotípica a un factor ambiental
es asimilada por el genotipo, y se vuelve independiente del inductor ambiental. Lo
anterior puede ser un factor de significancia para que diversos genes se expresen
a través de varias generaciones, fijándose en el genoma de la especie y permitiendo
su adaptación al nuevo ambiente. Lo ya mencionado hace parte de un proceso de
biología evolutiva que se aprecia a través del paso de un número considerable de
generaciones, difícilmente apreciable en un sistema agrícola, pero aun así su
consideración es de importancia siendo uno de los procesos que ha permitido la
diversificación de las especies y colonización de ambientes a través de la historia,
por tanto la plasticidad fenotípica adaptativa como la memoria del estrés son de
gran importancia en la adaptación de especies agrícolas a los ambientes
cambiantes, logrando transmitirse en posteriores generaciones, como lo comprueba
la investigación realizada por Suter y Widmer (2013) sobre efectos fenotípicos del
estrés por salinidad y altas temperaturas durante tres generaciones en Arabidopsis
thaliana L., descubrieron que el tratamiento consecutivo de las plantas de
Arabidopsis con solución salina durante tres generaciones dio como resultado el
desarrollo de plantas con más silicuas por rama y un tallo más alto en comparación
con las plantas tratadas solo durante una generación, así como las plantas
expuestas a temperaturas elevadas durante dos generaciones demostraron un
aumento en la varianza fenotípica de una serie de características como la altura de
la planta, el número de silicuas y la longitud, así como el número de hojas por roseta,
en comparación con las plantas cultivadas en ausencia de estrés, demostrando así
que la memoria al estrés es heredada.
En relación con lo planteado por Furtado (2012) con respecto al estrés y la
preocupación que se dice representa para la productividad agrícola mundial y el
bienestar del ser humano, y en contraste con lo mencionado anteriormente y lo
aprendido a lo largo de la asignatura de fisiología del estrés vegetal, tal proceso no
siempre debe ser interpretado como una situación negativa en los sistemas
agrícolas, siempre y cuando no represente un riesgo para la total integridad de las
especies establecidas, puede ser una herramienta fisiológica en la obtención de
nuevos cultivares con mejor grado de adaptación, ya que el propio proceso a través
de la ya mencionada plasticidad fenotípica adaptativa y memoria del estrés facilita
los cambios metabólicos, morfológicos y fisiológicos, que las especies necesitan en
la adaptación a los diferentes ambientes extremos, e incluso facilita la identificación
de metabolitos , genes, transcripciones o proteínas necesarias para incluir en los
programas de mejoramiento genético de plantas, en la obtención de cultivares
resistentes a tales condiciones, mitigando los efectos adversos que situaciones
como el cambio climático generan en los procesos agrícolas.
La identificación de los metabolitos, proteínas y transcripciones, se puede llevar a
cabo por diferentes métodos, uno de ellos y ampliamente usado es el de GC/MS
Gas chromatography – mass spectometry (cromatografía de gases –
espectrometría de masas) para la identificación del metaboloma y RNA sequencing
o también llamado secuenciación del transcriptoma entero para clonación al azar,
en el análisis de las transcripciones clave de respuesta, tales métodos se evidencian
en la investigación llevada a cabo por Cui et al. (2018), Sobre la identificación de
metabolitos y transcripciones involucradas en el estrés salino y la recuperación en
el maní Arachis hypogaea L. en la cual haciendo uso de los métodos descritos se
encontraron 92 metabolitos de un total de 391 identificados que variaron en
respuesta a la salinidad y 42 respondieron a la recuperación especialmente; así
como 1742 transcripciones en brotes y 3281 en raíces fueron identificadas como
respuesta al estrés salino, de las cuales 372 transcripciones en brotes y 1386 en las
raíces respondieron específicamente a la recuperación; entre los metabolitos de
respuesta a la salinidad, se encontraron: urea, leucine, histidine, uridine, L – malic
acid, 4 – hydroxybutyrate, quinic acid, sedoheptulose, caffeic acid, 2-
mercaptoethanesulfonic acid.
La identificación de transcripciones junto con metabolitos de respuesta a
condiciones de estrés, son el punto de partida del mejoramiento genético de plantas
por diferentes métodos, como la transgénesis, que permite introducir genes
codificantes de proteínas y metabolitos que le confieran a las variedades
comerciales tolerancia a condiciones extremas, un ejemplo de la mejora
biotecnológica de los cultivos y la descripción de la ventaja que ello representa fue
