Biodegradación de colorante azul índigo mediante cepa bacteriana de

Pseudomonas pùtida
Leydi J. Acosta Cabarcas1, Daniel O. Aguirre Casas2

Resumen
La producción textil es una de las industrias que generan en gran volumen colorantes de
pigmentación azoica, entre los cuales se encuentra uno de interés específico denominado índigo
o añil, un colorante azulado que tradicionalmente se obtenía de una planta leguminosa típica de
algunas regiones de Asia y África, su uso se remonta a los tiempos de los egipcios para la
coloración de tejidos, no obstante se hizo esencialmente conocido hasta finales del siglo XIX
cuando por un lado se extendió su uso para la fabricación de pantalones vaqueros, actualmente
conocidos como blue jeans y por otro lado debido a que se logró su síntesis artificial. Sin embargo
su producción y utilización confieren a las aguas residuales un color fuerte que afecta
significativamente la actividad fotosintética del ecosistema hídrico debido a la reducción de la
penetración de la luz otorgando simultáneamente un carácter toxico a la vida acuática, de ahí el
interés en buscar métodos que logren la desaparición de compuestos de origen xenobiotico de
este tipo en los afluentes. El presente estudio se llevó a cabo con la finalidad de biodegradar el
mayor porcentaje de colorante azul índigo a una concentración de 20 ppm cuyas condiciones
óptimas de crecimiento se especifican a lo largo del trabajo, con el uso de la biotecnología
aplicada de bacterias pertenecientes al género Pseudomona especie putida, obteniendo una
efectividad del (..% ), evaluado bajo métodos espectrofotométricos con muestras adquiridas cada
hora durante 8 horas, de un fermentador Batch New Brunswick BioFlo®/CelliGen®115.

Palabras clave Colorante, Índigo, Biodegradación, Espectrofotometría, Fermentador.

Abstract
The textile production is one of the industries that generate in large volume azoica pigmentation
dyes, among which one is of specific interest called Indigo or indigo, a bluish dye that was
traditionally obtained from a leguminous plant Typical of some regions of Asia and Africa, its use
goes back to the times of the Egyptians for the coloring of tissues, however it was made
essentially known until the end of the nineteenth century when on one hand it extended its use for
the manufacture of jeans , currently known as Blue jeans and on the other hand because it was
achieved artificial synthesis. However, its production and use give the wastewater a strong color
that significantly affects the photosynthetic activity of the water ecosystem due to the reduction of
the penetration of light, simultaneously giving a toxic character to the Aquatic life, hence the
interest in seeking methods that achieve the disappearance of compounds of xenobiotico origin of
this type in tributaries. The present study was carried out in order to biodegrade the highest
percentage of indigo blue dye at a concentration of 20 ppm whose optimal growth conditions are
specified throughout the work, with the use of applied biotechnology of bacteria Belonging to the
genus Pseudomona species putida, obtaining an effectiveness of the (.. %), assessed under
Spectrophotometric methods with Aquiridas samples every hour for 8 hours of a New Brunswick
BioFlo ®/CelliGen ® 115 Batch fermenter.

Key words Dye, Indigo, biodegradation, Spectrophotometry, Fermenter.

1Estudiante de Ingeniería Sanitaria, Universidad Distrital Francisco José de Caldas,
Lyacostac@correo.udistrital.edu.co.
2Estudiante de Ingeniería Sanitaria, Universidad Distrital Francisco José de Caldas,

doaguirrec@correo.udistrital.edu.co.
1
 Introducción
Se estima que anualmente se producen 700.000 toneladas de colorantes en todo el mundo, de
los cuales 60-70% son colorantes azoicos, El colorante azul índigo [C12H10O2N2] es clasificado
como compuesto xenobiotico por que posee cromoforos y un enlace tipo azo, el cual caracteriza
por tener un doble enlace nitrógeno-nitrógeno (-N=N-), el cual, dependiendo del colorante,
pueden poseer de uno a dos enlaces de nitrógeno-nitrógeno. [1]

Los tintes son recalcitrantes por diseño y no fácilmente modificables, las aguas residuales textiles
presentan la complejidad adicional de tratar con cantidades desconocidas y variedades de
muchos tipos de tintes, así como con bajas relaciones DBO / DQO, que pueden afectar la
eficiencia de la decoloración biológica. Lo que evidencia la resistencia a los métodos de
tratamiento comunes, imponiendo un gran desafío para los sistemas de agua cerrados. [2]

Los efectos crónicos de los colorantes, especialmente de los colorantes azoicos, se han
estudiado durante varias décadas. Los colorantes azoicos en forma purificada son mutagénicos o
carcinogénicos, a excepción de algunos colorantes azoicos, conducen a la formación de aminas
aromáticas y varias aminas aromáticas son mutágenos y carcinógenos conocidos para los seres
humanos. En altas concentraciones estos colorantes provocan una disminución en la luminosidad
de las aguas y en consecuencia inducen a la disminución de la actividad fotosintética, además
produce la disminución de oxigeno disponible favoreciendo procesos de eutrofización por el
aumento de carga orgánica. [3]