la obtención de plantas transgénicas de camote resistentes a la salinidad dada por
el gen IbMas en la universidad agrícola de China, la investigación fue llevada a cabo
por Liu et al. (2014), quienes aislaron al gen maspardin nuevo, llamado IbMas, que
confiere resistencia a estrés por salinidad. IbMas contiene el dominio maspardin y
pertenece a la superfamilia α / β-hidrolasa. La expresión de IbMas se evidenció en
platas transgénicas de camote bajo estrés salino y tratamiento ABA. Las plantas de
camote con sobreexpresión de IbMas mostraron una tolerancia a la salinidad
significativamente mayor en comparación con las no transgénicas. El contenido de
prolina aumentó significativamente, mientras que el contenido de malonaldehído
disminuyó en las plantas transgénicas. Las actividades de la superóxido dismutasa
(SOD) y la fotosíntesis aumentaron significativamente, mejorando la tolerancia a la
salinidad al regular el equilibrio osmótico, protegiendo la integridad de las
membranas y aumentando la capacidad de eliminación de especies reactivas al
oxígeno.
El anterior ejemplo sirve de ilustración sobre la importancia de la obtención de
plantas mejoradas genéticamente a través de métodos biotecnológicos, que sean
tolerantes a diferentes condiciones extremas por salinidad, temperaturas, heladas,
sequia, siendo el estrés la herramienta que promueve a través de la elasticidad
fenotípica la expresión de metabolitos, proteínas o transcripciones que conlleven a
la reducción de los efectos nocivos generados por tales situaciones, y se obtengan
cultivares productivos que se adapten a una amplia gamas de ambientes donde
situaciones de estrés fisiológico no representen pérdidas importantes económicas
para los cultivos transformados genéticamente.
Por tanto y realizando un análisis de lo ya expuesto junto con el argumento de
Furtado (2012), el estrés vegetal es un motivo de preocupación a nivel mundial,
dada la anormalidad en los eventos de variabilidad climática ocasionados por
factores como el cambio climático, sin embargo debe considerarse como una
herramienta clave en el mejoramiento fisiológico de las especies agrícolas dada la
plasticidad fenotípica intrínseca de las especies, además de mecanismos de las
plantas para afrontar dichos inconvenientes ambientales como la memoria del
estrés, y obtener como resultado de estos procesos la identificación de genes y
metabolitos que han estado silenciados en las plantas por motivos de estimulación
ambiental, pero que por eventos ambientales extremos se expresan; y es en esa
circunstancia donde la ingeniería genética y los diferentes tipos de mejoramiento
vegetal, se deben convertir en componentes fundamentales de las ciencias agrarias
para la obtención de especies tolerantes a dichas condiciones debido a que según
el informe de la FAO (2010) sobre agricultura y cambio climático se prevé que las
zonas mayormente afectadas por los cambios ambientales en la agricultura sean
las zonas tropicales y subtropicales, en donde se ubica la mayoría de países en
desarrollo y cuyas economías son mayormente dependientes de la agricultura y
otras actividades primarias, además según FAO (2018), entre 2005 y 2015 la
inestabilidad climática costo a los sectores agrícolas de las economías de los países
en desarrollo la alarmante cifra de 96 000 millones de dólares en daños a la
producción agrícola y ganadera. La mitad de estas pérdidas por un valor de 48 000
millones de dólares ocurrió en Asia, asegura el informe, siendo la sequía uno de los
eventos recurrentes causantes de tales perdidas.
Por tanto en nuestro entorno se prevé que la agricultura Colombiana no sea ajena
a tales efectos y se vea afectada por los diferentes tipos de estrés vegetal
ocasionados por eventos ambientales adversos. Ello hace el llamado al sector
agrícola a utilizar la tecnología para hacer frente a dichos cambios, entre los cuales
como se ha mencionado inicia utilizando el estrés vegetal como una herramienta en
pro del análisis de la plasticidad fenotípica adaptativa de las especies de interés
agrícola en la expresión de genes que provean características deseables tanto
fisiológicas como morfológicas, y que dichos genes sean una fuente importante para
el mejoramiento genético de las plantas en pro de una resiliencia agrícola y por ende
estabilidad económica y humana de las comunidades, regiones y países.
2- En un estudio para determinar la respuesta de cultivares a un tipo de estrés
abiótico, se debe identificar la molécula de respuesta a estrés; plantee una
metodología para determinar con certeza que la molécula identificada es
efectivamente la molécula de respuesta al estrés.

Se tomara el estrés hídrico y plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) en una

investigación similar a la desarrollada en la asignatura de fisiología del estrés
vegetal como base para fundamentar la metodología de la identificación del
metabolito en respuesta al estrés abiótico.

Condiciones de crecimiento vegetal y tratamiento de estrés hídrico

Para el desarrollo del material vegetal, se deberán sembrar semillas de tomate en
bandejas con alveolos, con un sustrato formado por una mezcla de perlita –
vermiculita esterilizado con hipoclorito de sodio al 1% según lo planteado por
Ruscitti, et al. (2015). 20 dds se realizara el trasplante de las plántulas a macetas
con 1 kg de sustrato compuesto por suelo, mos y cascarilla de arroz en proporción
2:1:1, las cuales deberán cultivarse en un invernadero con condiciones
determinadas. Las plantas deberán regarse uniformemente con un volumen de 100
cm3 de agua durante 15 días después del trasplante. Finalizado este tiempo se
aplicaran los tratamientos que deben consistir en:
T1: 100 %, aplicación diaria de 100 cm3 de agua
T2: 75 %, aplicación con espacio de un día, de 100 cm3 de agua
T3: 50 %, aplicación con espacio de dos días, de 100 cm3 de agua
T4: 25 %, aplicación con espacio de cuatro días, de 100 cm3 de agua
Se utilizara un diseño experimental en bloques completos al azar, de la siguiente
manera:
4 3 2 1
25% 50% 75% 100%

2 1 4 3
75% 100% 25% 50%

3 2 1 4
50% 75% 100% 25%

Para un total de 16 plantas por repetición y 192 plantas en todo el experimento.