De varios métodos que se utilizan en el tratamiento de efluentes textiles para lograr la

decoloración, incluidos métodos fisicoquímicos como la filtración, la coagulación específica, el uso
de carbón activado y la floculación química, algunos de los métodos son efectivos pero bastante
caros. El biotratamiento ofrece una alternativa más económica y ecológica para la eliminación del
color en el efluente textil. [4]

La naturaleza de extracción de electrones de los enlaces azo obstruye la susceptibilidad de las

moléculas de colorante azo a la reacción oxidativa. Por lo tanto, los colorantes azoicos
generalmente resisten la biodegradación bacteriana aeróbica. Solo las bacterias con enzimas
reductoras de colorante azo especializadas (Azoreductasa) degradaron los colorantes azo en
condiciones completamente aeróbicas. Esta reducción anaeróbica implica que la decoloración de
los colorantes se convierte en aminas aromáticas usualmente incoloras pero potencialmente
dañinas. Por lo tanto, el tratamiento anaerobio debe considerarse simplemente como la primera
etapa de la degradación completa de los colorantes azoicos. [5]

La Pseudomonas putida es una de las especies de mayor interés industrial entre las bacterias del
género Pseudomonas porque además de su potencial de degradación de compuestos aromáticos
y xenobióticos presenta la capacidad de colonizar el sistema radicular de las plantas, formar
biopelículas y ser manejable desde el punto de vista genético.[6] El objetivo del trabajo además
de biodegradar el colorante es cuantificar constantemente el conjunto de bacterias presentes en
el cultivo y verificar su capacidad de absorción por medio de espectrofotometría a una longitud de
onda de 420 nm.

Materiales y métodos
Para el desarrollo del proyecto se utilizaron como medios de cultivo agar cetrimide, (Medio
selectivo) para el crecimiento de pseudomona, caldo nutritivo, caldo especifico con sales
mínimas( macro y micro nutrientes al 7,6% y 0,76% respectivamente), peptona (0,1%) y glucosa
(0,1), como reactivos se emplearon azul índigo 5N ( sustrato), NaCl y H2SO4 al 1N ( para ajustar

2
pH) , agua des ionizada, alcohol cetona, Lugol, azul de metileno, como equipos se emplearon el
espectrofotómetro para siembra y medición se usaron micro tubos ( 9mL), tubos de centrifuga,
cajas Petri, botellas en vidrio de 500 mL , cámara de neubauer, mechero, asas microbiológicas,
Microscopio, y equipo de centrifuga, New Brunswick BioFlo 115 (Birreactor)

Para el desarrollo del proyecto se emplean 3 faces de implementación:

1) realización de ante-proyecto, en este se recogió la información requerida para la puesta en

marcha, los conceptos teóricos de los fenómenos que se presentan en el proceso, características
del organismo, fichas técnicas de seguridad, viabilidad del proyecto, antecedentes bibliográficos
entre otras,
2) determinación de condiciones óptimas de crecimiento, en las cuales se realizaron pruebas de
nutrientes requeridos para el crecimiento optimo, realizando medios sin peptona (fuente de
Nitrógeno) y glucosa (como fuente de Carbón), se realizaron pruebas en tres diferentes
temperaturas, (25°C, 35°C y 43°C) en cada una de las temperaturas se realizaron pruebas
sembrando en tres concentraciones distintas ( 15ppm, 20ppm y 35 ppm), y en estas se realizaron,
pruebas en tres pH (5,7y9) por lo cual se obtuvo un total de 27 pruebas a las cuales se les
identifico mayor crecimiento de organismos visualmente y mayor degradación en comparación de
las muestras control, se realizó centrifugación a 4000 rpm, para separar el contenido de biomasa
del sobrenadante y poder realizar lectura a través del método de espectrofotometría, y
determinar las condiciones óptimas en el cual se producen mayor degradación del colorante

3) por último se emplearon los datos obtenidos para realizar la experimentación de degradación
en el birreactor New Brunswick BioFlo 115 , se realizó una siembra en un litro de caldo, bajo las
condiciones óptimas, se realizó curva de calibración con diluciones del colorante en 6
concentraciones distintas para determinar la ecuación que permitiera identificar los valores de
concentración en las diferentes muestras, a las cuales se les realizo lectura de absorbancia,
conteo por cámara de neubauer del número de células y por cada muestra se realizó
observación de los parámetros de temperatura, agitación, pH, OD, Aire y O2 , a la hora cero se
tomó la primer muestra, y se tomaron 5 más a intervalos de una hora.