Se realizaran 8 mediciones espaciadas por un periodo de 8 días entre cada una, la
primera medición de las variables se llevara a cabo un día antes del inicio de la
aplicación de los tratamientos. Las variables a estudiar se mencionan a
continuación:
Análisis fisiológico de las plantas
- Materia fresca y seca: se realizara pesos en freso y seco por órgano
vegetal, el secado del material vegetal realizara en un horno powdertronic.
- Potencial hídrico: se medirá haciendo uso de la cámara de scholander, el
procedimiento consistirá en primer lugar en seleccionar la planta a medir, se
cortara una porción de esta, después se deberá llevar la planta embolsada
en plástico a la cámara de presión. Una vez en la cámara se aplicara presión
a la planta, con nitrógeno gaseoso, hasta que la presión aplicada iguale la
tensión negativa con la que el agua este retenida en el interior de la planta,
determinándose así el valor del potencial hídrico (Barajas et al., 2006)
- Densidad estomática: Se deberán obtener impresiones epidérmicas de
hojas; la técnica consistirá en la aplicación de barniz para uñas transparente
en un área pequeña (cerca de 50 mm2) en la superficie abaxial de la hoja.
Después de que el barniz se seque, por aproximadamente 90 s, la capa
deberá ser removida y montada en un portaobjetos. Se tomaran dos
muestras de cada hoja en la región de la parte central entre las venas
secundarias, y se deberán observar ocho campos en un microscopio (Carl
Zeiss, Alemania) con el objetivo 40X. Se calculara el área con un portaobjeto
micrómetro y se determinara la densidad estomática por mm2 (Barrientos et
al., 2003).
- Transpiración, fotosíntesis neta y conductividad estomática: Se medirán
con un equipo CIRAS-2, PP Systems, Hitchin, Hertfordshire.
- Fluorescencia de la clorofila: la medición de la eficiencia fotosintética
(Fv/Fm), Quenching fotoquímico y Quenching no fotoquímico se deberá
realizar con un fluorometro (Junior-Pam, WALZ), cubriendo el área de una
hoja, durante 60 min con el fin de generar la reducción de la actividad del
FSII a valores cercanos a 0. Pasada la hora se procederá a realizar las
mediciones conservando la condición de oscuridad de la hoja, se instalara el
sensor del equipo y se iniciara con la medición (Perez y Sandoval, 2014).

Extracción y análisis del metabolito

Este es el proceso esencial en la identificación del metabolito al estrés y está
fundamentado en las metodologías llevadas a cabo por Cui et al. (2018), Ullah, et
al. (2017) y Wang et al. (2019).
La extracción y el análisis del metabolito se deberá realizar mediante cromatografía
de gases - espectrometría de masas (GC-MS) definido por Martin y Miranda (2013),
como una técnica que combina la capacidad de separación que presenta la
cromatografía de gases con la sensibilidad y capacidad selectiva del detector de
masas. Esta combinación permite analizar y cuantificar compuestos trazas en
mezclas complejas con un alto grado de efectividad. Este proceso se puede realizar
utilizando un espectrómetro de masas GC-MS-QP2010 Ultra con cromatógrafo de
gases con autoinyectores AOC-20i GC Ultra y DSQ cuadrupolo MS (SHIMADZU
Corporation, Tokio, 101–8448, Japón) como el descrito por Ullah, et al. (2017).
El procedimiento deberá ser el siguiente, por tratamiento las muestras de hojas del
tercio medio de las plantas de tomate se deberán cortar y congelarse rápidamente
en nitrógeno líquido, y almacenarse a - 80 ° C. Luego las muestras deberán ser
molidas en N2 líquido .y 60 mg se deberán lavar en una mezcla de agua – metanol
- cloroformo enfriada (2: 2: 1) con L-2-cloro-fenilalanina como estándar
interno. Después de centrifugación a 14.000 rpm durante 10 min, se deberán secar
700 μL de sobrenadante y se harán reaccionar con 80 μL de clorhidrato de
metoxamina a 37 ° C durante 90 min, seguido de una reacción de sililación. Cada
alícuota de 1 μL de la solución derivada se inyectara en modo splitless en el sistema
Agilent 7890A-5975C GC-MS (Agilent, EE. UU.). La separación se llevara a cabo
en una columna capilar DB-5 no polar (30 mx 250 μm ID, J&W Scientific, Folsom,
CA), con helio de alta pureza como gas portador a un caudal constante de 1,0 ml /
min. La programación de la temperatura del GC deberá comenzar a 60 ° C, seguida
de rampas de temperatura del horno de 8 ° C / min a 125 ° C, 4 ° C / min a 210 ° C,
5 ° C / min a 270 ° C y 10 ° C / min a 305 ° C, y un mantenimiento final de 3 min a
305 ° C. La fuente de iones de impacto electrónico (EI) se deberá mantener a 260 °
C con un sesgo de filamento de − 70 V. Se utilizara el modo de exploración completa
(m / z 50–600), con una tasa de adquisición de 20 espectros / segundo en el ajuste
de MS. Obteniendo así los resultados de GC/MS, donde la cromatografía de gases
separa los metabolitos y la espectrometría de masas se encarga de identificarlos y
cuantificarlos, basado en la firma metabólica de cada compuesto obteniendo un
cromatograma.
Análisis de datos metabólicos: los resultados obtenidos se procesaran en un
software estadístico siendo uno de los más usados ChromaTOF (v4.34, LECO, St
Joseph, MI, EE. UU.) Según Kind et al. (2009), el cual proporciona la apreciación de
la intensidad de los picos detectables que se asocian con bases de datos mundiales
sobre metaboloma como METILEN que permiten la búsqueda de datos m/z (relación
masa/carga) y su comparación con los obtenidos por GC/MS en el agrupamiento de
los metabolitos obtenidos y generación del metabolic profiling (Perfil metabólico).
Posterior a ello según la metodología utilizada por Cui, et al. (2018), Los datos se
importaran por separado al paquete de software SIMCA-P + 14.0 (Umetrics, Umeå,
Suecia), para llevar acabo análisis de componentes principales (PCA), análisis
multivariado y el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA),
para con ello presentar un nuevo orden y reducir la dimensionalidad del conjunto de
datos, y con ello apreciar en detalle las variaciones que el metabolito de interés
tenga a través del tiempo en los diferentes tratamientos de estrés.
Es importante aclarar que antes de realizar este proceso que permite la apreciación
de las variaciones del metabolito de respuesta al estrés en cuestión a través del
tiempo en los tratamientos de estrés, se tuvo que realizar previamente al
experimento el “metabolic profiling” (perfil metabólico de la especie) definido por
Clarck y Haselden (2008), como la medición en sistemas biológicos unicelulares a
multicelulares del complemento de metabolitos de bajo peso molecular y sus
intermedios que refleja la respuesta dinámica a la modificación genética, a través
de la metabolomica la cual según Arbona et al. (2014), es el estudio que tiene como
objetivo el análisis de todos los metabolitos de bajo peso molecular presentes en un
organismo, tejido o tipo celular concreto en un estadio de desarrollo dado y bajo
unas condiciones ambientales particulares, proporcionando así una descripción
detallada del fenotipo bioquímico a través de métodos como el GC/MS ya descrito
o la espectroscopia de resonancia magnética nuclear, la cual según Laurella (2017),
es una herramienta que existe en la actualidad para dilucidar estructuras de
moléculas, principalmente moléculas orgánicas. Para ello, y como su nombre lo
indica, esta técnica se basa en una característica intrínseca de los núcleos: sus
propiedades magnéticas. Posterior a esto se debió utilizar un software como el
XCMS2 online el cual es de acceso gratuito y según Benton et al. (2008), permite el
Procesamiento de datos de espectrometría de masas en tándem para la
identificación de metabolitos y caracterización estructural. De esa manera el
metabolito al estrés debió ser aislado previamente a la aplicación de la metodología,
para su identificación posterior en las 8 mediciones programadas en la metodología
planteada para determinar si es efectivamente una molécula de respuesta al estrés.

Con base en lo mencionado y planteada la metodología para identificar el metabolito

en las mediciones, lo que se pretende es, identificar a través de GC/MS si existen
variaciones considerables del metabolito en respuesta al estrés dependiendo del
tratamiento, en el transcurso del tiempo, es decir, si se identifican incrementos en
las concentraciones del metabolito producido por las plantas en conformidad con el
aumento del estrés de las plantas, efectivamente el metabolito será una molécula
de respuesta al estrés, donde puede actuar de diferentes formas dependiendo de
su naturaleza, sea como osmregulador o señalizador, es decir se esperaría por ende
que las concentraciones de dicho metabolito respondan en aumento conforme a los
grados de estrés de la siguiente manera:

25 > 50 > 75 > 100

Por ello se esperaría que este en mayor concentración en los tratamientos de 25%
y en menor concentración en el tratamiento de 100% como lo demuestra la
secuencia, y esta concentración aumente a través del tiempo en cada tratamiento
dependiendo del grado de estrés y aclimatación que las plantas desarrollen, lo cual
se podrá respaldar con el resto de variables descritas como conductancia
estomática, o fluorescencia que permitirán evidenciar el grado de estrés de las
plantas dependiendo del tratamiento aplicado, datos que se podrán correlacionar al
final de la investigación con las concentraciones de metabolito, para obtener un
análisis con mayores argumentos en como el cambio de las variables evaluadas
permite analizar el grado de estrés de las plantas, y por ende la respuesta del
metabolito que se espera aumente de acuerdo al grado de estrés. Si en un caso
dado tal aumento del metabolito dependiendo del grado de estrés no se lograra
apreciar en los tratamientos, y las concentraciones permaneciesen uniformes, se
concluirá con que la molécula no tiene respuesta al estrés.

Esta metodología puede ser extrapolada a otras especies y tipos de estrés en la

identificación del metaboloma de respuesta.

3- Habbern et al., (2009)*, en un estudio que relaciona el estado nutricional de plantas

de cebada, con el estrés hídrico y luminosidad, el autor propone la siguiente gráfica:

*Hebbern CA, Laursen KH, Ladegaard AH, Schmidt SB, Dan Bruhn PP, Schjoerring JK, Wulfsohn D, Husted S. (2009)
Latent manganese deficiency increases transpiration in barley (Hordeum vulgare ). Physiol Plant., 135:307-316

Analice esta gráfica, encuentre su relación con el UEA (Uso eficiente del agua) y
proponga sus conclusiones.

Respuesta:

La grafica planteada, hace alusión a los resultados obtenidos en la investigación

titulada “La deficiencia latente de manganeso aumenta la transpiración en la cebada
(Hordeum vulgare L)”, donde se observan, cambios de temperatura foliar, en plantas
de cebada con deficiencia de Mn y un testigo sin deficiencia, expuestas a una
transición de luz/oscuridad/luz, 50 dds.

Se aprecia que a través de todo el experimento las temperaturas son mayores en

las plantas con deficiencia de Mn oscilando entre valores de 18 y 22 °C
aproximadamente, mientras que el testigo oscila entre 17 y 20 °C aproximadamente,
lo cual según Hebbem et al., (2009), se debe a que en las plantas con deficiencia
de Mn el contenido de cera epicuticular en las hojas disminuye, lo cual reduce la
reflectancia de la luz dando como resultado una absorción más ligera, mayor carga
y mayores temperaturas foliares.

Además se observa que los valores de temperatura se aumentan en presencia de

luz y disminuyen considerablemente en oscuridad, lo cual según Nobel (1991) se
debe a la ausencia de luz, siendo una de las más importantes fuentes de variación
térmica en las plantas.
Los resultados muestran que en el tratamiento con deficiencia de Mn el máximo
valor fue de 21,5 °C, en condiciones de luz, disminuyendo hasta una valor cercano
a los 18 °C en condiciones de oscuridad, este patrón fue similar en el testigo, donde
en condiciones de luz se alcanza un valor máximo cercano a los 20 °C, pero en
condiciones de oscuridad decae hasta valores cercanos a los 17 °C, se observa
también que pasado el periodo de oscuridad en transición hacia la luz, tanto el
testigo como el tratamiento con deficiencia incrementan nuevamente sus valores
térmicos aunque sin alcanzar los picos máximos.