Resultados y Discusión

Se determinó que la Pseudónima putida depende estrictamente de la peptona como fuente de

nitrógeno para su crecimiento, en cuanto a la glucosa no es indispensable para que se sostenga
pero sin embargo se evidencio, deficiencia en la producción de biomasa y de degradación a
comparación de cuando cuenta con el carbón disponible,

Se identificaron los parámetros más óptimos para el crecimiento de la bacteria de estudio y la

degradación del sustrato, los cuales fueron de pH neutral (7), temperatura de 35°C y a una
concentración de azul índigo de 20ppm.

Se realizó la curva de calibración ver grafica 1 (curva de calibración) a una longitud de onda de
420 Nm valor obtenido por barrido en laboratorio dado que diferentes manejan diferentes valores
de absorbancia como por ejemplo Barragan B [1] “The absorbance values of supernatants were
determined at 484 nm (wavelength of maximum absorbance for dye)”; con dicho valor se
determinó que la ecuación para determinar la concentración de sustrato en función de la
absorbancia optenida de cada muestra, la cual es: 𝑐 = −8.81144065 + 303.5652991(𝐴𝑏𝑠)

Donde C: concentración de sustrato y Abs : absorbancia obtenida del espectrofotómetro en Nm.

3
 Se pudo determinar el
Curva de Calibración comportamiento del crecimiento de
los organismos en número de células
0.3
y la degradación de sustrato a lo largo
0.25
R² = 0,9985 del tiempo de experimentación ver
Absorbancia

0.2 tabla 1(resultados.), con lo cual se

0.15 generó una curva de comparación
entre la cinética de crecimiento y la
0.1
degradación de sustrato, ver Grafica
0.05 Absorbancia 2. (Crecimiento Microbiano vs
0 (Nm) Concentración sustrato). Sin embargo
0 50 100 se cometió un error experimental,
Concentración
dado que el estudio durante las 6
horas no se realizó separación del
Grafica 1 – Curva de calibración medio con la biomasa a través de
centrifugación, por lo tanto el crecimiento de microorganismos interfirió con la lectura, dado que
estos aportaron turbiedad, por tal motivo los valores presentaron aumento cosa que es inviable,
por que representaría un aumento de
colorante en el medio, por tal motivo estos Conteo ( N# Celulas) Concentración (ppm)
Tiempo (h)
dos últimos datos no fueron incluidos en el
análisis del estudio, sin embargo en la 0 4250000 20
gráfica 3( supuesto de degradación) se 1 3750000 20
plantea una posible forma de 2 4950000 18,8
comportamiento polinómica (grado3) de la 3 7680000 18,83
degradación durante 48 horas, llegando a 4 14700000 18,2
degradar 5. 52 ppm. Cabe resaltar que 5 13500000 --
entre los parámetros analizados el único 6 16000000 --
que presento un cambio fue el de pH, que Taba 1-Resultados

Disminuyo 0.2 unidades entre la hora 4-5, dato que indica que se generó mayor actividad
microbiana, y que se evidencia en el los resultados dado que es en la cuarta hora donde se
presenta mayor pendiente en la curva de crecimiento ( fase exponencial).

Crecimiento Microbiano vs Concentración sustrato

20000000 20.5
Concentración

20
15000000 19.5
N# Celulas

19
10000000
18.5

5000000 18
17.5 Conteo ( N# Celulas)
0 17
0 1 2 3 4 5 6
N# de horas

Grafica 2 – Crecimiento Microbiano vs Concentración de sustrato .

4
 25
Supuesto de
20

Concentración
15
Concentración (ppm)
10
Poly. (Concentración (ppm))
5

0
0 1 2 3 4 12 24 36 48
numero de Horas

Grafica 3- supuesto de degradación

Conclusiones

Se evidencio degradación de azul índigo a partir de la actividad metabolica de la pseudomona

putida, en un estimado de 2 ppm en 4 horas y de 5 ppm en 48 horas.

Bibliografía
[1] Barragan, B. Costa, C., Marquez, C. M. 2007. Biodegradation of azo dyes by bacteria inoculated on solid
media. Dyes and Pigments 75: 73-81.

[2] Bragger, J. L. A.W. Lloyd and S.H. Soozandehfar, 1997, Investigation on the azo reducing activity of a
common colonic microorganisms. International Journal of Pharmacy, 157:61-71.

[3] Castells X, 2000. Reciclaje de los residuos industriales, efectos crónicos de los colorantes azoicos,
Editorial Diaz de Santos, Madrid; España, pp 502-503

[4] Silveira, E. P.P. Marques and S.S. Silva, 2011. Selection of Pseudomonas for industrial textile dyes
decolourization. International Biodegradation and Biodeterioration, 63: 230-235.

[5] Ghasemi, F., Tabande, F., Bambai, B., Sambasiva, R. 2010. Decolorization of different azo dyes by
Phanerochaete chrysosporium RP78 under optimal condition. Int. J. Environ. Sci. Tech.

[6] Nelson K.E. et al., "Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile
Pseudomonas putida KT2440", Environ Microbiol 2002, 4:799-808.

5
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