Los datos presentes en la gráfica están directamente relacionados con el uso

eficiente del agua (UEA) definido por Azpiazú (2010), como la relación entre gramos
de agua transpirada por un cultivo por gramo de materia seca producida.
Expresado en la siguiente formula:

WUE = mol CO2 * mol (H 2 O) -1

Según Pereira et al., (2002), los cultivos que utilizan el agua de manera más
eficiente producen más materia seca por gramo de agua transpirada, por lo que el
uso eficiente del agua se correlaciona directamente con el tiempo de apertura y la
conductancia o resistencia estomática. A medida que la planta absorbe el CO2 para
la fotosíntesis, el agua se pierde por transpiración, con una intensidad variable que
depende del gradiente de potencial entre la superficie de la hoja y la atmósfera,
siguiendo una corriente de potenciales de agua. Además los contenidos de cera
epicuticuar pueden variar también los porcentajes de transpiración.

Con base en lo mencionado los resultados obtenidos y visualizados en la gráfica

expresan que en condiciones de déficit de Mn las plantas de cebada aumentan su
temperatura foliar, lo cual según El Sharkawy (2003) puede promover una excesiva
transpiración y por ende menor UEA, por tanto la relación entre la gráfica y el uso
eficiente de agua (UEA) parte de la deficiencia de Mn como un precursor
fundamental de la cera epicuticular definida por Meusel, et al. (1994) como una capa
compuesta por lípidos alifáticos, acetatos de tripterpenol y triterpenoles, entre otras
sustancias, la cual cubre a la cutícula y que entre sus funciones principales según
Perez y Sepulveda (2011), están:

- Servir como una barrera ante la pérdida excesiva de agua

- Regular la reflactancia de la luz, manteniendo una temperatura adecuada en
las hojas.

Por tanto en las plantas con deficiencia de Mn se espera que la transpiración

aumente, en primera medida por las limitaciones de las hojas de retener el agua
debido a las deficiencias de cera epicuticular, además del aumento de la
transpiración por parte de la biología de la planta, para regular la temperatura interna
elevada por dicha deficiencia, presentando incapacidades en la reflectancia de la
luz; obteniendo un valor bajo en el UEA, y por tanto disminución en los contenidos
de biomasa, a diferencia de lo esperado para el testigo, que al no presentar
deficiencia en los contenidos de Mn, tendrá una formación adecuada de cera
epicuticular, por ende la transpiración junto con el contenido de biomasa serán
adecuados evidenciando un aumento en el UEA en contraste con el tratamiento con
deficiencia de Mn. Esto se respalda por los resultados obtenidos en la investigación
en cuestión por Hebbem et al., (2009), quienes obtuvieron valores menores de
biomasa en el tratamiento con deficiencia de Mn que en el testigo, así como la
transpiración que fue hasta cuatro veces mayor en las plantas con deficiencia de
Mn en comparación con el testigo, y una disminución del 37% en los contenidos de
cera epicuticular en el tratamiento con deficiencia de Mn en comparación con el
testigo, disminuyendo la refllectancia y generando una sobre exitacion de los
fotosistemas y por ende aumento en la temperatura foliar, donde se menciona que
incluso diferencias mínimas en los contenidos de cera epicuticular pueden causar
aumentos de temperatura foliar.

Planteado lo anterior se puede concluir que:

- El Mn es un elemento de gran importancia para el UEA por parte de las

plantas debido a que es un precursor de la cera epicuticular, encargada de
evitar una transpiración excesiva y por ende un desequilibrio en el consumo
de agua para la producción de biomasa.
- En este caso debido a la disminución de cera epicuticular en las plantas con
el tratamiento, y siendo su función el evitar excesos en las pérdidas de agua
además de la reflectancia de luz, y por ende evitar la sobre excitación de los
fotosistenmas, el aumento de temperatura en las hojas, es un indicativo de
aumento en la transpiración y menor UEA
- En el periodo de oscuridad los valores de temperatura decaen en el
tratamiento y en el testigo, debido a la ausencia de luz, sin embargo la
investigación evidencia que la conductancia nocturna de la hoja para el vapor
de agua fue aún el doble en las plantas sin Mn en comparación con el control.
- Se puede asociar la deficiencia de Mn como uno de los factores que causan
disminución en el UEA.
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